一、输血与朊病毒疾病的传播（论文文献综述）
丁铭宣[1]（2021）在《纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究》文中研究表明研究背景和目的:朊病毒病作为能在人与哺乳动物间传播的感染性神经退行性疾病,其潜伏期很长,且患上朊病毒病的患者无一例外地在发病数月至数年内去世。朊病毒有致命的神经毒性,其机理仍未完全明确地为人们所知,并且因为其疾病过程的快速进展,使得干预及治疗变得特别困难。尽管世界各地的学者都在竭尽所能地进行着相关的基础实验与临床试验,试图找到应对朊病毒的策略,但目前为止依然收效甚微。由于缺乏成熟的针对朊病毒病的有效疗法,甚至没有成功的临床试验,目前对于朊病毒病患者所能给予的干预手段基本以支持性和姑息性治疗为主。故找到对于人类朊病毒有效的药物或防治方法是近年来对于朊病毒方向的研究热点,也是人类探索朊病毒病的最终目的。多项研究报道,CEs在毒株接种前后对于朊病毒感染的动物都具有明显的保护作用,也可在一定程度上治疗受朊病毒感染的细胞,表现出了令人惊喜的防治潜力,但其对朊病毒的作用机制尚不明确。故本研究设计实验,选用在前人的研究中,对于患朊病毒病的动物防治效果较为优秀的一种CE——TC-5RW作为试验药物,在体内及体外,分别研究了TC-5RW对于动物及人类朊病毒的作用,试图进一步探究CEs防治朊病毒病的机制,推动包括TC-5RW在内的CEs作为临床试验新药造福朊病毒病患者的研究进程。研究方法:本研究利用表达仓鼠朊蛋白的转基因小鼠进行动物实验。在感染仓鼠263K朊病毒的当天,向小鼠腹腔内一次性注射TC-5RW进行给药处理,随即对动物生存期及病理征象进行观察、对脑Pr P进行二维蛋白质电泳、以及通过检测其皮肤组织内是否存在朊病毒播种活性,来探究TC-5RW体内注射对动物朊病毒病的作用。其中,对于皮肤组织内可能存在的微量朊病毒的播种活性,是利用s PMCA与RT-Qu IC两种新兴的、灵敏度极高的手段来进行检测的。同时本研究也应用了这两种检测手段,在检测体系中直接加入TC-5RW,通过体外实验探究该药物对感染动物或人类组织中的朊病毒播种活性的影响。此外,本研究为了进一步探究TC-5RW是否对朊病毒PrPSc存在直接作用,将TC-5RW与朊病毒感染的人或动物的脑匀浆共同温育一定时间,随后以蛋白酶K（proteinase K,PK）处理,通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）来观察处理后存在蛋白酶抗性的PrPSc,又称蛋白酶抗性朊蛋白（proteinase K resistant prion protein,Pr Pres）水平变化。本研究通过以上实验方法,探寻TC-5RW在体内及体外对朊病毒播种活性的影响,及该药物直接作用对朊病毒蛋白酶抗性的影响,来分析其防治朊病毒病的可能机制。研究结果:本研究发现,TC-5RW的体内作用可使263K感染的转基因小鼠病症减轻,具体表现为:与对照组相比,治疗组小鼠生存期显着延长,且脑组织神经病理征象不明显。二维蛋白质电泳结果表明,治疗组小鼠与对照组小鼠脑PrP的分子量与电荷均无明显区别,说明该化合物不通过影响朊蛋白翻译后修饰的途径抑制朊病毒形成与累积。在体外实验中,首先以动物源朊病毒作为种子,发现向s PMCA检测体系中加入不同浓度的TC-5RW,可以抑制朊病毒的扩增;向RT-Qu IC体系加入TC-5RW,可延长RT-QuIC荧光值曲线的起峰时间,并使ThT荧光峰值降低,说明该药物的加入降低了重组蛋白被朊病毒种子转化为淀粉样构象的效率,即降低了朊病毒的播种活性。在以上实验中仅2μg/m L的TC-5RW存在就能明显抑制朊病毒的播种活性,且这种作用在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还将TC-5RW与患病动物的脑匀浆直接共温育后以PK处理,发现Pr Pres水平明显降低,这种作用亦在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还发现TC-5RW在体外对包括s CJD MM1、s CJD MV2、s CJD VV2、g CJD E200K、gCJD V180I、FFI在内的多种人类朊病毒亚型都具有相似的作用,可直接降低抗蛋白酶消化的Pr Pres水平,且终浓度为250μg/m L的TC-5RW存在于检测体系内可降低朊病毒播种活性,尤其对gCJD V180I及FFI的作用最为显着,药物浓度50μg/m L时甚至能完全抑制这两种亚型的RT-Qu IC反应。结论:本研究结果表明,TC-5RW不仅能够使朊病毒感染动物的潜伏期延长,病理征象减轻,还可降低其皮肤组织内PrPSc的播种活性。在体外实验中,向PMCA与RT-Qu IC体系中直接加入TC-5RW可以抑制人或动物PrPSc的播种活性。TC-5RW与PrPSc温育后,可促进其转化为容易被PK降解的结构,这可能暗示了其抑制朊病毒的作用机制。
张微观刘[2]（2021）在《RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究》文中认为朊蛋白病是一种可以感染人类和动物的具有传染性的致死性中枢神经系统退行性疾病。该病诊断困难,确诊主要依靠脑组织PrPSc检测。临床上脑活检的创伤性大,且风险高,不易被患者接受,所以对该病的脑组织取样大多只能在患者死后实施。相比较于其它国家,由于文化差异,我国尸检难于实施。VPSPr是一种新型人朊蛋白病,发病机制尚不明确,人们对它的认识并不多。而动物的朊蛋白病CWD传染性高,可以对农业和环境造成巨大的危害。因此对各种朊蛋白病的进一步认识和寻找一种可以替代脑组织PrPSc检测的可靠样本和检测手段非常重要。已有学者通过动物实验证实了皮肤中含有感染性的PrPSc,并且能够用RT-QuIC技术对皮肤中的PrPSc播种活性进行检测。目的:进一步认识VPSPr和CWD朊蛋白的特性,验证皮肤PrPSc作为朊蛋白病早期诊断生物标志物的可靠性,以及RT-QuIC技术对不同朊蛋白病PrPSc检测鉴定的有效性。方法:（1）建立RT-QuIC技术的检测方法,确定最佳反应条件;（2）通过蛋白质免疫凝胶电泳（WB）、二维蛋白质免疫凝胶电泳（2D）等技术对VPSPr和CWD白尾鹿的脑组织致病朊蛋白进行检测,分析它们的朊蛋白电泳图谱和特性;（3）采用RT-QuIC技术分别检测VPSPr和CWD鹿的脑组织中PrPSc的播种活性,并与sCJD患者脑组织PrPSc的播种活性进行对比;（4）采用双盲法,使用RT-QuIC技术对161例sCJD（几乎包含所有亚型）患者和非CJD患者皮肤朊蛋白进行检测,分析该方法检测皮肤样本的特异性和敏感性。结果:（1）VPSPr特殊的阶梯状电泳图谱的产生依赖于PK消化的浓度和碱性p H,它的PrPres条带只能由特定抗体检测出来;而VPSPr-7条带对PrP抗体1E4的亲和力更好;（2）与sCJD的PrP相比,VPSPrPrP中分子量更小的聚糖可能有较小的N端或C端短截体,并且形成了一个比全长（FL）-PrP迁移稍快的PrP条带;（3）通过RT-QuIC检测,sCJDMV2组每毫克组织的log SD50为>8.6,GSSP102L组为>7.7,VPSPr129VV组为>7.1,VPSPr129MM组为7.0,VPSPr129MV组为6.1,fCJDV180I组为>5.7,说明与sCJD和GSS相比,VPSPr脑组织中PrPSc的播散活性较低;（4）不同CWD白尾鹿的脑匀浆电泳谱不完全一致,至少有2种形态;（5）与sCJD相比,CWD白尾鹿脑组织中的PrPSc的播散活性较低,不过在10-6稀释度还是可以检测到该样本的播散活性。（6）RT-QuIC检测161例sCJD（几乎包含所有亚型）患者和非CJD患者皮肤朊蛋白的灵敏度为88.8%,特异性为100%。结论:（1）VPSPr的糖基化改变可能与其发病相关;该病PrPres的免疫印迹检测具有抗体、PK浓度和碱性pH依赖性;（2）不同底物对于VPSPr三种基因型PrPSc的RT-QuIC检测影响不大,RT-QuIC技术可以作为该病PrPSc检测的一种可靠诊断方法;（3）不同CWD白尾鹿脑组织中的PrPSc可能具有不同的菌株,它们免疫印迹图谱不具有特异性;RT-QuIC技术可以作为CWD筛查和低PrPSc样本检测的可靠手段;（4）皮肤PrPSc可以作为朊蛋白病诊断的可靠生物标志物;（5）RT-QuIC技术有望应用于各类朊蛋白疾病的诊断研究中。
