一、神经酰胺糖基化与肿瘤的多药耐药性（论文文献综述）
曹琳[1]（2021）在《平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究》文中指出乳腺癌是发病率最高的女性常见肿瘤,具有高度异质性,乳腺癌细胞分泌的小胞外囊泡（Small extracellular vesicle,sEV）是肿瘤微环境的重要组成成分,通过传递其携带的生物活性分子,可以促进乳腺肿瘤的远处转移和恶性进展,以及对化疗药物的耐受性。平分型GlcNAc是一种重要的N-糖基化修饰,在多种癌症的发生发展过程中异常表达,参与调控肿瘤细胞粘附及增殖等。本文针对平分型GlcNAc修饰调控乳腺癌细胞来源sEV的生物学功能,及其调控乳腺癌细胞耐药性的机制展开研究,以阐明平分型GlcNAc在乳腺癌发展以及耐药过程中的作用。首先,为了明确平分型GlcNAc及其对应糖基转移酶MGAT3在乳腺癌发展中的生物学功能,在乳腺癌细胞中过表达MGAT3或用毛喉素处理,增加细胞内平分型GlcNAc水平,发现细胞增殖、迁移及克隆形成能力降低,而细胞凋亡增加;小鼠体内实验发现,高表达平分型GlcNAc的乳腺癌细胞由尾静脉向肺部远距离迁移的能力下降。说明高平分型GlcNAc修饰对乳腺癌细胞的恶性表型尤其是迁移能力有一定抑制作用。随后,本研究发现高迁移性乳腺癌细胞MDA-MB-231来源的sEV能够促进低迁移性乳腺癌细胞MCF7的迁移能力,而供体细胞中平分型GlcNAc修饰水平的提高抑制了其分泌的sEV对受体细胞的促迁移功能。通过糖肽质谱以及免疫沉淀等技术,鉴定到乳腺癌细胞中整合蛋白β1（Integrinβ1）具有平分型GlcNAc修饰,且sEV也含有integrinβ1。受体细胞能够摄入sEV中的β1。当sEV中β1的平分型GlcNAc水平较低时,β1能够与受体细胞中的galectin 3相互作用启动下游FAK/AKT信号通路,促进细胞迁移,而高平分型GlcNAc修饰抑制了β1与galectin 3的结合,进而抑制下游信号通路的激活及sEV的促迁移功能;提取乳腺癌患者血浆中的sEV处理MCF7细胞,同样发现高平分型GlcNAc修饰,抑制了sEV对MCF7细胞的促迁移功能;小鼠体内实验证明,注射高平分型GlcNAc修饰的sEV组小鼠,MCF7细胞向肺部迁移数量及肺部肿瘤结节明显下降;以上结果说明高平分型GlcNAc修饰能够抑制sEV对MCF7细胞促迁移作用,这种调控是通过β1介导的。结合TCGA数据库分析发现β1上平分型GlcNAc修饰水平更高的病人,其生存期更长。最后,本文探究了平分型GlcNAc对乳腺癌细胞耐药的影响。化疗药物处理能够增加MGAT3的泛素化修饰并加速其通过蛋白酶体途径降解,进而降低乳腺癌细胞中MGAT3的表达和平分型GlcNAc的含量;高平分型GlcNAc修饰的乳腺癌细胞对化疗药物更加敏感。与耐药细胞MCF7/Adr相比,过表达MGAT3的耐药细胞（7/AdrM3）排出药物的速度减慢;进一步探究平分型GlcNAc修饰调控药物外排的分子机制,发现药物转运蛋白-P-糖蛋白（P-gp）带有平分型GlcNAc修饰,7/Adr-M3细胞中以及细胞膜上的P-gp含量呈下降趋势,平分型GlcNAc修饰促进P-gp从细胞膜进入胞质内,发生降解,进而导致细胞排出药物的速度减慢,耐药性降低。平分型GlcNAc通过影响P-gp的定位及表达调控细胞的药物耐受性。综上,本文得到以下结论:平分型GlcNAc可以通过修饰integrinβ1调控sEV的促迁移功能,抑制乳腺癌细胞的恶性表型,高平分型GlcNAc修饰能够降低由P-gp介导的乳腺癌细胞耐药性。本研究为临床治疗迁移性乳腺癌提供了新的治疗靶点,并为克服P-gp介导的乳腺癌细胞耐药提供除小分子拮抗剂之外的治疗策略。
袁亚琴[2]（2016）在《β3GnT8催化多聚乳糖胺链对白血病细胞K562/乳腺癌细胞MCF-7耐药机制的相关研究》文中认为目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）——SAHA是一类治疗血液恶性肿瘤的新型靶向抗肿瘤药物,但随着药物使用时间的延长及受试人群的增多,对SAHA的耐药不可避免的出现了,多药耐药性目前仍然是临床上治疗恶性血液病的一大障碍。为了探究β3GnT8催化合成的多聚乳糖胺链与白血病细胞SAHA耐药性的相关性从而寻找到新的治疗靶点,本文通过筛选耐药细胞株K562/SAHA,检测多聚乳糖胺和β3GnT8在耐药株K562/SAHA与K562细胞中表达水平差异;并通过si-RNA干扰β3GnT8后,检测耐药细胞株中多聚乳糖胺链的表达情况、细胞凋亡和细胞周期的变化情况以及耐药细胞株的药物敏感性的变化,初步探讨多聚乳糖胺N-聚糖与白血病细胞耐药性的关系。本文还研究了中药雷公藤甲素对乳腺癌耐药株MCF-7/Adr的侵袭迁移能力影响的作用机制。方法（1）抗肿瘤药物SAHA处理K562细胞后,通过Western blot检测糖基转移酶β3GnT8、β3GnT2以及糖蛋白CD147在蛋白水平的表达变化;流式细胞术和Lectin blot分别检测K562细胞表面及细胞总的多聚乳糖胺链的表达变化。（2）MTT药物敏感性实验测得SAHA对K562细胞的半数致死率（IC50）,利用逐步递增浓度间歇作用法筛选耐药细胞株K562/SAHA。（3）Real-time PCR检测K562和K562/SAHA中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、β3GnTs、ppGalNAcTs、MMPs和末端唾液酸等基因的mRNA水平表达差异;Western blot检测K562和K562/SAHA中肿瘤干细胞标志物CD133、β3GnT8和CD147蛋白表达差异;流式细胞术检测两株细胞的早期凋亡情况差异;流式细胞术和Lectin blot分别检测两株细胞的细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺的表达情况。（4）siRNA干扰K562/SAHA中β3GnT8后,通过流式细胞术和Lectin blot分别检测细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺的表达变化;流式细胞术检测K562/SAHA早期凋亡和周期的变化;MTT检测K562/SAHA药物敏感性变化。（5）用一定浓度梯度的中药雷公藤甲素处理乳腺癌耐阿霉素耐药细胞株mcf-7/adr,mtt检测mcf-7/adr对雷公藤甲素的药物敏感性;hoechst33258凋亡小体染色法检测细胞凋亡情况;流式细胞术和lectinblot分别检测细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺链的表达变化;real-timepcr和westernblot分别检测细胞中β3gnt8、β3gnt2、cd147和mmp14的mrna和蛋白表达变化;transwell检测耐药细胞株侵袭迁移能力的改变。结果（1）saha处理k562细胞后,β3gnt8、β3gnt2和cd147蛋白水平表达降低,细胞总的多聚乳糖胺链表达下降,且具有时间依赖性。（2）筛选获得耐药细胞株k562/saha,耐药指数ri为14.74,k562/saha中p-gp基因mrna表达水平以及肿瘤干细胞标志物cd133蛋白水平均明显高于k562细胞,上述结果表明成功筛选出耐药细胞株。（3）β3gnt8的mrna和蛋白在k562/saha细胞中的表达均显着高于k562细胞;流式细胞术和lectinblot结果显示多聚乳糖胺链在k562/saha细胞中表达水平明显高于k562细胞;高糖基化cd147在耐药细胞株中的蛋白表达显着增高。