一、“前S1”挑战传统乙肝检测（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中指出冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
刘俊叶[2]（2021）在《基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究》文中认为目的:纵然疫苗的接种、人类卫生意识的提高和抗病毒药物的逐渐开发降低了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的感染,但迄今为止,HBV的消除仍是一大难题。主要原因是现有的抗乙肝药物难以完全消除共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）,因此迫切需要寻找新的靶点。HBV的生命周期大致概括为:入胞、ccc DNA的形成、核衣壳的组装、包膜化及分泌等几个关键环节。除了病毒分泌环节,以上各关键环节均有相应的抗病毒药物,主要原因是目前对HBV分泌调控机制尚不清晰,尚未找到合适的分泌相关靶点。我们研究小组早期利用质谱鉴定、转录组高通量测序、细胞及动物实验等发现人78 k D的葡萄糖调节蛋白（the 78k Da glucose-regulated protein,GRP78）与HBV的分泌有关,进而以GRP78为靶蛋白,噬菌体展示技术为手段,筛选出抑制HBV分泌的小分子物质,并进行实验验证,为HBV的治愈提供新策略。方法:（1）以GST-PreS1为诱饵蛋白,通过pull-down、质谱鉴定分析后发现目的蛋白GRP78,免疫共定位、等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry,ITC）实验探讨PreS1与GRP78间是否存在相互作用;（2）转录组高通量测序寻找GRP78与HBV生命周期的哪个环节有关;（3）分别对Hep G2.2.15细胞进行Ad-GRP78感染及si RNA转染处理后,采用particle gel对上清中的HBV Dane颗粒进行检测,验证GRP78对HBV分泌的作用;（4）为了获得纯度较好的GRP78蛋白,我们将构建好的重组p ET-28a-GRP78质粒转入E.coli BL21予以原核表达和Ni-NTA纯化;（5）为了得到与GRP78相互作用的小肽,我们选用噬菌体展示技术为工具;（6）借助ITC实验体外验证GRP78与合成小肽间的相互作用;（7）QPCR、particle gel实验用于筛选具有HBV分泌抑制作用的小肽,ELISA及capsid实验探究小肽的具体作用机制。结果:（1）质谱鉴定结果发现,GRP78与PreS1存在特异性相互作用;（2）转录组高通量测序暗示GRP78可能与HBV的分泌环节有关;（3）particle gel结果证明GRP78可以提升HBV的分泌水平;（4）以镍柱为工具,纯化后获得浓度、纯度均较高的重组GRP78蛋白;（5）噬菌体展示技术筛选出了60种可与GRP78结合的小肽,经分析,委托公司合成了6种频数较高的小肽;（6）ITC结果证明除GBP-67外,其余5种小肽与GRP78均存在相互作用;（7）细胞实验提示GBP-68可以抑制HBV的分泌;（8）对GBP-68的抗病毒机理进行了初步分析。结论:该研究前期发现了与HBV分泌相关的靶分子——GRP78蛋白,进一步实验证实GRP78可以促进HBV的分泌后,选择GRP78蛋白为靶点,以噬菌体展示技术为手段,筛选出抑制HBV完整病毒颗粒分泌的小肽（GBP-68）,且该抑制作用主要是通过抑制HBV病毒颗粒的包膜化过程来实现的。
李茂仕[3]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中指出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
贺凡[4]（2020）在《基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制》文中研究表明研究背景肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性度高、预后差,目前对肝癌的诊治仍存在巨大挑战,随着分子免疫学研究的进展,对肝癌的治疗有了新的补充,但仍然存在应答率低、疗效欠佳的困境,中医药目前在肝癌的治疗中显示出一定的优势,在肿瘤治疗中的地位也越来越突出,但同时存在药物成分复杂、机制不明等问题。基于此,寻找敏感度高、特异性强的与肝癌的发病有密切联系的生物分子标记物的需求十分迫切。研究目的参桃软肝方（STR）是导师周岱翰教授的经验方,具有健脾养肝、软坚消症之效,临床运用数十载,取得了较好疗效,但因中药成分复杂,药效机制尚不明确,限制了其在临床的推广应用。