朱峰,谭家亮,吴江,杨茹,毕昊,夏剑波[3]（2021）在《重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定》文中研究指明目的利用基因克隆技术制备重组G5P蛋白,并鉴定其结合朊病毒(PrPSc)的能力。方法化学合成G5P全长基因核苷酸片段,将其插入原核表达载体pET-28a-c（+）质粒中,获得pET-28a-c（+）-G5P重组质粒。将其转化到E.coli BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达,经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化重组G5P蛋白。制备重组G5P蛋白偶联磁珠,将其与含有或不含有PrPSc的人脑匀浆液混合,进行PrPSc的捕获实验。利用Western blot检测技术鉴定重组G5P蛋白与PrPSc结合的特异性与结合力。结果成功获得纯化的重组G5P蛋白,捕获实验显示重组G5P蛋白偶联磁珠仅从散发性克雅氏病（sCJD）患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白,而从非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后仍能检出Western blot条带,证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为PrPSc而非正常朊蛋白。将sCJD患者的脑匀浆液稀释10000倍后重组G5P蛋白仍可捕获到PrPSc。结论该研究利用基因克隆技术成功获得了纯化的重组G5P蛋白。该蛋白具有特异性结合PrPSc的能力,并具有较高亲和力。这为下一步研发新型朊病毒检测技术和滤除技术打下基础。
杨雪花[4]（2020）在《朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析》文中研究指明朊病毒病的确诊取决于对患病个体脑组织中PrPSc含量及其特殊病理变化的检测,因此特异性抗体对朊病毒病的诊断至关重要。本研究采用人源重组PrP蛋白23-231免疫Prnp基因敲除小鼠,ELISA测定血清效价为1:20480,收集小鼠血清制备PrP多克隆抗体（pAb P54）。通过蛋白PrP特异性Western blot、免疫组织化学和细胞免疫荧光实验评价制备抗体的特异性。Western blot结果显示pAb P54抗体可与重组PrP蛋白、正常啮齿动物和人脑组织中PrPC以及羊瘙痒因子感染的小鼠、仓鼠和不同类型的人朊病毒病脑组织中的PrPSc反应,且制备的抗体对脑组织中PrPC和PrPSc识别的条带特征与商品化PrP单克隆抗体（6D11及3F4）的几乎相同,三种糖基化形式清晰可见。免疫组织化学分析结果显示制备的抗体能够特异地识别羊瘙痒因子139A感染的小鼠和263K感染的仓鼠脑组织切片中的异常沉积的朊蛋白。免疫荧光实验结果显示pAb P54抗体可识别细胞核周围的PrP蛋白（绿色荧光）。上述结果证明制备的pAb P54多克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,可用于人和啮齿动物朊蛋白的识别,并且适用于多种检测方法,在朊蛋白生物学研究以及人和啮齿动物脑组织朊病毒的检测具有较好的应用前景。朊蛋白由机体PRNP基因所编码,该蛋白在不同哺乳动物间相对保守,其氨基酸序列与朊病毒病的易感性有关。沙狐为犬科狐属的动物,主要栖息于干草原、荒漠和半荒漠地带,广泛分布于中亚和我国西部的多个地区,通常以啮齿类动物和鸟类为其主要的食物来源,同时也被多种食肉类动物捕食。高原鼠兔则为鼠兔科鼠兔属的动物,是青藏高原特有物种和关键物种,也是草原上大多数中小型肉食动物和几乎所有猛禽的主要捕食对象。在本研究中,我们首次克隆并测序了青藏高原沙狐及高原鼠兔的全长Prnp基因,利用软件对序列分析得出相应的氨基酸序列并对其进行比较。其中沙狐的Prnp基因编码区共774bp,对应编码257个氨基酸的朊蛋白;高原鼠兔Prnp编码区共包含759bp,对应编码252个氨基酸的朊蛋白。根据这两物种的Prnp序列,深度比对分析这两种动物与其他动物物种的亲缘关系,其中沙狐与其它三种同属狐类的序列相似度为100%;高原鼠兔与同属动物北美鼠兔的氨基酸序列仅有一个氨基酸位点不同;与其它多个物种（主要包括人、犬、牛、鹿、羊、骆驼、猫、小鼠和仓鼠等）的序列相似性也进行比对分析。本研究首次获得了沙狐及高原鼠兔Prnp序列并上传Pubmed数据库,同时作为青藏高原食物链循环的中间环节,对它们的Prnp基因序列及蛋白的测定、分析将有助于判定在特定地区不同物种间朊病毒传播的潜力。
高利萍[5]（2020）在《E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究》文中指出朊病毒病,又称可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies,TSE）,它是一种罕见的、能够引起人类及多种动物脑组织海绵状病理改变的退行性疾病,潜伏期长,致死率为100%,可在同种动物之间进行传播。朊病毒病典型的神经病理学改变为脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和胶质细胞增生。其致病机制目前认为是由于机体正常的富含α螺旋的朊蛋白PrPC发生错误折叠形成了富含β折叠的PrPSc。自1730年首次报道羊瘙痒病以来,人及20多种动物均可患朊病毒病,其中人朊病毒病包括克-雅病、致死性家族型失眠症、库鲁病、吉斯特曼-施特劳斯综合征,动物朊病毒病最常见的为羊瘙痒病、牛的海绵状脑病。克-雅病依据其发病机理可分为散发型、家族型、医源型与变异型。本研究分两部分,第一部分为我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析,主要针对我国30例E200K突变遗传型朊病毒病患者的遗传、家族、临床及实验室特征进行了分析。第二部分为Pinkl-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中的研究,我们以感染朊病毒的细胞模型和动物模型脑组织样本为研究对象,在体外、体内两个层面证明,朊病毒感染可活化线粒体自噬系统。第一部分:我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析E200K突变的遗传型克-雅病（gCJD）是世界范围内常见的突变类型之一。在本研究中,系统分析了我国30例E200K患者的流行病学、临床、实验室和遗传特征。这些患者来自12个不同的省份,大部分在我国北方。发病年龄范围为42-71岁,平均发病年龄为57岁。为了探究CYP4X1基因rs9793471多态性是否与遗传型克-雅病E200K的发病年龄有关,我们通过目的基因获得及序列测定发现,仅有1例患者CYP4X1基因rs9793471基因型为GA,其余为AA。本研究收集的病例患者男女比为11:19,病程为从2个月到26个月不等,平均为9个月。脑脊液（CSF）14-3-3阳性率为74%（20/27）,且在40-49岁及60-69岁人群中比率较高。头颅核磁共振（MRI）异常的比率为86.7%（26/30）,其中脑脊液14-3-3蛋白阳性病例中MRI异常率高达94%（17/18）。脑电图周期性三相波的比率为50%（13/26）。129位均为MM,219位为EE。我们对来自其中三个有家族史的21名家属进行了PRNP基因测序,结果显示16名为E200K携带者。以上研究表明,E200K在中国的遗传型克-雅病病例中具有相对较高的频率,并且其与散发型克-雅病有着相近的临床表现。本研究是目前国内最大规模的E200K遗传型克-雅病研究,将有助于人们对朊病毒病的全面、深入理解。第二部分:Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中的研究线粒体自噬是清除细胞内受损线粒体的重要过程,线粒体的功能障碍与越来越多的神经退行性疾病直接相关。然而,朊病毒病中线粒体自噬仍然需要深入探索。在本研究中,我们通过透射电镜发现,在朊病毒感染的细胞系SMB-S15中有更多的自噬体、肿胀且嵴断裂的线粒体以及自噬体包裹的受损线粒体结构,同时发现了激活的自噬流的分子证据即p62表达量降低、LC3β Ⅱ表达量升高。Western blots结果显示,线粒体膜蛋白TIMM44、TOMM20和TIMM23水平降低,且LC3β与线粒体存在共定位,这说明朊病毒感染的SMB-S15细胞中线粒体自噬被激活。另外,Pinkl和Parkin表达水平升高,尤其是在线粒体组分;在SMB-S15细胞中,多聚泛素化蛋白的表达量降低,而磷酸化的多聚泛素化蛋白表达量升高,这表明Pink1被激活;SMB-S15细胞中MFN2表达水平下降,而其泛素化形式表达上调,这表明Parkin被激活。以上结果说明,Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中发挥了重要作用。通过SiRNA干扰实验分别敲降SMB-S15细胞中Pink1和Parkin的表达,可降低自噬活性,但似乎不影响TOMM20和TIMM23的表达。此外,我们还通过Western blot和免疫组化实验检测发现,感染羊瘙痒因子小鼠适应株139A和ME7的小鼠脑组织中Pink1和Parkin水平在疾病终末期显着升高。免疫荧光分析显示感染羊瘙痒因子的小鼠脑组织中,Pink1信号与GFAP、Iba1和NeuN阳性细胞存在共定位。IHC检测了感染了 139A和ME7的脑组织的连续切片,发现更多的Pink1和Parkin阳性细胞位于PrPSc沉积较多的区域。这些结果表明,在朊病毒感染的细胞和朊病毒感染的实验小鼠模型中,通过增强的Pink1-Parkin通路激活了线粒体自噬,这也可能是导致神经元细胞坏死的原因之一。