（4）sirna干扰k562/saha中β3gnt8基因后,细胞中多聚乳糖胺表达量降低;细胞早期凋亡率显着上升;细胞周期多停滞在g1/s期;耐药细胞株对saha药物敏感性显着提高。（5）雷公藤甲素处理耐药细胞株mcf-7/adr,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率显着提升;细胞表面的多聚乳糖胺链表达下降;β3gnt8的基因和蛋白表达均下降,mmp14基因表达下降;耐药细胞株的侵袭迁移能力明显减弱。结论（1）耐药细胞株k562/saha高表达多聚乳糖胺和糖基转移酶β3gnt8,细胞对药物saha的敏感性显着降低;当干扰了k562/saha中的β3gnt8后,细胞中多聚乳糖胺表达下调,细胞凋亡率显着上升,细胞周期阻滞,且细胞药物敏感性显着升高。由此推测β3gnt8的高表达导致k562细胞异常糖基化,进而形成k562/saha的耐药性;干扰耐药细胞株k562/saha中的β3gnt8可以逆转耐药性。（2）雷公藤甲素可能通过抑制β3gnt8等糖基转移酶基因的转录,阻止多聚乳糖胺的合成,从而影响cd147的糖基化修饰,进而导致cd147对mmps的调节发生改变,最终减弱肿瘤细胞的侵袭迁移能力。
高利平[3]（2014）在《多聚乳糖胺型N-聚糖与结肠癌细胞株SW620耐药性的关系探讨》文中指出目的5-氟尿嘧啶（5-FU）是临床治疗结肠癌的最常用药物之一。本文在5-FU处理结肠癌细胞SW620后，分析多聚乳糖胺链的表达水平变化；并检测合成多聚乳糖胺链的糖基转移酶β3GnT8基因和蛋白水平的表达变化。同时为了进一步阐明多聚乳糖胺链及糖基转移酶β3GnT8与结肠癌细胞5-FU耐药性的相关性，以耐药细胞株SW620/5-FU为研究对象，检测耐药细胞株中多聚乳糖胺链和糖基转移酶β3GnT8的表达水平，初步探讨多聚乳糖胺链及糖基转移酶β3GnT8与结肠癌细胞耐药性的关系。方法（1）MTT药物敏感实验来测定5-FU处理SW620细胞后细胞的半数致死率（IC50）；Hochest33258试剂盒和流式细胞术检测5-FU处理SW620细胞后细胞凋亡程度变化；流式细胞术检测5-FU处理SW620细胞后细胞周期变化；流式细胞术和Lectin-blot分别检测5-FU处理SW620细胞后细胞表面及细胞内多聚乳糖胺链的表达变化；碱性磷酸酶试剂盒ALP/AKP检测5-FU处理SW620细胞后细胞分化指标碱性磷酸酶（ALP/AKP）的活性变化；Western-blot检测糖基转移酶β3GnT8和CD147在蛋白水平的表达情况。（2）利用逐步递增浓度间歇作用法筛选耐药细胞株SW620/5-FU；MTT药物敏感实验测定耐药细胞株SW620/5-FU的耐药指数；Real-time PCR检测耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）基因的mRNA水平表达；Western-blot检测耐药细胞株SW620/5-FU和SW620中肿瘤干细胞标志物CD133蛋白表达；Hoechst33258试剂盒和流式细胞术检测两株细胞的凋亡情况；Real-time PCR和Western-blot分别检测耐药细胞株SW620/5-FU及SW620中β3GnT8的mRNA和蛋白水平表达；流式细胞术和Lectin-blot分别检测两株细胞的细胞表面和细胞内多聚乳糖胺的表达。结果（1）5-FU处理SW620细胞后，细胞的凋亡程度升高，细胞周期主要抑制在S期，细胞表面及细胞内全部多聚乳糖胺链的表达均降低，且有时间依赖性，细胞分化程度升高；5-FU处理SW620细胞后，Western-blot检测β3GnT8和CD147的蛋白水平表达变化，结果表明两者表达均有显着增加。（2）筛选得到耐药细胞株SW620/5-FU，耐药指数RI为7.62。其P-gp基因mRNA表达水平明显高于SW620细胞；两种细胞中肿瘤干细胞标志物CD133蛋白水平表达变化不大，无统计学意义；SW620细胞凋亡水平高于SW620/5-FU细胞；以上结果均表明耐药细胞株筛选成功。β3GnT8的基因和蛋白水平表达在两株细胞中差异显着，其在SW620/5-FU细胞中表达明显高于SW620细胞；流式细胞术和Lectin-blot检测两种细胞中细胞表面和细胞内的多聚乳糖胺链的表达，结果显示多聚乳糖胺链在SW620/5-FU细胞中表达水平明显高于SW620细胞。结论（1）5-FU能够促进SW620细胞的凋亡，将细胞周期主要抑制在S期；5-FU能够抑制多聚乳糖胺链的表达，同时也抑制了糖基转移酶β3GnT8和细胞表面糖蛋白CD147的蛋白水平表达。推测5-FU处理SW620细胞后，因其抑制了β3GnT8的蛋白表达而影响多聚乳糖胺链的合成，细胞凋亡水平也进而增强，同时降低了CD147的表达。（2）筛选得到的5-FU耐药细胞株SW620/5-FU高表达P-gp，SW620/5-FU细胞表面及细胞内多聚乳糖胺链表达水平均高于SW620细胞，β3GnT8基因和蛋白水平表达也高于SW620细胞，而细胞凋亡水平低于后者。两细胞凋亡程度不同及多聚乳糖胺链表达差异的原因可能是由于合成多聚乳糖胺链的糖基转移酶β3GnT8的表达变化引起，进而推测β3GnT8可能促进肿瘤细胞产生耐药性。
王佐正,罗永云,宋建军,赵琳[4]（2013）在《糖基化神经酰胺合成酶和多药耐药相关蛋白在胰腺癌中的表达及其临床意义》文中研究说明目的探讨糖基化神经酰胺合成酶（GCS）及多药耐药相关蛋白（MRP）在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测GCS、MRP在10例正常胰腺和胰腺炎及30例胰腺癌组织中的表达情况,并结合临床病理学特征进行研究。结果 GCS在胰腺癌组织中的阳性表达率为60%,在正常胰腺及胰腺炎组织中的阳性表达率为10%,胰腺癌GCS的阳性表达率显着高于正常胰腺和胰腺炎组织中的表达（P<0.05）;MRP在胰腺癌中的阳性表达率为53.33%,在正常胰腺和胰腺炎中阳性表达率为10%,MRP在胰腺癌的阳性表达率显着高于在正常胰腺和胰腺炎组织中的表达（P<0.05）。GCS、MRP的表达与性别、年龄、原发肿瘤的位置、肿瘤的分化程度、肿瘤是否有侵袭性、是否有淋巴结转移以及肿瘤的分期之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 GCS、MRP在胰腺癌的多药耐药性中可能占有重要地位。其介导的耐药机制各不相同,临床检测GCS、MRP对胰腺癌化疗方案的制定具有重要的指导意义。