本研究旨在通过网络药理学的方法对STR的成分及作用乙肝相关性肝癌（HBV-HCC）的靶点进行筛选,建立“药物-活性成分-关键靶点-通路”网络关系图,并通过体外细胞及动物实验,观察STR抑制肝癌细胞株及抑制裸鼠皮下移植瘤模型的疗效,进一步通过高通量测序技术综合分析筛选STR可能的作用靶点和机制,并进行生物信息学验证以确定STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及可能的作用机制。研究方法1.通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对STR中的组成药物进行检索从而获取其化学成分,根据口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（drug likeness,DL）≥0.18作为条件筛选候选化合物,同时结合STR质谱分析的结果得到中药的潜在化合物,将其所对应的靶点基因与GEO数据库筛选出来的HBV-HCC相关的靶点基因进行配对后,获得STR和HBV-HCC两者共同拥有的关键靶点,即为STR作用HBV-HCC的潜在靶点。利用R软件中“cluster Profiler”安装包对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建“中药-化学成分-关键靶点-通路”网络关系图。2.采用MTT法观察STR对人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H增殖作用的影响,采用细胞划痕及Transwell实验观察STR对三株人肝癌细胞株的迁移能力的影响。3.建立人肝癌细胞株Hep G2.2.15裸鼠皮下成瘤模型,待瘤体积达100-200mm3时将其随机分为五组,即STR低、中、高剂量组,阴性对照组,阳性药对照组,分别进行灌胃,每天一次,连续给药25天,记录裸鼠状态、生长情况,测量瘤体积及裸鼠体重。最后一天给药结束,眼球取血,剥离瘤体,测量瘤重,进行统计学分析,取肝肾组织,HE染色观察肝肾形态学改变。4.取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行转录组学测序（RNA-seq）,通过文库构建、数据过滤及基因差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以火山图、聚类热图形式表现,并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集。取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序（WGBS）,通过文库构建、数据过滤及差异甲基化表达分析,筛选出差异甲基化区域及其对应基因,与转录组测序得到的DEGs重叠取交集。5.选取临床HBV-HCC病人8例癌组织与癌旁组织行WGBS,筛选差异甲基化区域（DMRs）相关基因,并将其与动物样本测序结果进行关联分析,寻找共同的差异甲基化基因,并进行GO与KEGG分析。6.通过Cytoscape软件将STRING构建的PPI网络进行可视化,并用拓扑分析进行核心基因筛选。将筛选出的核心基因通过c Bio Portal数据库中关联TCGA数据库对其进行突变谱分析,m RNA表达水平与甲基化状态的相关性分析;通过GEPIA数据库检验核心基因的m RNA表达水平及总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的预后分析;通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证核心基因的蛋白质表达水平的验证。研究结果1.通过TCMSP平台数据库检索西洋参、桃仁、大黄、丹参、当归、仙鹤草六种药物,以OB≥30%和DL≥0.18为条件进一步筛选,并通过质谱分析的结果,总共得到STR潜在化合物125个,删除重复靶点后得到437个蛋白靶点基因。通过GEO数据库筛选出HBV相关的HCC数据库GSE121248基因芯片数据,筛选出HBV-HCC的DEGs 888个。将STR药物预测的靶点与GEO数据库筛选出的DEGs进行配对,发现51个共同靶点基因,GO富集在971个条目中,KGEE通路富集分析显示靶点基因共富集了33条通路,其中与代谢相关的通路有酪氨酸代谢、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响、视黄醇代谢通路;与炎症相关IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样信号通路、松弛素信号通路等;与细胞周期相关的通路有细胞衰老、细胞周期、凋亡、p53信号通路等;与激素调节有关的雌激素信号通路、卵巢类固醇生成等;与血管生成有关的通路有VEGF信号通路,另外,还有广泛参与细胞生物学行为的PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。2.细胞实验表明,STR能够抑制人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H的增殖,并呈时间和剂量依赖性。