肖琪[6]（2020）在《受到田鼠巴贝虫侵染的小鼠肾脏蛋白质组学研究》文中提出巴贝虫（Babesia）是一类经蜱虫传播的血液寄生型原虫,至今共发现100余种,其中多种可引起人兽共患的巴贝虫病,本研究涉及到的田鼠巴贝虫（Babesia microti）就是人巴贝虫病的病原体之一。巴贝虫病通过蜱类在全球范围广泛传播,严重影响人类健康和经济发展。田鼠巴贝虫病在我国主要发生在浙江、云南、内蒙古等地。田鼠巴贝虫病的潜伏期一般为1-3周,患者伴有头疼、发热、恶心、呕吐等一系列症状,并且患者的肾脏、脾脏等组织极易受损。本研究利用组织病理学方法观察被巴贝虫感染的小鼠肾脏组织。发现BALB/C小鼠受到巴贝虫侵染后肾脏组织出现缺血、肾功能异常、细胞形态异常等损伤变化。通过观察肾脏的HE染色切片发现,肾脏组织在感染高峰期出现了肾细胞排列疏松,肾血管缺血等症状,而在恢复期肾细胞逐渐排列紧密基本恢复到感染前状态。之后,我们利用DIA定量蛋白质组学方法对感染巴贝虫五个时期的肾脏组织的全蛋白以及磷酸化蛋白进行研究。对蛋白表达量和磷酸化修饰程度发生差异变化的蛋白进行生物信息学分析。探究这些蛋白在肾脏损伤以及修复过程中的作用。感染巴贝虫前后小鼠肾脏组织全蛋白的定量结果如下:未感染组（0天）和感染巴贝虫后5天、8天、11天、19天各时期共鉴定到2473条蛋白,其中发生差异变化的蛋白有1364条。通过对这些差异表达蛋白进行生物信息学分析发现:GO富集结果显示,差异表达蛋白主要参与催化活性、结合过程、分子调控等分子功能。在KEGG分析过程中发现,过氧化物酶体膜蛋白、α-甲基辅酶A消旋酶、脂酰辅酶A氧化酶、羟基类固醇脱氢酶4、三羟酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A酰基转移酶1在过氧化物酶体通路中发挥作用。这些蛋白联合起来参与过氧化物酶体中脂肪酸的β-氧化,感染田鼠巴贝虫后这些蛋白的表达量减少,造成脂肪酸氧化异常,脂类代谢紊乱。另外参与近端小管重碳酸盐回收/再生的碳酸酐酶2、谷氨酰胺酶、谷氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的蛋白表达量下调,造成肾小管回收再生能力下降,易引起肾小管酸中毒,这说明感染田鼠巴贝虫可引起肾脏组织损伤。通过对肾脏组织磷酸化蛋白鉴定结果分析,五个时期分别鉴定到9503条、9684条、9087条、9254条、9464条磷酸化肽段,五个时期鉴定到的交集磷酸化肽段共3668条。其中发生差异变化的磷酸化肽段有3023条,所对应1229条磷酸化蛋白。通过对这些差异变化的磷酸化蛋白开展的生物信息学分析发现:这些磷酸化蛋白主要参与结合过程、催化活性、分子调控等分子功能。在KEGG通路分析中发现,参与Hippo通路的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、转录共激活因子的磷酸化修饰水平在感染高峰期上调,抑制靶基因的转录,促进了细胞凋亡。P21激活激酶4、肌球蛋白轻链激酶参与肌球蛋白细胞骨架调节,在感染高峰期磷酸化修饰水平上调,促进细胞骨架调节,抵抗巴贝虫的入侵。研究结果为明晰田鼠巴贝虫对宿主肾脏造成损伤的分子机制和肾脏修复的分子机制提供了理论依据,同时也为田鼠巴贝虫病的诊断和治疗提供了新思路。
李超斯[7]（2018）在《DLP1调控线粒体动力学失衡在朊病毒疾病模型中的作用机制》文中指出版病毒病（Prion disease）又称传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy）,是一种渐进性、致死性的神经退行性人畜共患病,该疾病的主要病理学变化为脑组织空泡样病变、神经元大量的死亡以及胶质细胞的增多。目前的研究表明该疾病的致病原为朊病毒（PrPsc）,它是通过正常细胞膜蛋白朊蛋白（PrPc）二级结构的改变所导致的。线粒体是一种高度动态变化的细胞器,它通过大量多种GTP酶的调节不断完成自身的分裂及融合,为细胞行使正常生理功能提供相应的能量。反之,线粒体分裂融合功能紊乱会引起大量神经元的死亡,最终诱发神经退行性疾病,如帕金森综合症（PD）,阿尔茨海默病（AD）,亨廷顿病（HD）等。GTP酶家族中Dynamin-likeprotein 1（DLP1）是细胞内起主要作用的线粒体分裂蛋白,在所有的真核生物中序列非常保守并且广泛分布。本研究使用Prion动物模型及细胞模型,探索DLP1调节的线粒体动力学变化与Prion疾病中神经元大量丧失及神经退行之间的关系。并为探索一种新型治疗Prion疾病的药物寻找一个靶点。研究结果发现;1.Prion疾病中神经元及N2a细胞线粒体动力学失衡及线粒体DLP1含量升高:PrP106-126处理的N2a细胞及Prion仓鼠动物模型中,线粒体形态发生改变—碎裂,线粒体脊结构不完整;并且线粒体在神经元内的分布发生了明显的变化:从均匀的分布在细胞体及细胞突中转变到集中于细胞体内分布;Prion疾病中在线粒体DLP1蛋白含量升高:在PrP106-126处理的N2a细胞及Prion仓鼠动物模型中,DLP1的表达量略微降低,但线粒体上DLP1的量却显着升高。2.Prion疾病中线粒体形态及功能的变化是由DLP1调节的:通过对于DLP1量的调控（过表达及RNAi技术）观察线粒体形态的改变,研究发现在PrP106-126处理的N2a细胞中DLP1的过表达可以产生类似PrP106-126处理的N2a细胞中线粒体形态学的变化;DLP1 RNAi可有效的抑制PrP106-126处理后细胞线粒体碎裂的现象;DLP1调节的线粒体碎裂引起Prion疾病中线粒体功能紊乱:在PrP106-126处理的N2a细胞中,线粒体膜电位及ATP下降,活性氧和ADP/ATP上升,DLP1RNAi可有效的缓解PrP106-126处理的N2a细胞中线粒体功能紊乱。3.DLP1调节的线粒体碎裂导致了 Prion疾病中神经元活性的降低、凋亡及突触可塑性:进一步的研究发现,在PrP106-126处理的N2a细胞活性活性明显降低,体内及体外实验证明剪切后Caspase3的量明显升高,细胞发生凋亡。DLP1RNAi可有效的抑制Prion疾病中细胞的活性及凋亡指数;DLP1调节的线粒体碎裂与Prion疾病中神经可塑性有关。通过对N2a细胞及Prion仓鼠模型内PSD95及树突棘蛋白的检测,原代神经元内树突棘及线粒体的共定位结果共同证明,DLP1调节的线粒体形态及分布是Prion疾病中突触损伤及神经退行的原因之一。综上所述,本研究证明了 Prion疾病中,DLP1调控的线粒体动力学失衡和线粒体功能障碍是导致Prion疾病中神经元丧失及退行性病变的原因之一。
夏天[8]（2018）在《中老年患者腰椎后路手术应用自体血回输的效益》文中认为目的:回顾性病例分析。探讨中老年患者在腰椎后路手术中使用自体血回输的效益。对比研究我科的中老年患者行腰椎后路手术中是否使用自体血回输（Autologous blood transfusion,ABT）系统而产生的差异。方法:对2016年3月至2017年9月期间在福建医科大学附属协和医院住院,并接受腰椎后路手术的中老年患者进行回顾性数据收集。患者均按照既定的纳入标准及排除标准选取,均为同一位医师主刀手术,手术均采用腰椎后入路,减压节段为1到2个节段,总共确定为104名患者。在此期间,根据输血实践分为三个不同的观察者:A组术中自体血回输组（ABT）（n=31）:使用了自体血回输系统,术中出血在Cell Saver 5+系统处理后经抗凝、滤过等,回输给患者;B组输异体血组（ARCT）（n=21）:这些患者在输血接受了同种异体红细胞输注（ARCT）来应对术中或术后贫血（Hb小于70 g/dl或症状性贫血）,没有自体血液被转化;C组空白对照组（n=52）:整个住院期间,包括手术过程,未输任何形式的血制品。输血指征参考卫生部专家组制定的《临床输血技术规范》。住院比较患者基线数据、术中出血量、自体血回输量、异体输血量、术中尿量、异体输血量总量、术前及术后第1天血红蛋白、血细胞比容及减压节段、术后第1天引流量、术后总引流量、术后并发症、术后住院天数、总住院费用等。