田彦璋[5]（2011）在《葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究》文中提出研究背景：肝细胞性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康和生命,全球约半数的肝癌患者集中在中国。我国每年约有11万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死率的第二位。其起病隐匿、早期诊断难,且侵袭性强、复发转移率高,因此预后较差。在肝癌的综合治疗中,化疗是其重要治疗手段之一,但多药耐药的发生常导致化疗失败。肿瘤多药耐药（MDR）是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药后,该肿瘤对其他结构无关、机制相异的多种抗肿瘤药物也具有耐药性。MDR的形成是肿瘤免受化疗药物攻击的细胞防御机制,也是肿瘤化疗失败的主要原因。近年来神经酰胺途径在多药耐药中的作用逐渐引起了人们的关注。神经酰胺作为第二信使参与调节细胞的凋亡。细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）是一种葡萄糖基转移酶,参与神经酰胺的代谢,可催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）上的葡萄糖基与神经酰胺结合,使神经酰胺糖基化成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺（GlcCer）,从而降低了细胞内神经酰胺的含量,使细胞逃避神经酰胺介导的细胞凋亡作用,导致多药耐药的发生。GlcCer可被一系列糖基转移酶修饰,合成更高形式的鞘糖脂,这些鞘糖脂与肿瘤细胞的生物学行为密切相关,不仅维持着细胞的正常结构功能,还参与细胞增殖、分化、免疫识别和信号转导等,可以对抗药物诱导的细胞凋亡,亦使肿瘤细胞发生多药耐药。目前,国内外研究者对于GCS参与肿瘤耐药的研究主要集中在乳腺癌、白血病、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤以及表皮样癌等恶性肿瘤,对于其在肝癌细胞多药耐药中作用机制尚无研究报道,GCS参与肿瘤细胞多药耐药的作用机制尚未完全清楚。在多药耐药逆转方面,已发现的一些耐药逆转剂在临床应用中特异性不高、毒副作用严重,其临床应用受到限制；目前的基因治疗也存在特异性不强、效率不高、临床应用困难等缺点。因此,寻找高效、低毒的耐药抑制剂成为目前研究的热点。研究目的：本研究旨在通过基因转染技术使肝癌细胞HepG2内GCS高表达,观察细胞耐药性的变化情况,明确GCS是否参与了肝癌的多药耐药；观察高表达GCS基因的细胞株HepG2/GCS内多药耐药基因MDR1的表达情况,明确GCS与MDR1在肝癌多药耐药中是否具有相关性,进一步探讨GCS在肝癌多药耐药中的作用机制；运用黄芪甲苷进行逆转耐药的研究,观察其对肝癌细胞多药耐药的逆转效果,探讨其可能的机制。研究方法：1.构建GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,经G418筛选后建立稳定表达的肝癌细胞模型HepG2/GCS,以空载体转染细胞HepG2/pEGFP作为阴性对照；2.应用RT-PCR和WesternBlot法检测基因转染后HepG2细胞内GCS mRNA和GCS蛋白的表达；3.流式细胞仪检测基因转染后HepG2细胞在5-Fu作用下的凋亡情况；4.分别应用RT-PCR和WesternBlot法检测HepG2/GCS细胞内MDR1mRNA和P-gp的表达；5.通过MTT比色法检测HepG2细胞和HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性,计算IC50；6.以MTT比色法检测黄芪甲苷的细胞毒性,及其对HepG2/GCS细胞药物敏感性的影响；7.应用Hoechst 33258染色检测黄芪甲苷联合阿霉素对HepG2/GCS细胞凋亡的影响；8.Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白和P-gp表达的影响及黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响；9.使用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差（x±s）表示,组间均数比较采用t检验,P<0.05表示有统计学意义。结果：1.成功构建了GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,应用G418抗生素筛选出稳定表达的细胞株HepG2/GCS;2. RT-PCR与WesternBlot结果表明,基因转染细胞HepG2/GCS的GCS mRNA的相对表达量为2.42±0.13,较HepG2/pEGFP细胞0.34±0.02和HepG2细胞0.41±0.03明显增加（P<0.05）,HepG2/GCS细胞内GCS蛋白表达量为HepG2细胞的4.8倍,差异具有统计学意义（P<0.05）,证明高表达GCS基因肝癌细胞株HepG2/GCS构建成功；3.流式细胞仪检测结果表明,经终浓度为200μg/ml的5-Fu作用后,HepG2/GCS细胞的凋亡峰明显低于正常细胞,HepG2/GCS细胞的凋亡率明显低于HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞（P<0.05）；4.基因转染细胞株HepG2/GCS的GCS mRNA、MDR1 mRNA表达较HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞均明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）,HepG2/GCS细胞内GCS蛋白和P-gp表达量分别为HepG2细胞的4.8倍、1.55倍,差异具有统计学意义（P<0.05）；5.MTT法检测结果显示,阿霉素对HepG2/GCS细胞和HepG2细胞的ICso值分别为（11.6±1.05）μg/ml和I（6.2±0.35）μg/ml,两者比较差异有统计学意义（P<0.05）,耐药倍数为1.87；其对HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞的作用则无明显差异（P>0.05）；6.细胞毒性检测结果显示黄芪甲苷对HepG2/GCS细胞无明显毒性,经终浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性增强,其IC50值为（7.7±0.24）μg/ml,较未作用组HepG2/GCS细胞（11.6±1.05）μg/ml明显降低（P<0.05）,逆转倍数为1.50；7. Hoechst 33258染色结果显示：经黄芪甲苷处理后,HepG2/GCS细胞对阿霉素敏感性增强,在阿霉素作用下,HepG2/GCS细胞发生凋亡、坏死,许多细胞脱离贴壁,无法观察到,而残余细胞大部分呈现出典型的凋亡形态；8. Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白表达的影响,结果显示经浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞内GCS蛋白量为1.05±0.09,较作用前1.71±0.2明显下降（P<0.05）,而细胞内P-gp的表达无明显变化；9. Western blot检测黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响,结果显示：联合使用黄芪甲营和ADM后,HepG2/GCS细胞内Caspase-3的含量上升为1.98±0.13,与单用ADM组1.17±0.15比较有显着差异（P<0.05）。结论：1、高表达GCS可以使肝癌细胞HepG2对化疗药物5一Fu、阿霉素的药物敏感性降低,提示GCS参与介导了肝痛细胞HepG2的多药耐药。2、在高表达GCS基因的耐药肝癌细胞株HepG2/GCS内,多药耐药相关基因MDR1表达上调,提示在肝癌细胞多药耐药过程中,GCS基因与MDR1基因具有『E相关性,这可能是GCS参与肝癌多药耐药的机制之3、黄芪甲苷可以提高耐药肝癌细胞株HepG2/GCS对阿霉素的敏感性,其机制可能是下调GCS的表达,激活caspases凋亡级联通路而增强了阿霉素诱导细胞凋亡的作用。实验表明,黄芪甲苷是一个低毒、有效的耐药逆转剂,有望进一步应用于临床研究。