划痕实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞的迁移能力,统计学结果见显着性差异（Hep G2.2.15 12h及24h划痕P<0.05,Hep G2 24h划痕P<0.05,MHCC97-H 12h及24h划痕P<0.05）。Transwell实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞株的迁移,统计学结果提示STR低、中、高剂量组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。3.动物实验表明,STR组的瘤体积和瘤重都较阴性对照组小,其中STR中、高剂量组与对照组比较,结果具有显着性差异（P<0.05）。说明STR能够抑制荷Hep G2.2.15肝癌裸鼠肿瘤的生长。4.荷瘤裸鼠肿瘤组织样本转录组测序得到有效差异表达的m RNA 221个,其中上调185个,下调36个。GO功能注释GO分析显示这些差异基因主要参与的生物学过程（biological process,BP）有蛋白质糖基化（protein glycosylation）、激素的分泌调节（regulation of hormone secretion）、不饱和脂肪酸代谢（unsaturated fatty acid metabolic process）,细胞基质粘附（cell-substrate adhesion）、先天免疫反应激活细胞表面受体信号通路（innate immune response activating cell surface receptor signaling pathway）等463个过程;细胞组分（cell component,CC）结果分析显示与高尔基体腔（Golgi lumen）、含胶原细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、肌节（sarcomere）、肌原纤维（myofibril）等55个条目;分子功能分析（molecularfunction,MF）结果表明,这些基因主要与细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）、钙依赖性磷脂绑定（calcium-dependent phospholipid binding）、溶血磷脂酶的活动（lysophospholipase activity）等51个功能有关。此外,KEGG通路富集分析发现,这些差异表达基因与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TGF-β信号通路、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）等通路有关。5.对荷瘤裸鼠STR治疗组瘤组织和对照组瘤组织进行WGBS检测,共得到DMRs 80510个,DMRs长度共8056280,共筛选出8986个基因。其中启动子区域异常甲基化基因3760个,高甲基化基因1600个,低甲基化基因2160个。将其与转录组测序筛选的m RNA与WGBS筛选出的差异甲基化基因进行重叠取交集,得到甲基化水平与差异表达基因呈负相关关系的重叠基因151个,GO富集了499个条目,KEGG分析显示与12条通路密切相关。6.临床HBV-HCC首次术后标本WGBS分析与动物测序筛选的差异甲基化基因取交集,得到146个共同的差异甲基化基因,通过拓扑分析,最终筛选到了10个与肝癌密切相关的基因,即CD44、LGALS3、ACTA1、LCN2、MUC1、IGFBP3、HAMP、IRS2、PDK4、BDKRB2。结合现有研究及通过外部数据库验证发现,Hub基因中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用,IGFBP3、HAMP、PDK4为抑癌基因,ACTA1作为抑癌因子尚存争议。测序结果提示STR抑制了癌基因LCN2的表达及上调抑癌基因IGFBP3、HAMP、PDK4的表达。人与动物测序共同的到的差异甲基化基因富集分析显示GO富集了509个条目,KEGG富集了13条信号通路,包括与I肝II纤维化密切相关的ECM-受体互作通路,与炎症相关的IL-17信号通路、松弛素信号通路、TGF-β信号通路、补体凝血级联通路,与代谢相关的脂质调节、外源性物质细胞色素P450代谢、蛋白质的消化吸收等途径,以及广泛参与肿瘤生物学调控的PI3K-AKT信号通路、c AMP信号通路等。研究结论本研究通过高通量分子测序揭示了一系列STR作用下的异常甲基化修饰的差异表达基因及通路,为阐述肝癌的诊疗提供新的思路。我们在经STR处理荷瘤裸鼠肝癌组织与对照组肝癌组织中发现了部分癌基因与抑癌基因,其中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用被认为是有致癌活性的,IGFBP3、HAMP、PDK4被认为是抑癌基因,以上基因的表达水平与甲基化状态均呈负相关关系。STR可能通过抑制LCN2的表达及上调IGFBP3、HAMP、PDK4的表达而发挥抗肝癌作用,可能作为STR抗HBV-HCC的潜在靶点。与通过网络药理学方法筛选得到的靶点及通路进行对比,发现有PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路、外源性物质细胞色素P450代谢等共同作用的通路,提示STR可能通过影响这些通路进而发挥抗肿瘤作用。