所有研究数据均由SPSS 22软件（IBM,美国）处理。结果:全部104名患者,在性别比、年龄、BMI等方面比较无显着差异（P>0.05）。术中出血量A组1个减压节段同B组1减压节段比,P>0.05,无显着差异;A组2个减压节段同B组2减压节段比,A组出血量少于B组,P为0.03,小于0.05,两组数据有统计学意义。A组尿量明显高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。A、B组数据在术前、术后血红蛋白、血细胞比容及术中减压节段方面比较无显着差异（P>0.05）。A、B两组组术后第1天引流量相差不大,术后总引流量B组明显高于A组,差异有统计学意义（P<0.05）。由于C组减压1个减压节段患者居多,且无明显合并症,故C组术中出血量及术后总引流量均最低。A组在总住院费用上、术后住院天数上均少于B组,两组P<0.05,具有显着性差异,有统计学意义。而由于A和B组增加了输血成本,故其住院总费用均高于C组。B组患者术后出现2例并发症,占该组总数的9.52%。A组与C组均未出现术后并发症。结论:中老年患者行腰椎后路手术,当使用ABT来补充失血,纠正贫血时,是安全、经济、可行的,可减少术中出血及术后失血,明显减少或避免输异体血,从而降低或避免输血的风险,减少术后并发症,缩短术后住院时间,减少住院费用,存在整体获益。本研究结果对于制定常规的成人腰椎后路手术围术期自体血回输的策略有一定的指导意义。
杨威[9]（2017）在《PRAS40缓解神经毒性多肽诱导神经元凋亡机制的研究》文中研究说明传染性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）也被称为朊病毒病,是一类具有传染性、致死性的神经退行性疾病。该疾病的原因通常是因为宿主机体内正常的细胞型阮蛋白（Cellular Prion Protein,PrPc）发生错误折叠后转化为具有致病性的朊蛋白（Scrapie Prion Protein,PrPSc）。PrPSc具有部分蛋白酶抗性,并能够诱导PrPC转变成PrPSc,在体内大量蓄积引起宿主发病。TSEs的病理学特点包括海绵状病变、小胶质细胞激活、星形胶质细胞增生以及神经元死亡。无法清除脑中致病性的PrPSc将导致神经元的功能障碍。目前仍然没有有效的应对朊病毒病的治疗方法以及预防控制措施。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）在细胞生长以及新陈代谢中都具有重要的调节作用。许多研究都表明mTOR的活性与神经退行性疾病的致病机制相关。PRAS40（proline-richAktsubstrateof40-kDa）是 mTORC1 的直接抑制蛋白,并且连接 AKT 和 mTOR通路。mTOR被认为具有调节细胞生长和新陈代谢的重要功能。许多研究表明,异常的mTOR活性与许多神经退行性疾病引起的认知障碍都有非常紧密的关系。本研究通过神经毒性多肽PrP106-126,建立朊病毒病（即传染性海绵状脑病）的疾病模型,进而研究朊病毒病中mTOR调节细胞凋亡的分子机制:（1）PrP106-126作用小鼠神经瘤母细胞系（N2a）,用免疫印迹法检测mTOR磷酸化的水平。研究结果表明:mTOR的磷酸化水平随时间的延长而显着升高。并且发现,mTOR的激活是由于PrP106-126引起的ROS产生,通过加入ROS的抑制剂NAC,磷酸化的mTOR水平明显降低。因此,PrP106-126处理后激活的mTOR通路与ROS的产生有一定关联。（2）转染HA-PRAS40的细胞用神经毒性多肽PrP106-126处理,与转染HA空白载体的对照组相比,过表达PRAS40的实验组细胞凋亡水平明显下降。过表达PRAS40的细胞在经过神经毒性多肽PrP106-126处理后,与转染空白载体的对照组相比,caspase-3剪切体和PARP剪切体的量明显下降。上述结果表明,过表达PRAS40可以缓解神经毒性多肽引起的神经元凋亡。（3）在神经毒性多肽PrP106-126处理后,与转染空白载体的对照组相比,转染了 HA-PRAS40的细胞表现出了 S6K1和4EBP1磷酸化水平的下降。mTOR信号通路在神经毒性多肽PrP106-126作用后可以被过度活化,而这种活化可以通过PRAS40的过表达或者雷帕霉素的处理而被抑制。（4）在过表达PRAS40之后,Akt和GSK3 β的磷酸化水平明显升高,表明PI3K-Akt信号通路被激活。加入Akt的抑制剂渥漫青霉素后,发现PRAS40对PrP106-126引起的神经元凋亡的抑制作用被减弱了,因此,PRAS40缓解PrP106-126引起的神经元凋亡,是通过恢复Akt的磷酸化活性来实现的。Akt可能部分参与了 mTOR调节的PrP106-126引起的神经元凋亡。PRAS40抑制了 mTORC1的过度活化,并且在保护细胞应对神经毒性多肽引起的凋亡中发挥了重要作用。因而,PRAS40作为靶蛋白,可为Prion疾病的治疗提供潜在的方法和思路。
张会侠,师润,李朝阳[10]（2017）在《朊病毒疾病将如何发展?》文中指出疯牛病是传染性海绵状脑病（朊病毒病）的一种,1985年在英国暴发的疯牛病引起了全世界的关注.发生疯牛病的分子机制是疯牛病病毒诱导细胞型朊蛋白的构象发生变化,从富含?-螺旋的细胞型朊蛋白转变为富含?-折叠的疯牛病病毒,导致这种构象变化的原因目前仍然未知.这类传染性的神经退行疾病目前仍然没有有效的治疗方法.虽然禁止肉骨粉作为动物饲料明显地抑制了疯牛病的进一步流行,但是羊瘙痒病、水貂传染性脑炎和鹿慢性消耗性疾病等朊病毒疾病的流行病学表明朊病毒已经并将持续存在于自然界,而和人类健康息息相关.除朊病毒病外,多种神经退行疾病如阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等致病的原因都是由蛋白质异构引起的,因此阐明朊病毒疾病的致病机制对于其他神经退行疾病的研究有重要的借鉴意义.本文回顾了几大类传染型朊病毒疾病的发生历史和现状,依据朊病毒的发生及传播特性指出朊病毒疾病不可能被根除并存在暴发的潜在可能.
二、输血与朊病毒疾病的传播（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、输血与朊病毒疾病的传播（论文提纲范文）
（1）纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 朊蛋白、朊病毒与朊病毒病 |
| 1.2 朊病毒的检测 |
| 1.2.1 传统检测手段及临床诊断标准 |
| 1.2.2 新兴的检测技术 |
| 1.3 朊病毒病的治疗方法与进展 |
| 1.3.1 临床治疗手段及探索 |
| 1.3.2 针对朊病毒防治的科研进展 |
| 1.3.3 纤维素醚及其在朊病毒治疗中的应用前景 |
| 第2章 材料、仪器与试剂的配制 |
| 2.1 材料、试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 脑匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.2 皮肤匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.3 TC-5RW生理盐水溶液 |
| 2.3.4 TC-5RW水溶液 |
| 2.3.5 肌氨酸溶液 |
| 2.3.6 PK溶液 |
| 2.3.7 PMSF溶液 |
| 2.3.8 LB液体培养基 |
| 2.3.9 0.1×BBMM |
| 2.3.10 8M盐酸胍 |
| 2.3.11 0.2M磷酸氢二钠溶液 |
| 2.3.12 0.2M磷酸二氢钠溶液 |
| 2.3.13 变性缓冲液 |
| 2.3.14 复性缓冲液 |
| 2.3.15 洗脱缓冲液 |
| 2.3.16 透析液 |
| 2.3.17 0.1 M磷酸钠缓冲液 |
| 2.3.18 PMCA转换缓冲液 |
| 2.3.19 Western blot电泳缓冲液 |
| 2.3.20 Western blot转膜缓冲液 |
| 2.3.21 Western blot洗膜缓冲液TBST |
| 2.3.22 Western blot封闭牛奶缓冲液 |
| 2.3.23 Western blot上样缓冲液 |
| 2.3.24 2D脱水缓冲液 |
| 2.3.25 2D再水化缓冲液 |
| 2.3.26 2D平衡缓冲液A |
| 2.3.27 2D平衡缓冲液B |
| 2.3.28 10mM ThT溶液 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 研究路线 |