杜梅,李慧慧[6]（2009）在《米非司酮和白血病多药耐药》文中提出
胡萍萍[7]（2008）在《葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义》文中指出目的:研究葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）基因在人乳腺癌细胞株MCF-7和人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义;探讨GCS与P-糖蛋白表达水平以及功能之间的关系。方法:采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测多柔比星对MCF-7/ADR、MCF-7的抑制率和IC50,用浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的GCS抑制剂D,L-threo-1-phenyl-2-decanoyl-amino-3-morpholino-1 -propanol （PDMP）预处理MCF-7/ADR 24h、48h后检测多柔比星对其抑制率和IC50;运用流式细胞检测术（FCM）检测MCF-7及PDMP处理前后MCF-7/ADR细胞中P-gp、GCS蛋白的表达水平;运用FCM检测不同浓度的PDMP预处理MCF-7/ADR 48h后,细胞内多柔比星的潴留量并拍摄荧光照片;应用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应（Real time RT-PCR）检测MCF-7以及PDMP作用前后MCF-7/ADR细胞中GCS mRNA的表达水平。结果:MCF-7/ADR对MCF-7的耐药倍数为22.69倍,PDMP预处理后多柔比星对MCF-7/ADR的抑制率升高,IC50下降（P<0.05）;MCF-7/ADR中GCS和P-gp的表达水平均高于MCF-7（P<0.001）,PDMP使MCF-7/ADR中GCS蛋白和mRNA表达水平均下降（P<0.05）,对P-gp蛋白表达水平无明显影响（P>0.05）。FCM定量检测及荧光照片定性检测显示,不同浓度的PDMP预处理MCF-7/ADR 48h后,可使多柔比星在其内潴留量不同程度增多。结论:GCS可能参与恶性肿瘤耐药的发生过程,并在MCF-7/ADR多药耐药中起重要作用,在多药耐药表型中GCS与P-gp有一定关系;PDMP不影响P-gp蛋白的表达水平,但能影响其功能,PDMP能比较有效的逆转人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR对多柔比星的耐药性。
施媛萍,谢平,谢可鸣,葛素梅,张滨,穆会君,沈云峰[8]（2007）在《葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系》文中进行了进一步梳理目的观察葡萄糖神经酰胺合酶（GCS）基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性（MDR）的关系。方法运用Alamar BlueTM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果（1）阿霉素（ADR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱（VCR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。（2）K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。
张艳[9]（2007）在《葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究》文中认为胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康与生命，在其综合治疗中，化疗仍然占重要地位，许多因素可以影响化疗的效果，其中肿瘤的多药耐药（multidrug resistance，MDR）是化疗失败的主要原因之一。研究产生MDR现象的机制及克服的方法已成为肿瘤研究的重要课题。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其它结构不同、作用靶位各异的抗肿瘤药物也产生耐药性。以往已知MDR的相关机制很多，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、热休克蛋白、肺耐药蛋白（LRP）的高表达，谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽升高，拓扑异构酶活力降低，凋亡抑制以及肿瘤细胞某些生化特征的改变等。新近又发现葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）高表达与肿瘤MDR密切相关。GCS是一种葡萄糖转移酶，参与神经酰胺的代谢，可催化UDP-glucose上的糖基转运到神经酰胺生成葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide，GlcCer），使细胞逃避神经酰胺介导的凋亡作用而产生MDR。神经酰胺是鞘脂类代谢的主要分子，在诱导细胞凋亡中起着重要作用，是介导细胞凋亡的第二信使，它在多种信号转导过程中发挥广泛的作用，其糖基化代谢产物GlcCer是细胞合成其他鞘糖脂的前体物质，它与肿瘤细胞的生物学行为密切相关，不仅维持着细胞的正常结构功能，还参与了细胞增殖、分化及肿瘤细胞的多药耐药。GCS为神经酰胺糖基化的限速酶，具有底物特异性，对MDR的产生有重要作用。抑制GCS延缓神经酰胺糖基化，增加细胞内神经酰胺的含量已成为逆转MDR的有效策略。近期也发现了一些能抑制GCS的药物，但这些药物在临床应用中特异性不高，毒副作用严重，难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，并且肿瘤细胞也可以对这些药物产生耐药，其临床应用受到限制。虽然反义核酸技术也可逆转肿瘤MDR，但存在特异性不强、效率不高等缺点。因而迫切需要寻找有效的逆转肿瘤MDR的治疗策略。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA介导的转录后基因沉默技术。由于RNAi抑制的高效性和特异性，被广泛应用于基因组功能和疾病治疗的研究中。在胃癌临床治疗中MDR是困扰化疗成功的一个主要因素，虽然众多的研究者在逆转MDR方面作了大量工作，但迄今没有一种有效药物能很好的用于临床治疗。以往对胃癌MDR机理的研究多集中在多药耐药基因及P-gp等方面，对于GCS与胃癌耐药关系的研究到目前为止国内外均未见报道。为探讨GCS在胃癌多药耐药中的作用以及靶向GCS小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）对胃癌耐药的影响，本课题首先采用RT-PCR、免疫组化和免疫印迹技术联合检测了几种胃癌细胞系中GCS基因的表达，揭示GCS与胃癌的发生发展与多药耐药的关系。