王淏[5]（2020）在《广州献血人群隐匿性乙肝病毒感染者乙肝病毒S基因分子生物学特性及其对乙肝表面抗原表达的影响》文中指出研究背景乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题,血清乙肝表面抗原（HBsAg）阴性者的肝组织或血清中仍可检出HBV DNA,这种现象称为隐匿性 HBV 感染（occult hepatits B virus infection,OBI）。OBI 是一种特殊形式的乙肝病毒感染,可以导致乙肝急性加重、肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）。OBI血清HBsAg阴性,HBVDNA往往处于极低水平,给血液筛查和临床诊断带来困难。OBI的致病因素是复杂的,其机制至今尚未完全研究清楚。多数研究认为,HBV基因变异,尤其是S区的主要亲水区（MHR）和“α”决定簇变异是导致OBI的机制之一。本研究目的是探究献血人群OBI S区的分子生物学特征,发现并验证S区与OBI相关的突变位点,进一步阐明OBI的发生机制。研究对象2015年4月-2017年5月期间在广州血液中心发现的123例OBI献血者。研究方法对OBI献血者血浆进行HBV核酸提取、病毒载量测定和PCR基因扩增,并测定其S区核苷酸序列。对OBI和HBsAg+/HBV DNA+对照组的S区序列特征进行分析。分析各组组间和组内MHR、“α”决定簇和MHR外区域（Non-MHR,NMHR）的氨基酸序列差异,通过比较发现OBI相关突变位点。此外,为了进一步验证OBI B基因型相关突变位点,本研究构建了保守的HBV B基因型全基因表达载体,通过定点诱变构建含有OBIB基因型相关突变位点的突变质粒,并将其转染至HepG2细胞,分析细胞内、外HBsAg表达水平。通过免疫荧光染色观察部分突变质粒转染细胞内HBsAg分布特征。采用GraphPad Prism7.0统计分析软件对实验数据进行分析,以Fisher精确检验分析组间分类数据,以Mann-Whitney U检验分析连续变量数据,采用Fisher’s LSD检验对各突变质粒HBsAg相对表达量进行比较,所有的统计检验均采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、OBIB基因型和C基因型的MHR、“α”决定簇、NMHR以及S蛋白的氨基酸突变数均明显高于各自对照组（P<0.001）,说明OBI S区存在显着的变异。OBIB基因型与C基因型MHR和“α”决定簇的氨基酸突变率均明显高于NMHR（P<0.05）。然而,HBV对照组的结果恰好相反,HBVB基因型的MHR和“α”决定簇氨基酸突变率均小于NMHR（P<0.05）;HBVC基因型的MHR氨基酸突变率小于NMHR（P<0.05）。说明OBI组中MHR氨基酸突变明显多于NMHR,而野生型HBV的MHR是相对保守区域。OBI B和C基因型S蛋白氨基酸突变数之间均无统计学差异（P>0.05）。2、OBIB基因组有 10个突变（E2G、Q101R、K122R、M133T、D144E、G145R、V168A、S174N、L175S和I226S）明显多于对照组（P<0.05）。OBIC基因组有28个的突变（E2G、T4I、F8L、V14A、L98R、Q101K、Q101R、M1031、S114T、T116A、S117G、S117N、T118K、T118R、K122R、P127T、A128V、Q129P、M1331、S136Y、D144E、G145A、R160K、E164G、V168A、S174N、L175S和M198I）明显多于对照组（P<0.05）。由于E2G、Q101R、K122R、D144E、V168A、S174N和L175S为B和C基因型共同发现的OBI相关突变,因此OBI组共有31个突变明显多于对照组。OBI相关突变在OBI序列的出现频率为8.9%-30.0%;而在对照组中,这些突变的出现频率仅为0%-3.8%。31个OBI相关突变中,有15个突变在以前的研究中曾有报道（Q101R、Q101K、M103I、S114T、S117G、T118K、K122R、P127T、Q129P、M133T、D144E、G145R、G145A、S174N和L175S）,另外16个突变之前没有报道（E2G、T4I、F8L、V14A、L98R、T116A、S117N、T118R、A128V、M133I、S136Y、R160K、E164G、V168A、M1981和I226S）。3、细胞转染实验显示:HBV B基因10个突变质粒和pHBV 1.3B质粒转染的细胞内、外均检测到HBsAg表达（>1COI）。