| 3.2 实验伦理与安全 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.4 大脑与皮肤样本的制备 |
| 3.5 组织病理实验方法 |
| 3.5.1 组织的石蜡包埋与切片 |
| 3.5.2 Pet blot染色流程 |
| 3.5.3 H&E染色流程 |
| 3.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.6.1 表达仓鼠重组蛋白细菌的培养与表达 |
| 3.6.2 包涵体的制备 |
| 3.6.3 蛋白纯化 |
| 3.6.4 蛋白分装 |
| 3.7 RT-QUIC流程 |
| 3.7.1 样本稀释 |
| 3.7.2 制备反应体系 |
| 3.7.3 上样 |
| 3.7.4 开始及结束程序 |
| 3.8 SPMCA流程 |
| 3.9 TC-5RW与脑匀浆共温育实验 |
| 3.10 二维蛋白质印迹 |
| 3.11 蛋白质印迹 |
| 3.12 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 纤维素醚TC-5RW体内注射对朊病毒感染转基因小鼠的作用 |
| 4.1.1 TC-5RW治疗使朊病毒感染小鼠症状减轻 |
| 4.1.1.1 TC-5RW治疗组小鼠生存期明显延长 |
| 4.1.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrPSc沉积和海绵状变性减轻 |
| 4.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrP的 2D结构无明显变化 |
| 4.1.3 TC-5RW治疗组小鼠皮肤组织中无法检测到朊病毒播种活性 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 纤维素醚TC-5RW在体外对动物朊病毒的作用研究 |
| 4.2.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制患病仓鼠脑PrPSc的播种活性 |
| 4.2.2 TC-5RW加入RT-QuIC体系影响了动物脑与皮肤PrPSc的播种活性 |
| 4.2.3 TC-5RW在体外与动物朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3 纤维素醚TC-5RW在体外对不同亚型人类朊病毒的作用研究 |
| 4.3.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制人类PrPSc的播种活性 |
| 4.3.2 TC-5RW在体外与人类朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3.3 TC-5RW加入RT-QuIC体系抑制各种人类朊病毒病PrPSc的扩增 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 错误折叠朊蛋白PrP~(Sc)的形成 |
| 1.2 致病性朊蛋白与朊蛋白病发病机制的相关研究 |
| 1.3 变异蛋白酶敏感性朊蛋白病和慢性消耗性疾病的概述 |
| 1.4 朊蛋白病的常规检测方法 |
| 1.5 实时震荡诱导转化技术对皮肤朊蛋白的检测 |
| 第2章 实时震荡诱导转化(RT-QuIC)技术的优化 |
| 2.1 PrP~C反应底物的选择 |
| 2.2 反应体系的配置 |
| 2.3 对照组的设立 |
| 2.4 确定PrP~(Sc)种子的稀释度 |
| 2.5 机器运行条件 |
| 2.6 结果判读 |
| 2.7 统计学分析 |
| 第3章 新型朊蛋白病VPSPr的脑组织PrP~(Sc)的检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pH值和PK浓度对VPSPr阶梯状PrP~(res)电泳图谱产生的影响 |
| 3.3.2 用不同抗体的蛋白质印迹(WB)探究PK处理对VPSPrPrP~(res)片段形成产生的影响 |
| 3.3.3 VPSPr的二维蛋白质免疫印迹电泳检测及图谱分析 |
| 3.3.4 VPSPr和sCJD糖型的蛋白质免疫印迹对比 |
| 3.3.5 错误折叠蛋白循环扩增(PMCA)技术检测VPSPr脑组织中的PrP~(Sc) |
| 3.3.6 用RT-QuIC技术比较VPSPr与其他朊蛋白疾病的脑PrP~(Sc)的播散活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 慢性消耗性病(CWD)白尾鹿脑组织的PrP~(Sc)检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CWD鹿脑组织PrP~(Sc)的检测 |
| 4.3.2 CWD与正常鹿脑组织的蔗糖梯度沉淀分析 |
| 4.3.3 二维蛋白质免疫凝胶印迹法(2D)对CWD鹿脑组织进行分析 |
| 4.3.4 使用RT-QuIC技术测定不同CWD脑组织的PrP~(Sc) |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 实时震荡诱导转化技术对大样本病人皮肤朊蛋白的检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 患者尸检或活检皮肤的收集 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 主要创新与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 脑组织 |
| 1.1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.2 重组子pET-28a-c(+)-G5P的构建 |
| 1.3 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化 |
| 1.4 重组G5P蛋白偶联磁珠的构建 |
| 1.5 脑匀浆液的制备 |
| 1.6 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获实验 |
| 1.7 朊蛋白的Western blot检测 |
| 1.8 蛋白酶K水解 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的构建及验证 |
| 2.2 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.3 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获与检测 |
| 2.4 重组G5P蛋白偶联磁珠捕获的朊蛋白的特征分析 |
| 2.5 重组G5P蛋白与PrPSc亲和能力分析 |
| 3 讨论 |
（4）朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1. 朊病毒病 |
| 2. 朊蛋白 |
| 3. PRNP基因 |
| 4. 朊病毒病的传播及种属屏障 |
| 5. PrP抗体 |
| 6. 研究目的及意义 |
| 第一部分 HuPrP23-231多克隆抗体制备 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 朊病毒毒株及细胞系 |
| 2. 抗体和酶 |
| 3. 缓冲液及溶液配制 |
| 4. 其他相关材料与试剂 |
| 5. 实验仪器及设备 |
| 实验方法 |
| 1. Hu23-231蛋白表达纯化 |
| 2. 免疫小鼠及效价测定 |
| 3. 细胞培养及裂解液制备 |
| 4. 多抗验证 |
| 4.1 免疫印迹(Western blot) |
| 4.2 免疫组织化学 |
| 4.3 免疫组织荧光 |
| 4.4 免疫细胞荧光 |
| 实验结果 |
| 1. 蛋白表达纯化及动物免疫 |
| 2. ELISA血清效价测定 |
| 3. 多抗验证结果 |
| 3.1 免疫印迹 |
| 3.2 免疫组织化学 |
| 3.3 免疫组织荧光 |
| 3.4 免疫细胞荧光 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 沙狐及高原鼠兔Prnp序列测定分析 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 材料与试剂盒 |
| 1.1 Prnp序列测定相关材料与试剂 |
| 1.2 质粒构建相关材料与试剂 |