在此基础上，以GCS基因为靶点，采用RNA干扰技术构建3个GCS siRNA真核表达载体R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP，并将其瞬时转染入人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，比较其对GCS的干扰效果，筛选出抑制作用强的重组质粒R1-pSUPER EGFP，进而用重组质粒R1-pSUPER EGFP稳定转染SGC7901／VCR细胞，检测耐药相关基因GCS和mdr1的表达水平、凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase-3表达的改变及细胞凋亡率，并观察转染细胞生长情况和对化疗药物的敏感性，最后将稳定转染的细胞导入裸鼠体内，观察GCS siRNA对裸鼠移植瘤生长的抑制作用及对移植瘤组织细胞凋亡和耐药相关基因GCS表达的影响。通过体外和体内试验，从基因、蛋白和肿瘤细胞生物学行为等多个方面研究GCS与胃癌多药耐药的关系及GCS引起MDR产生的分子机理，并深入探讨下调GCS的表达对逆转胃癌多药耐药的作用，为今后应用靶向GCS siRNA载体作为临床增加胃癌患者化疗敏感性的手段和RNA干扰技术在胃癌临床基因治疗上的应用提供了可靠的理论依据。方法1．常规培养GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞。其中SGC7901／VCR细胞培养液中加入长春新碱（vincristine，VCR）0.5～1.0μg／ml，以维持其相应的耐药表型。于检测前撤除VCR培养2周。2．应用RT-PCR、免疫组化和Western blot的方法在mRNA水平和蛋白水平上检测GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞中的表达。3．采用四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法，检测胃癌细胞SGC7901和SGC7901／VCR对化疗药物阿霉素（ADR）、VCR、5-氟脲嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）的敏感性。4．设计合成3对针对葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）基因编码的反向重复序列，并将其定向克隆入真核表达载体pSUPER EGFP中，构建GCS siRNA真核表达载体R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP。5．将3种GCS siRNA表达载体分别体外瞬时转染人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，应用RT-PCR和Western blot方法检测3种重组质粒对转染后细胞中GCS mRNA和蛋白表达的影响，并比较其干扰效果，筛选作用强的重组质粒进行后续试验。6．用干扰效果好的重组质粒R1-pSUPER EGFP转染胃癌SGC7901／VCR细胞，并筛选扩增阳性细胞，建立稳定转染细胞系。7．应用MTT光吸收法和生长曲线检测和反映重组质粒R1-pSUPER EGFP转染后对SGC7901／VCR细胞生长的影响。8．采用RT-PCR和Western blot方法检测稳定转染重组质粒后对胃癌细胞SGC7901／VCR中GCS、mdr1mRNA和P-gp表达的影响。9．采用RT-PCR和免疫组化方法检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞中凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase-3的表达水平；应用流式细胞技术检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞凋亡情况。10．应用MTT法检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞对化疗药物ADR、VCR、5-FU和DDP的敏感性。11．将稳定转染GCS重组质粒、转染空载体和未转染空白对照细胞SGC7901／VCR分别注入裸鼠背部皮下，建立裸鼠胃癌移植瘤模型。定期观察成瘤情况，每6天测量肿瘤大小一次，绘制肿瘤生长曲线。测量肿瘤体积和重量，计算肿瘤抑制率，观察不同组裸鼠移植瘤的生长情况。12．应用HE染色的方法，观察瘤体组织结构；RT-PCR和免疫组化方法检测移植瘤组织中GCS的表达水平；TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况。13．应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据用均数±标准差（（?）±s）表示，两组均数的比较用t检验，多样本均数的比较用方差分析。计数资料计算阳性率，阳性率之间的比较采用x2检验。以α=0.05为检验水准。结果1．RT-PCR、免疫组化和Western blot结果表明GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞中均有表达。RT-PCR结果显示，GCS mRNA的相对表达量GES-1为0.23±0.01，BGC823为0.36±0.02，SGC7901为0.49±0.04，SGC7901／VCR为0.98±0.01，GES-1细胞GCS mRNA表达水平最低，耐药细胞SGC7901／VCR表达水平最高，显着高于亲本细胞SGC7901（P＜0.05）；免疫组化标本上，GCS蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，位于胞浆内，蛋白表达阳性率以耐药细胞SGC7901／VCR最高，明显高于其它细胞（P＜0.05）；Westernblot分析结果显示，各组细胞在蛋白上样量相同的条件下，GES-1细胞GCS蛋白条带显色最弱，BGC823其次，SGC7901增强，SGC7901／VCR最重。2．体外药物敏感性分析结果显示SGC7901／VCR细胞对ADR、VCR、5-FU和DDP的IC50均高于SGC7901细胞（P＜0.05）。3．酶切鉴定R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP重组质粒，结果显示双酶切后可正确释放出约285bp片段，与质粒图谱资料相符。DNA测序证实，重组质粒中插入片段的碱基组成与设计的DNA序列完全一致，表明成功构建了针对GCS基因的siRNA表达载体。4．重组质粒瞬时转染SGC7901／VCR细胞后，RT-PCR及Western blot结果显示转染3种重组质粒后SGC7901／VCR细胞中GCS表达水平的变化程度不同，其中以转染R1-pSUPER EGFP的细胞中GCS的表达水平降低最为明显，转染另外两种重组质粒的细胞中GCS的表达水平下降不明显，说明针对GCS的siRNA载体可以在真核细胞中表达，并以R1-pSUPER EGFP所表达的小干扰RNA对GCS的抑制效果最好。5．重组质粒稳定转染SGC7901／VCR细胞后，生长曲线显示转染重组质粒细胞与转染空载体和空白对照组相比，细胞生长曲线上升缓慢，细胞生长速度减慢。6．RT-PCR结果显示转染重组质粒细胞的GCS mRNA和mdr1 mRNA的相对含量明显低于转染空载体和空白对照组（P＜0.05）。Western blot检测也显示R1-pSUPER EGFP重组质粒转染能明显抑制SGC7901／VCR细胞中GCS蛋白和P-gp的表达，其抑制率分别为83.5％和74％。