与pHBV 1.3B相比,E2G、D144E、G145R、V168A和S174细胞外HBsAg相对水平分别下降96.2%、39.4%、84.2%、77.7%和37.4%（P<0.05）,E2G和M133T的细胞内相对HBsAg水平分别显着升高139.3%和51.8%（P<0.05）,G145R细胞内相对HBsAg水平则显着降低48.11%（P<0.05）。值得注意的是,E2G突变细胞外HBsAg（3.8%VS pHBV 1.3B）和细胞内HBsAg（239.3%VS pHBV 1.3B）都与pHBV 1.3B有显着性差异（P<0.0001）,表现出明显的HBsAg分泌受阻的特征。其他突变（Q101R,K122R,M133T,L175S和I226S）对细胞内、外HBsAg检测没有显着影响（P>0.05）。4、免疫荧光结果显示:HBV B基因10个不同突变质粒和pHBV 1.3B转染的细胞中均检测到HBsAg表达。在pHBV1.3B质粒转染的细胞中,HBsAg荧光在整个细胞质中呈广泛的、弥散均匀的细颗粒状分布。相比之下,E2G突变质粒转染的细胞中,大多数细胞HBsAg呈片状高密度分布在细胞核附近甚至整个细胞质,少数细胞HBsAg呈现出粗颗粒状的分布于细胞质中。E2G表达HBsAg的荧光光密度（中位数,0.091 IOD/pixel）明显高于pHBV1.3B（中位数,0.043 IOD/pixel）（P<0.0001）。结论和意义1、OBIS区存在显着的变异,S区的MHR突变在OBI形成中起到更重要的作用。2、在OBIS区中共发现31个具有代表性的OBI相关突变,其中E2G、T4I、F8L、V14A、L98R、T116A、S117N、T118R、A128V、M133I、S136Y、R160K、E164G、V168A、M198I、和I226S是文献没有报道过的新发现的OBI相关突变。3、在OBI B基因型中,E2G、D144E、G145R、V168A和S174N突变可以在细胞层面影响HBsAg检测。其中,E2G这种新型的OBI相关的突变,可以引起HBsAg分泌受阻,从而导致HBsAg细胞内淤积和分泌减少,初步阐明了 E2G引起OBI的机制。
刘莹[6]（2020）在《云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价》文中研究指明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,是一种带有包膜的小型环状部分双链（ds）DNA病毒。HBV感染是导致慢性乙型肝炎（CHB）、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要致病因素,对人类的健康造成很大威胁。由于不同基因型和亚型对乙肝患者存在致病性和治疗效果的差异,云南具有独特的地理位置和多民族聚集的地域特征,针对云南少数民族人群开展HBV的分子流行病学研究为乙型肝炎的治疗和控制具有重要意义。此外,近期研究发现HBV Pg RNA是HBV ccc DNA的直接转录产物,能够通过反映HBV ccc DNA的转录活动状态进而反映慢性乙型肝炎病情进展,从而指导临床治疗和判断预后。然而,目前针对HBV pg RNA的检测方法研究较少且该方法还未推广应用到临床。基于此本论文针对云南地区八个少数民族的普通人群进行了HBV流行病学调查并建立了HBV pg RNA的检测方法以及该方法的评价。首先,针对普通人群我们采集了云南地区五个少数民族（佤族、布朗族、哈尼族、纳西族、普米族）共计2696例血浆样本,利用Elisa方法检测发现,HBs Ag总体阳性率为7.6%（204/2696）,其中普米族感染率最高为15.4%（58/376）、哈尼族7.6%（37/487）、佤族7.4%（66/896）、布朗族5.4%（25/464）、纳西族4.9%（23/473）。针对204例HBs Ag阳性样本,我们利用HBV S基因进行基因型和亚型分析,结果显示该人群中HBV亚型分布为B2（48.6%）、C1（34.2%）、B4（13.9%）、C2（0.7%）、C5（0.7%）、和4.9%（10例）未确定基因亚型。为了进一步比较不同少数民族中HBV亚型分布差异,我们还收集了206例包括三个民族（傣族、彝族和汉族）乙肝肝病血液样本,经基因亚型分析显示,该人群中HBV亚型分布为B2（29.6%）、C1（29.1%）、C2（23.3%）、B1（0.5%）、B4（0.5%）以及35个未分型样本。经统计分析发现,哈尼族以B2（75%）为主,普米族以B2（38.6%）和C1（43.9%）亚型为主,纳西族以C1（47.1%）亚型为主,彝族以基因型B2（32.69%）和基因型C1占（38.46%）亚型为主,傣族以基因型C1（67.35%）为主,汉族以基因型B2（30.48%）和C2（36.19%）为主。其次,为了进一步分析上述45例未分型样本的基因特征,我们进行了HBV全基因组序列的扩增,其中我们成功获得了39例HBV全基因序列,经序列分析发现8例属于B/C重组,1例B/I重组。7例属于潜在B新亚型,6例属于C型新亚型,其余16例属于不同亚型。