| 2. 引物 |
| 3. 设计及分析软件 |
| 实验方法 |
| 1. 动物基因组提取 |
| 2. PCR扩增 |
| 3. 目的片段连接至T-vector并测序 |
| 4. 测序结果分析及提交 |
| 实验结果 |
| 1. 沙狐Prnp序列测定 |
| 1.1 PCR结果 |
| 1.2 Prnp基因测序结果 |
| 1.3 氨基酸序列比对结果 |
| 1.4 多物种序列相似性分析 |
| 1.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 2. 高原鼠兔Prnp序列测定 |
| 2.1 PCR结果 |
| 2.2 Prnp基因测序结果 |
| 2.3 氨基酸序列比对结果 |
| 2.4 多物种同源关系分析 |
| 2.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 不同物种PRNP特征及疾病易感性分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 1 朊病毒病概述 |
| 1.1 朊病毒病 |
| 1.1.1 遗传型朊病毒病 |
| 1.1.2 遗传型克-雅病E200K |
| 1.2 朊病毒病的诊断和检测方法 |
| 1.3 朊蛋白的生物学特性 |
| 1.3.1 细胞型朊蛋白PrP~C |
| 1.3.2 异常朊蛋白PrP~(Sc) |
| 1.3.3 PrP~(Sc)的形成、复制与聚集 |
| 2 线粒体自噬及其相关的调节机制 |
| 2.1 线粒体自噬的概念 |
| 2.2 线粒体自噬相关的的分子机制 |
| 2.2.1 酵母中的线粒体自噬 |
| 2.2.2 Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬 |
| 2.2.3 相关自噬受体介导的线粒体自噬 |
| 3 线粒体自噬与朊病毒及朊病毒病 |
| 第一部分 我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析 |
| 1 引言 |
| 2 主要的仪器与材料 |
| 2.1 主要的设备与仪器 |
| 2.2 主要的试剂与牦材 |
| 2.3 主要溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 全国克-雅病监测体系 |
| 3.2 病例的诊断与确定 |
| 3.3 样品的采集 |
| 3.4 脑脊液中14-3-3蛋白的检测 |
| 3.5 血液中PRNP基因129位及219位氨基酸多态性的测定 |
| 3.6 脑组织中PrP~(Sc)的Western blot检测 |
| 3.7 血液CYP4X1基因多态性的检测 |
| 4 随访 |
| 5 统计学分析 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 流行病学特征 |
| 6.2 临床特征 |
| 6.3 临床实验室检测特点 |
| 6.4 生存时间 |
| 6.5 PRNP及CYP4X1基因序列的测定与家族史 |
| 7 讨论 |
| 8 小结 |
| 第二部分 在朊病毒感染过程中Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验仪器和材料 |
| 2.1 朊病毒毒株模型 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 主要的试剂及耗材 |
| 2.3.1 细胞培养相关的主要试剂及耗材 |
| 2.3.2 细胞超薄切片的制备所需的试剂及耗材 |
| 2.3.3 免疫印迹相关试剂及耗材 |
| 2.3.4 实时定量聚合酶链式反应所用到的试剂及耗材 |
| 2.3.5 免疫组织化学、免疫焚光相关试剂及耗材 |
| 2.3.6 其它相关试剂及耗材 |
| 2.3.7 常用缓冲液及溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞超薄切片的制备及电子显微镜的观察 |
| 3.3 免疫沉淀(IP) |
| 3.4 脑组织匀浆的制备 |
| 3.5 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.6 SMB-S15及SMB-PS细胞总RNA的提取 |
| 3.7 单链cDNA的合成 |
| 3.8 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 3.9 免疫组织化学(IHC)实验 |
| 3.10 组织免疫荧光实验(IFA) |
| 3.11 细胞线粒体及胞质蛋白的提取 |
| 3.12 细胞瞬时转染 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 朊病毒感染细胞系SMB-S15的线粒体形态异常 |
| 4.2 朊病毒感染的细胞系SMB-S15中存在明显的自噬现象 |
| 4.3 朊病毒感染的SMB-S15细胞中Pink1、Parkin水平升高 |
| 4.4 多聚泛素化蛋白在朊病毒感染SMB-S15细胞中减少,而磷酸泛素化蛋白增加 |
| 4.5 朊病毒感染的SMB-S15细胞中MFN2蛋白减少而其泛素化形式增加 |
| 4.6 敲降SMB-S15细胞中Pink1和Parkin的表达,能部分抑制线粒体自噬 |
| 4.7 在139A和ME7感染的小鼠脑组织中Pink1和Parkin表达增加 |
| 4.8 Pink1在感染139A及ME7的小鼠脑组织中与GFAP、Iba1和Neun存在共定位 |
| 4.9 Pink1和Parkin在感染139A及ME7的小鼠脑组织中主要分布于PrP~(Sc)沉积区 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体自噬与神经退行性疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）受到田鼠巴贝虫侵染的小鼠肾脏蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 巴贝虫简介 |
| 1.2 蛋白质组学 |
| 1.2.1 蛋白质组学 |
| 1.2.2 定量蛋白质组学 |
| 1.3 修饰蛋白质组学 |
| 1.3.1 修饰蛋白质组学 |
| 1.3.2 磷酸化蛋白质组学 |
| 1.4 田鼠巴贝虫与蛋白质组学和肾脏疾病与蛋白质组学 |
| 1.4.1 田鼠巴贝虫与蛋白质组学 |
| 1.4.2 肾脏疾病与蛋白质组学 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第二章 田鼠巴贝虫感染小鼠后肾脏病理学变化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 动物感染 |
| 2.2.2 姬姆萨染色 |
| 2.2.3 肾功能和生化指标检测 |
| 2.2.4 肾脏组织解剖 |
| 2.2.5 肾脏HE染色切片的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 姬姆萨血涂片结果观察 |
| 2.3.2 肾脏组织解剖观察 |
| 2.3.3 肾功能及生化指标检测结果 |
| 2.3.4 肾脏HE染色切片观察 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 田鼠巴贝虫感染后小鼠肾脏组织的蛋白质动态变化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验耗材及仪器 |
| 3.2 实验方法及步骤 |
| 3.2.1 实验动物模型建立及肾脏解剖 |
| 3.2.2 小鼠肾脏蛋白的提取 |
| 3.2.3 蛋白酶解 |
| 3.2.4 蛋白脱盐 |
| 3.2.5 TiO_2磷酸化富集 |
| 3.2.6 高效液相色谱仪(HPLC)反向分级分离 |
| 3.2.7 DDA质谱建库分析 |
| 3.2.8 DIA质谱分析 |
| 3.2.9 生物信息学分析 |
| 3.2.10 小鼠肾脏组织过氧化氢(H2O2)含量检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠肾脏组织全蛋白实验结果 |
| 3.3.1.1 巴贝虫感染小鼠后肾脏组织蛋白数量鉴定 |
| 3.3.1.2 各时期差异表达蛋白聚类分析 |
| 3.3.1.3 各时期所有差异表达蛋白GO富集分析 |
| 3.3.1.4 四个Cluster中差异表达蛋白GO富集分析 |