7．稳定转染后对凋亡相关因子检测结果显示，转染重组质粒细胞中促凋亡因子bax、caspase-3表达水平升高，抑凋亡因子bcl-2表达水平降低，与空载体组和空白对照组细胞相比，差异显着（P＜0.05）。8．流式细胞术检测结果显示转染重组质粒组细胞凋亡率（33.35±0.11％）显着高于转染空载体组（5.09±0.02％）和空白对照组（3.98±0.04％），差异有统计学意义（P＜0.05）。9．MTT检测细胞对化疗药物的敏感性结果显示，与未转染空白对照细胞和转染空载体细胞相比，转染重组质粒细胞对ADR、VCR、5-FU和DDP的IC50减小，耐药指数降低，敏感性增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。10．接种重组质粒组细胞裸鼠体内成瘤时间延迟，肿瘤体积及重量明显小于空白对照组和空载体组（P＜0.05），重组质粒组裸鼠肿瘤体积抑制率和重量抑制率分别为64.13％和63.81％。组织病理学检测显示，重组质粒组肿瘤组织坏死较多。RT-PCR和免疫组化结果显示，重组质粒组裸鼠肿瘤组织中GCS mRNA和蛋白表达水平明显降低，与空白对照组和空载体组相比，差异显着（P＜0.05）。TUNEL检测结果显示，重组质粒组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡阳性率显着高于空白对照组和空载体组（P＜0.05）。结论1．胃癌细胞中均存在GCS基因的表达，但不同的细胞GCS表达强弱程度不同。耐药细胞株中GCS mRNA和蛋白的表达水平最高，明显高于亲本敏感细胞，提示GCS参与了胃癌的发生发展过程，并与胃癌细胞的多药耐药有关。2．成功构建了3个GCS siRNA真核表达载体，其在胃癌耐药细胞中对GCS的干扰效果不同，提示重组质粒对靶基因的抑制效果与靶序列的结构和位置有关。通过试验优选出干扰效果最佳者R1-pSUPER EGFP，保证其基因沉默的特异性和高效性，为进一步探索靶向封闭GCS对胃癌细胞多药耐药的影响奠定基础。3．建立了稳定转染GCS siRNA表达载体的胃癌细胞系。GCS siRNA载体抑制GCS表达，同时可下调mdr1的表达，上调凋亡相关因子caspase-3和bax的表达，诱导耐药细胞凋亡增加，使细胞对化疗药物的敏感性增高。4．裸鼠体内GCS siRNA表达载体可特异性抑制胃癌耐药细胞移植瘤组织中GCS的表达，诱发移植瘤细胞凋亡，抑制移植瘤的生长。提示GCS siRNA表达载体可能会成为逆转胃癌细胞多药耐药和胃癌基因治疗的一种新手段，同时也为临床胃癌基因治疗提供理论依据。
施媛萍[10]（2007）在《葡萄糖神经酰胺合成酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系》文中研究表明目的:观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase ,GCS）基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2中的表达及其与肿瘤多药耐药性（multidrug resistance,MDR）的关系,并初步研究GCS基因导致白血病多药耐药的分子病理机制。方法:运用Alamar BlueTM多功能细胞染色法证实K562/AO2细胞株的多药耐药性;采用半定量RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、Bcl-2基因、Bax基因的表达水平及其差异。ELISA法检测耐药和野生细胞株中Bcl-2蛋白的表达情况及培养上清液中Caspase-3的表达水平。应用半定量RT-PCR技术检测K562/AO2细胞经不同剂量（均小于毒性剂量）苯基棕榈酰胺吗啡丙醇（PPMP）作用后GCS基因的表达水平,运用Alamar BlueTM多功能细胞染色法分析K562/AO2细胞经PPMP处理前后多药耐药性的变化。结果:1.证实了K562/AO2细胞的多药耐药性;2. K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;3. K562/AO2细胞抑凋亡基因Bcl-2基因的表达强于K562细胞,而促凋亡基因Bax基因的表达则弱于K562细胞;4. K562/AO2细胞株的Bcl-2蛋白表达水平高于K562细胞株﹙P<0.01﹚;K562/AO2细胞株的Caspase-3表达水平低于K562细胞株﹙P<0.05﹚;5. 2.5μmol/L～25μmol/L的PPMP均可抑制K562/AO2细胞GCS基因的表达,25μmol/L时的抑制强度最大;6. K562/AO2细胞经25μmol/L PPMP处理后,多药耐药性被明显逆转。结论:GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要作用,PPMP通过抑制GCS活性从而对K562/AO2细胞的多药耐药性起到了调控和部分逆转作用。细胞凋亡基因的表达异常可能是GCS导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。
二、神经酰胺糖基化与肿瘤的多药耐药性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经酰胺糖基化与肿瘤的多药耐药性（论文提纲范文）
（1）平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌概述 |
| 1.2 平分型GlcNAc糖基化修饰概述 |
| 1.3 整合蛋白β1 |
| 1.4 细胞外囊泡 |
| 1.5 小细胞外囊泡 |
| 1.5.1 sEV的形成 |
| 1.5.2 sEV与肿瘤微环境 |
| 1.5.3 sEV与肿瘤的多药耐药性 |
| 1.6 癌症与多药耐药性 |
| 1.6.1 多药耐药性概述 |
| 1.6.2 药物转运蛋白 |
| 1.6.3 细胞迁移与细胞耐药 |
| 1.6.4 DNA修复机制与细胞耐药 |
| 1.6.5 肿瘤微环境与细胞耐药 |
| 1.6.6 糖基化修饰与细胞耐药 |
| 1.7 研究内容及意义 |
| 第二章 平分型 GlcNAc水平影响乳腺癌细胞表型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 细胞冻存 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 逆转录-聚合酶链式反应 |
| 2.3.6 MGAT3 过表达质粒构建 |
| 2.3.7 慢病毒转染 |
| 2.3.8 细胞裂解及蛋白提取 |
| 2.3.9 免疫印迹/凝集素印记 |
| 2.3.10 免疫荧光染色 |
| 2.3.11 Transwell检测细胞迁移 |
| 2.3.12 划痕检测细胞迁移 |
| 2.3.13 细胞凋亡检测 |
| 2.3.14 克隆形成能力检测 |
| 2.3.15 小鼠体内乳腺癌细胞肺迁移实验 |
| 2.3.16 人乳腺癌组织芯片免疫染色 |
| 2.3.17 小鼠肿瘤组织切片苏木精/伊红染色 |
| 2.3.18 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 乳腺癌细胞过表达MGAT3 的验证 |
| 2.4.2 过表达MGAT3 对细胞表型的影响 |
| 2.4.3 过表达MGAT3 对细胞迁移能力的影响 |