为了进一步命名这些新的HBV亚型,基于HBV全基因组序列我们分别进行了HBV遗传距离分析、同源关系进化树分析、基因重组分析、以及特异性氨基酸突变分析,分析发现这些样本符合HBV基因亚型的命名规则,因此我们将它们命名为B10和C17亚型。最后,我们针对HBV Pg RNA5’和3’端序列的特征,分别建立了两种HBV Pg RNA荧光定量PCR检测方法,经特异性、灵敏性、重复性分析发现针对HBV5’端序列建立的Pg RNA的检测方法特异性更好、灵敏度更高。此外,我们选择了40例临床HBV样本就我们建立的HBV Pg RNA检测方法进行评价,结果显示,慢乙肝样本中HBV Pg RNA含量明显高于乙肝肝癌样本,该结果与临床表现相符与相关文献报道一致,该结果表明我们建立的HBV Pg RNA的方法具有潜在的临床应用价值。综上所述,本研究阐明了HBV在云南地区八个民族中基因型和亚型的分布情况并比较了不同民族之间基因型的差异,揭示了云南地区不同民族HBV基因型的复杂性和多样性。同时我们还建立和评价了两种HBV pg RNA荧光定量的检测方法,为今后HBV的研究提供了重要的理论依据,同时也为临床样本的诊断提供了一种更加方便、灵敏的检测方法。
武喆[7]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
栗昀[8]（2020）在《复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究》文中研究说明肝癌是发病率和致死率都较高的恶性肿瘤,其发病率和致死率分别位于第三位和第五位,严重威胁人类健康。每年约有70万人被确诊为肝癌。引起肝癌的主要原因有酒精性以及非酒精性脂肪肝,肝纤维化以及肝硬化等。其中,在欧美国家,酒精性脂肪肝是引起肝癌的主要原因。与欧美国家不同,在我国,HBV感染是导致肝癌的主要因素。我国是HBV感染的高发区,每年约有9000多万人被检测出HBVsAg 阳性,42万死于肝癌,其中,90%存在HBV感染史。虽然随着HBV疫苗的普及,感染HBV的概率大大降低,但是,由于我国感染人数基数较大,对于已感染HBV的患者来说,控制HBV感染所导致的慢性肝炎,肝纤维化甚至是肝癌,仍然是一个巨大挑战。索拉菲尼是唯一一个FDA批准的,可用于治疗肝癌的抗癌药物。但是,对于HBV感染所导致的肝癌,其治疗效果远远低于其他原因引起的肝癌。并且,长期服用索拉菲尼也有可能导致耐药等副作用。对于HBV相关肝癌的患者而言,由于HBV的存在,其感染所导致的反复的慢性肝炎以及高滴度的HBV DNA仍然是肝癌复发的风险因素。HBV x基因是HBV4个开放编码框中最小的一个,在HBV相关HCC中具有重要作用,其可以通过直接作用或者是表观遗传学改变激活多种信号通路以及致癌基因,或者是灭活抑癌基因,在HBV相关HCC中是独立的风险因子。Hedgehog信号通路在修复组织损伤方面发挥着重要的调节作用。包括肝癌在内的多种肿瘤组织中该信号通路特异性激活,其主要蛋白Gli高表达;抑制其表达能够延缓肿瘤细胞增值。铁死亡是最新发现的一种细胞程序性死亡模式。其主要是由于铁依赖的大量脂质活性氧产生损伤细胞所致。索拉菲尼产生耐药的主要原因之一是抑制了肝癌细胞发生铁死亡作用。铁离子积聚引发的芬顿反应是发生铁死亡的主要特征之一。在HBV感染患者中,体内铁代谢的异常表达说明HBV感染有可能涉及铁死亡发生过程。长链非编码RNA虽然不具有编码蛋白的功能,但其可以调节miRNA或者是通过其他作用影响蛋白质表达,进而改变细胞正常生理功能,促使细胞发生病变。长链非编码RNA可以调节多条信号通路以及相关因子参与调节细胞表型改变。与蛋白或者是miRNA相比,靶向研究长链非编码RNA更具有优势以及前景。HBx作为致癌基因,可以调节多个长链非编码RNA参与到HBV相关HCC的发生过程中。并且,由于LncRNA具有组织特异性和时空特异性,以其为对象的生物学标志物以及药物干预靶点研究将对HBV相关HCC的基础研究和药物研发提供理论基础。复方叶下珠是由深圳市中医院肝病科创制的,用于治疗肝癌,尤其是HBV相关HCC的中药复方,其专利申请号为:201610517509.2。在临床应用中,复方叶下珠能够降低HBV相关HCC患者血清中病毒学标志物（HBVsAg,HBVcAg和HBV DNA）以及延缓HBV肝硬化发展成为HCC,具有较好的抗HBV相关HCC效果。实验研究发现,复方叶下珠能够抑制HBx基因表达。但是,其具体作用机制尚不明确,需要进一步研究。本次试验通过构建HBx过表达稳定细胞株HepG2-HBx,通过采用体内外实验,检测复方叶下珠对HepG2-HBx细胞增殖,迁移以及克隆的影响,评价复方叶下珠对HepG2-HBx细胞的抑制作用;同时检测HepG2-HBx细胞中HBx以及Hedgehog信号通路组成因子在mRNA以及蛋白的表达水平,探讨复方叶下珠抑制HepG2-HBx细胞作用机制。通过体内实验进一步明确复方叶下珠的抗HBV相关HCC作用并检测肿瘤组织中铁死亡相关因子的mRNA表达,评价复方叶下珠对铁死亡的影响,探索HBV相关HCC,Hedgehog信号通路以及铁死亡的关系。