| 3.3.1.5 四个Cluster中差异表达蛋白KEGG通路分析 |
| 3.3.1.6 差异表达蛋白PPI蛋白互作分析 |
| 3.3.2 小鼠肾脏组织磷酸化蛋白实验结果 |
| 3.3.2.1 巴贝虫感染小鼠后肾脏组织磷酸化肽段数量鉴定 |
| 3.3.2.2 各时期差异表达磷酸化肽段聚类分析 |
| 3.3.2.3 各时期所有差异表达磷酸化蛋白GO富集分析 |
| 3.3.2.4 四个Cluster中差异表达磷酸化蛋白GO富集分析 |
| 3.3.2.5 四个Cluster中差异表达磷酸化蛋白KEGG通路分析 |
| 3.3.2.6 差异表达磷酸化蛋白PPI蛋白互作分析 |
| 3.3.3 小鼠肾脏组织过氧化氢(H2O2)含量检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 过氧化物酶体通路相关蛋白 |
| 3.4.2 过氧化物酶体增殖物激活受体通路相关蛋白 |
| 3.4.3 近端小管重碳酸盐回收/再生通路相关蛋白 |
| 3.4.4 凋亡通路相关磷酸化蛋白 |
| 3.4.5 肌动蛋白细胞骨架调节通路相关磷酸化蛋白 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）DLP1调控线粒体动力学失衡在朊病毒疾病模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 传染性海绵状脑病概述 |
| 1.2 人克雅氏疾病 |
| 1.2.1 克雅氏疾病的流行病学 |
| 1.2.2 变异型克雅氏病的传播方式 |
| 1.2.3 Prion疾病跨种间传播的研究 |
| 1.3 病原学特点 |
| 1.3.1 朊蛋白低聚物的研究进展 |
| 1.3.2 不同种属来源的朊病毒易感性及结构稳定性之间的差异 |
| 1.4 PRPC的生物学功能 |
| 1.4.1 朊蛋白低聚物的神经毒性 |
| 1.4.2 朊蛋白低聚物能够引起神经元的凋亡 |
| 1.5 线粒体动力学 |
| 1.5.1 线粒体动力学概念 |
| 1.5.2 线粒体动力学与神经系统疾病 |
| 1.5.3 神经退行性疾病中线粒体动力学的失衡 |
| 1.5.4 线粒体动力学调节线粒体功能及凋亡 |
| 1.5.5 线粒体动力学与神经系统的发育 |
| 1.5.6 线粒体动力学与细胞凋亡 |
| 1.5.7 线粒体动力学与突触可塑性 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRION疾病中线粒体形态及分布发生改变 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验所用溶液的配制 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 无内毒素质粒Mito-GFP的大量提取 |
| 2.2.2 Mito-GFP质粒转染N2a细胞 |
| 2.2.3 PrP~(106-126)处理神经元 |
| 2.2.4 免疫荧光检测Mito-GFP的定位 |
| 2.2.5 Prion仓鼠脑组织样本的制备 |
| 2.2.6 透射电镜观察Prion金黄地鼠脑内线粒体形态 |
| 2.2.7 免疫组织化学染色法检测prion地鼠脑组织线粒体在神经元中的分布情况 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PrP~(106-126)处理的N2a细胞线粒体发生碎裂 |
| 2.3.2 prion仓鼠模型脑中线粒体发生碎裂 |
| 2.3.3 PrP~(106-126)处理的N2a细胞线粒体分布发生改变 |
| 2.3.4 prion仓鼠模型脑中线粒体分布发生改变 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PRION疾病中线粒体DLP1含量的升高导致了线粒体形态及功能的改变 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞系及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验所用溶液的配制 |
| 3.1.4 主要仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PrP~(106-126)处理N2a细胞 |
| 3.2.2 Prion仓鼠脑组织样本的制备 |
| 3.2.3 线粒体的分离 |
| 3.2.4 Western blot检测目的蛋白 |
| 3.2.5 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取 |
| 3.2.6 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞 |
| 3.2.7 激光共聚焦检测 |
| 3.2.8 活性氧的测定 |
| 3.2.9 ATP的检测 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Prion疾病中DLP1表达量略有下降 |
| 3.3.2 Prion疾病中线粒体DLP1的量显着上升 |
| 3.3.3 DLP1的量调控了PrP~(106-126) N2a细胞中线粒体形态的改变 |
| 3.3.4 DLP1调节的线粒体形态的改变可抑制PrP~(106-126)处理的N2a细胞线粒体功能紊乱 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 第四章 DLP1调节PRP~(106-126)诱导的神经元凋亡及突触可塑性的改变 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 实验所用溶液的配制 |
| 4.1.3 主要仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠原代皮质神经元的分离培养 |
| 4.2.2 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取 |
| 4.2.3 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞 |
| 4.2.4 PrP~(106-126)刺激小鼠原代神经元 |
| 4.2.5 Western blot检测Caspase3、PSD95及Spinophilin蛋白 |
| 4.2.6 慢病毒感染 |
| 4.2.7 免疫荧光检测树突棘及线粒体共定位 |
| 4.2.8 细胞活力的检测 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抑制DLP1的表达可以减少由于PrP~(106-126)引起的细胞活性降低 |
| 4.3.2 Prion疾病中细胞凋亡上升,DLP1调节的线粒体动力学变化可以调节PrP~(106-126)引起的细胞凋亡 |
| 4.3.3 DLP1与突触可塑性 |
| 4.3.4 Prion疾病中原代神经元树突棘数量的减少是DLP1调节的线粒体动力学紊乱导致的 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第五章 结论及创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）中老年患者腰椎后路手术应用自体血回输的效益（论文提纲范文）
| 英汉缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 临床资料与方法 |
| 1.临床资料 |
| 2.研究对象和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 观察指标 |
| 3.统计分析方法 |
| 结果 |
| 1.基线资料对比 |
| 2.术中观察指标对比 |
| 3.化验资料对比 |
| 4.术后观察指标对比 |
| 5.术后并发症、术后住院天数、总住院费用的对比 |
| 讨论 |
| 1.现阶段自体输血的不同类型 |
| 2.自体血与库存血显微镜下的差异 |
| 3.不同手术节段应用自体血液回输的倾向性 |
| 4.不同输血方式对术中出血量、术后引流量的影响 |
| 5.术后引流管的作用 |
| 6.术后并发症 |
| 7.术中自体血回输装置的应用对住院费用的影响 |
| 8.自体输血的局限性 |