| 2.4.4 过表达MGAT3 对乳腺癌细胞肺迁移能力研究 |
| 2.4.5 MGAT3 及平分型GlcNAc水平影响乳腺癌病人生存期 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 第三章 sEV影响受体细胞迁移能力 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 无sEV血清的制备 |
| 3.3.3 供体细胞条件培养基的提取 |
| 3.3.4 Transwell细胞迁移能力检测 |
| 3.3.5 划痕检测细胞迁移 |
| 3.3.6 细胞凋亡检测 |
| 3.3.7 细胞裂解及蛋白提取 |
| 3.3.8 免疫印迹/凝集素印记 |
| 3.3.9 细胞共培养模型 |
| 3.3.10 Edu方法检测细胞增殖 |
| 3.3.11 sEV提取 |
| 3.3.12 密度梯度离心 |
| 3.3.13 透射电镜样品制备 |
| 3.3.14 免疫电镜样品制备 |
| 3.3.15 纳米颗粒粒径分析 |
| 3.3.16 琥珀酰亚胺酯染色s EV |
| 3.3.17 免疫荧光染色检测受体细胞摄入s EV |
| 3.3.18 流式检测受体细胞摄入s EV |
| 3.3.19 克隆形成能力检测 |
| 3.3.20 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 供体细胞的条件培养基影响受体细胞表型 |
| 3.4.2 共培养模型供体细胞分泌物对受体细胞的表型影响 |
| 3.4.3 sEV影响受体细胞迁移能力 |
| 3.4.4 sEV的表征 |
| 3.4.5 受体细胞对sEV的摄入 |
| 3.4.6 sEV中平分型GlcNAC水平的检测 |
| 3.4.7 不同来源sEV对受体细胞表型的影响 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第四章 sEV中整合蛋白β1 的平分型GlcNAc修饰影响受体细胞迁移的机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试剂配制方法 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞裂解及蛋白提取 |
| 4.3.3 免疫印迹/凝集素印记 |
| 4.3.4 病人血浆sEV提取 |
| 4.3.5 带有平分型GlcNAc修饰的蛋白质谱鉴定 |
| 4.3.6 免疫沉淀和免疫共沉淀 |
| 4.3.7 密度梯度离心 |
| 4.3.8 免疫电镜样品制备 |
| 4.3.9 NHS-biotin标记s EV |
| 4.3.10 流式检测受体细胞膜表面的integrinβ1 |
| 4.3.11 磷酸激酶阵列分析 |
| 4.3.12 蔗糖和乳糖处理 |
| 4.3.13 细胞迁移能力检测 |
| 4.3.14 小鼠乳腺癌细胞肺迁移能力检测 |
| 4.3.15 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 平分型GlcNAc修饰的糖肽质谱鉴定 |
| 4.4.2 质谱鉴定到的糖蛋白功能分析 |
| 4.4.3 平分型GlcNAc修饰的integrinβ1 的鉴定 |
| 4.4.4 sEV中 integrinβ1 的检测 |
| 4.4.5 sEV中 integrinβ1 的平分型GlcNAc修饰水平检测 |
| 4.4.6 Integrinβ1 通过s EV进入受体细胞 |
| 4.4.7 Integrinβ1 启动受体细胞中FAK信号通路 |
| 4.4.8 Integrinβ1 的平分型GlcNAc修饰水平影响受体细胞的迁移能力 |
| 4.4.9 乳腺癌病人血浆sEV对 MCF7 细胞迁移能力的影响 |
| 4.4.10 sEV影响乳腺癌细胞肺转移能力 |
| 4.4.11 数据库分析MGAT3和integrinβ1 水平与乳腺癌病人生存期的关系 |
| 4.5 本章小结与讨论 |
| 第五章 平分型GlcNAc修饰影响乳腺癌细胞化疗耐药性的机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养及耐药细胞株诱导 |
| 5.3.2 质粒构建 |
| 5.3.3 细胞裂解及蛋白提取 |
| 5.3.4 免疫印迹/凝集素印记 |
| 5.3.5 免疫荧光检测平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.6 流式检测细胞表面平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.7 酶联免疫吸附法检测乳腺癌病人血浆中平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.8 细胞活力检测 |
| 5.3.9 流式检测细胞凋亡 |
| 5.3.10 RNA提取和反转录RCR |
| 5.3.11 RT-PCR检测细胞内MGAT3和P-gp的 mRNA表达 |
| 5.3.12 免疫沉淀-质谱检测 |
| 5.3.13 免疫沉淀和免疫共沉淀 |
| 5.3.14 NHS-biotin标记膜蛋白 |
| 5.3.15 数据分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 化疗药物处理降低细胞内MGAT3 和平分型GlcNAc的水平 |
| 5.4.2 耐药细胞和耐药病人血清中的平分型GlcNAc水平下调 |
| 5.4.3 提高平分型GlcNAc修饰降低细胞的药物耐受性 |
| 5.4.4 过表达MGAT3 细胞药物耐受性下降 |
| 5.4.5 化疗药物处理不改变MGAT3-mRNA水平 |
| 5.4.6 化疗药物处理导致MGAT3 通过蛋白酶体途径降解 |
| 5.4.7 平分型GlcNAc修饰水平影响P-gp在细胞内的含量 |
| 5.4.8 P-gp带有平分型GlcNAc修饰 |
| 5.4.9 平分型GlcNAc修饰水平导致细胞膜表面P-gp的含量差异 |
| 5.4.10 高平分型GlcNAc修饰的P-gp通过多种途径发生降解 |
| 5.4.11 平分型GlcNAc通过P-gp影响细胞耐药性 |
| 5.5 本章小结与讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）β3GnT8催化多聚乳糖胺链对白血病细胞K562/乳腺癌细胞MCF-7耐药机制的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 β3GnT8催化多聚乳糖胺链对白血病细胞K562耐药机制的相关研究..131. 材料和方法 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雷公藤甲素通过抑制多聚乳糖胺链的合成而减弱耐药细胞株MCF-7/Adr的侵袭迁移能力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 多聚乳糖胺与白血病多药耐药性 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 本课题所获得的基金资助 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（3）多聚乳糖胺型N-聚糖与结肠癌细胞株SW620耐药性的关系探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 5-FU 处理结肠癌细胞 SW620 后多聚乳糖胺型 N-聚糖的变化研究 |
| 1. 材料和设备 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 耐药细胞株SW620/5-FU的构建及其耐药性与多聚乳糖胺的关系探讨 |
| 1. 材料和设备 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述— 结肠癌糖基化与肿瘤多药耐药 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 本课题所获得的基金资助 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（4）糖基化神经酰胺合成酶和多药耐药相关蛋白在胰腺癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 试剂及检测方法 |
| 1.3 结果判定 |
| 1.4 数据处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 GCS、MRP在胰腺癌及正常胰腺和胰腺炎组织中的表达 |
| 2.2 GCS、MRP表达与临床病理特征的关系 |
| 2.3 GCS、MRP在胰腺癌中表达的相关性 |
| 3 讨 论 |
（5）葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 GCS基因真核表达载体的构建及转基因肝癌细胞株HepG2/GCS的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 GCS基因与MDR1基因在肝癌细胞多药耐药中的相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 黄芪甲苷对基因转染肝癌细胞株HepG2/GCS耐药性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（7）葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间发表的论文和所获的奖励 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 详细摘要 |
（8）葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 Alamar BlueTM多功能细胞染料实验 |
| 1.4.1 接种细胞 |
| 1.4.2 加药 |
| 1.4.3 检测 |
| 1.5 半定量RT-PCR实验 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 RNA的提取 |
| 1.5.3 逆转录反应 |
| 1.5.4 PCR扩增 |
| 1.5.5 扩增产物检测 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 Alamar Blue TM多功能细胞染色法检测细胞耐药指数 |
| 2.2 K562/AO2和K562细胞的GCS及MDR1基因的电泳结果分析 |
| 2.3 K562/AO2和K562细胞的bcl-2及bax基因的电泳结果分析 |
| 2.4 K562和K562/AO2细胞株的GCS、MDR1、bcl-2和bax基因的相对A值 |
| 3 讨论 |
（9）葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 GCS在人胃癌细胞系的表达和意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GCS小干扰 RNA载体的构建与表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 GCS小干扰 RNA对胃癌细胞多药耐药的逆转作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 GCS小干扰 RNA对裸鼠胃癌移植瘤生长及 GCS基因表达影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 肿瘤的多药耐药性与神经酞胺糖基化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 博士研究生期间发表论文、参编着作及其他工作情况 |
| 致谢 |
（10）葡萄糖神经酰胺合成酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多药耐药肿瘤细胞株 K562/AO2 中 GCS 基因表达与白血病多药耐药的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中GCS基因高表达与细胞凋亡基因表达异常的关系 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中GCS基因高表达与细胞凋亡基因表达异常耐药性 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验小结 |
| 结论 |
| 综述 |
| 研究生期间发表论文 |
| 主要英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、神经酰胺糖基化与肿瘤的多药耐药性（论文参考文献）
- [1]平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究[D]. 曹琳. 西北大学, 2021(12)
- [2]β3GnT8催化多聚乳糖胺链对白血病细胞K562/乳腺癌细胞MCF-7耐药机制的相关研究[D]. 袁亚琴. 苏州大学, 2016(02)
- [3]多聚乳糖胺型N-聚糖与结肠癌细胞株SW620耐药性的关系探讨[D]. 高利平. 苏州大学, 2014(09)
- [4]糖基化神经酰胺合成酶和多药耐药相关蛋白在胰腺癌中的表达及其临床意义[J]. 王佐正,罗永云,宋建军,赵琳. 西安交通大学学报(医学版), 2013(01)
- [5]葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究[D]. 田彦璋. 山西医科大学, 2011(08)
- [6]米非司酮和白血病多药耐药[J]. 杜梅,李慧慧. 江西医学院学报, 2009(04)
- [7]葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义[D]. 胡萍萍. 苏州大学, 2008(11)
- [8]葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系[J]. 施媛萍,谢平,谢可鸣,葛素梅,张滨,穆会君,沈云峰. 苏州大学学报(医学版), 2007(05)
- [9]葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究[D]. 张艳. 郑州大学, 2007(05)
- [10]葡萄糖神经酰胺合成酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系[D]. 施媛萍. 苏州大学, 2007(03)