| 9.自体血与库存血的比较 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）PRAS40缓解神经毒性多肽诱导神经元凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 传染性海绵状脑病的概述 |
| 1.2 朊病毒疾病的发展 |
| 1.3 朊病毒疾病的类型 |
| 1.4 朊病毒疾病的治疗 |
| 1.5 朊病毒研究进展 |
| 1.6 神经退行性疾病与氧化应激 |
| 1.7 mTOR在神经退行性疾病中的功能 |
| 1.7.1 mOTR概述 |
| 1.7.2 mTOR和相关蛋白稳态 |
| 1.7.3 mTOR与蛋白合成 |
| 1.8 PRAS40在神经退行性疾病中的功能 |
| 1.8.1 PRAS40概述 |
| 1.8.2 PRAS40的调节 |
| 1.8.3 PRAS40与mTOR的关系 |
| 1.9 mTOR与PI3K/AKT通路的负反馈调节 |
| 1.9.1 PI3K/AKT/mTOR负反馈调节的概述 |
| 1.9.2 PI3K/AKT/mTOR负反馈机制的研究 |
| 1.9.3 PI3K/AKT/mTOR负反馈调节的临床意义 |
| 第二章 PrP106-126处理N2a细胞引起mTOR的活化 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验所用溶液及配制 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Neuro2A细胞培养 |
| 2.2.2 PrP106-126刺激N2a细胞 |
| 2.2.3 活性氧清除剂对细胞的处理 |
| 2.2.4 p-mTOR、p-S6K1以及p-4EBP1蛋白含量的检测 |
| 2.2.5 细胞内活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PrP106-126刺激影响mTOR的磷酸化水平 |
| 2.3.2 活性氧(ROS)与mTOR磷酸化的关系 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 氧化应激与mTOR信号通路 |
| 2.4.2 神经退行性疾病与氧化应激 |
| 2.4.3 神经退行性疾病中氧化应激条件下的mTOR的激活 |
| 第三章 PRAS40对神经毒性多肽刺激下神经元凋亡的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验所用溶液及配制 |
| 3.1.4 主要仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的复苏培养 |
| 3.2.2 PrP106-126刺激N2a细胞 |
| 3.2.3 PRAS40蛋白及凋亡标志物蛋白含量的检测 |
| 3.2.4 质粒HA-PRAS40、shRNA-PRAS40的提取 |
| 3.2.5 PRAS40过表达及PRAS40干扰模型的建立 |
| 3.2.6 PrP106-126刺激后细胞凋亡率的测定 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PRAS40蛋白过表达及敲除模型 |
| 3.3.2 PRAS40过表达后,神经毒性多肽作用下细胞凋亡率的变化 |
| 3.3.3 PrP106-126刺激下,细胞凋亡蛋白水平的检测 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 PRAS40的神经元保护作用 |
| 3.4.2 错误折叠蛋白、氧化应激与凋亡 |
| 第四章 PRAS40对PrP106-126作用下mTOR活性的调节 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞及质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验所用溶液及配制 |
| 4.1.4 主要仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Neuro2A细胞培养 |
| 4.2.2 PrP106-126刺激N2a细胞 |
| 4.2.3 PRAS40过表达质粒的转染 |
| 4.2.4 雷帕霉素对细胞的处理 |
| 4.2.5 mTOR信号通路相关蛋白含量的检测 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PRAS40过表达通过抑制mTORC1减弱mTOR的活性 |
| 4.3.2 雷帕霉素抑制了神经毒性多肽PrP106-126引起的mTOR活性 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 神经退行性疾病中的异常mTOR活性 |
| 4.4.2 PRAS40与mTOR抑制 |
| 第五章 PRAS40通过mTOR-Akt调节神经元凋亡的研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞及质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 实验所用溶液及配制 |
| 5.1.4 主要仪器及设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞准备 |
| 5.2.2 PrP106-126对N2a细胞的处理 |
| 5.2.3 Akt通路部分相关蛋白及凋亡部分相关蛋白含量的检测 |
| 5.2.4 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PRAS40对Akt磷酸化的影响 |
| 5.3.2 渥曼青霉素对PRAS40影响Akt磷酸化效果的验证 |
| 5.3.3 渥曼青霉素对PRAS40调节凋亡水平的验证 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 FOXO转录因子与Akt信号通路 |
| 5.4.2 mTOR与Akt信号通路间的负反馈回路 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）朊病毒疾病将如何发展?（论文提纲范文）
| 1 致病机理 |
| 2 动物传染型疯牛病发展概况 |
| 2.1 牛传染性海绵状脑病 |
| 2.2 羊瘙痒病 |
| 2.3 鹿慢性消耗病 |
| 2.4 传染性水貂脑病 |
| 2.5 猫海绵状传染性脑病 |
| 3 人类传染性朊病毒病发展概况 |
| 3.1 库鲁病 |
| 3.2 医源性克雅氏病 |
| 3.3 新变异型克雅氏病 |
| 4 朊病毒疾病的未来和发展趋势 |
| 4.1 动物性朊病毒病不能在自然界被消灭 |
| 4.2 人类朊病毒病将伴随人类存在 |
四、输血与朊病毒疾病的传播（论文参考文献）
- [1]纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究[D]. 丁铭宣. 吉林大学, 2021(01)
- [2]RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究[D]. 张微观刘. 吉林大学, 2021(01)
- [3]重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定[J]. 朱峰,谭家亮,吴江,杨茹,毕昊,夏剑波. 华中科技大学学报(医学版), 2021(01)
- [4]朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析[D]. 杨雪花. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [5]E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究[D]. 高利萍. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [6]受到田鼠巴贝虫侵染的小鼠肾脏蛋白质组学研究[D]. 肖琪. 河北师范大学, 2020(07)
- [7]DLP1调控线粒体动力学失衡在朊病毒疾病模型中的作用机制[D]. 李超斯. 中国农业大学, 2018(12)
- [8]中老年患者腰椎后路手术应用自体血回输的效益[D]. 夏天. 福建医科大学, 2018(09)
- [9]PRAS40缓解神经毒性多肽诱导神经元凋亡机制的研究[D]. 杨威. 中国农业大学, 2017(08)
- [10]朊病毒疾病将如何发展?[J]. 张会侠,师润,李朝阳. 科学通报, 2017(01)