与此同时,通过长链非编码RNA高通量测序,筛选复方叶下珠靶向LncRNA,并通过Real-time PCR初步筛选,为进一步深入研究复方叶下珠的抗癌机制提供前期研究基础。研究目的通过复方叶下珠处理HepG2-HBx细胞,评价复方叶下珠对HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆的影响,并通过构建裸鼠移植瘤模型,体内评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的效果。检测复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞以及裸鼠移植瘤肿瘤组织中Hedgehog信号通路中相关因子的表达水平,证明抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗癌作用的机制之一。同时,检测肿瘤组织中铁离子染色和铁死亡相关基因的表达,探索HBV相关HCC与铁死亡的关系;通过LncRNA高通量测序,筛选复方叶下珠的靶向LncRNA,为后期进一步研究复方叶下珠的作用机制提供前期研究基础。研究方法1.评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的体外实验:构建过表达HBx基因的HepG2-HBx细胞稳定株,并用复方叶下珠进行不同浓度的处理,通过观察HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆实验,评价复方叶下珠对HBV相关HCC的抑制作用;并检测细胞中HBx和Hedgehog信号通路相关因子:SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1和GLI-2在mRNA和蛋白水平的表达;通过激光共聚焦检测细胞中GLI-1在细胞质和细胞核中的表达情况。2.评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的体内实验:将HepG2-HBx细胞接种到裸鼠皮下,并给予复方叶下珠进行治疗。通过测量裸鼠体重,肿瘤大小以及肿瘤抑制率等方法评价复方叶下珠对HBV相关HCC的抑制作用。并通过检测肿瘤组织中HBx和Hedgehog信号通路相关因子:SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1和GLI-2 在mRNA和蛋白水平的表达,以及利用免疫组化技术对SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1以及HBx进行分析,进一步证实抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC的作用机制之一。3.复方叶下珠诱导铁死亡作用:利用普鲁士蓝染色技术,检测裸鼠移植瘤肿瘤组织中铁离子的浓度变化以及通过real-time PCR检测肿瘤组织中FTH mRNA和铁死亡关键基因CISD1,CISD2,CPX4和ACSL4的mRNA表达,初步评价诱导铁死亡是否为复方叶下珠发挥HBV相关HCC的作用机制之一。4.LincRNA高通量测序:通过对HepG2-HBx细胞以及复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞进行LincRNA高通量测序筛选,筛选出具有统计学差异的LncRNA,并通过real-time PCR进行初步验证,为进一步研究复方叶下珠的作用机制提供思路。研究结果1.复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞的增值、迁移以及克隆,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）。在mRNA水平,复方叶下珠能明显抑制HBx以及SHH、PTCH-1和GLI-1的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）。而复方叶下珠对SMO以及GLI-2的表达没有影响:在蛋白水平,复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞中HBx以及SHH、PTCH-1,GLI-1的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）;与mRNA结果一致,复方叶下珠对SMO以及GLI-2在蛋白水平没有影响。激光共聚焦结果显示:复方叶下珠能明显抑制GLI-1在细胞质中的表达,其抑制效果呈量效关系。2.复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞移植瘤体积增长,降低肿瘤/体重比率,提高肿瘤抑制率;与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.01,或p<0.001）。与体外实验结果一致,复方叶下珠能抑制HBx以及SHH、PTCH-1,GLI-1在mRNA以及蛋白水平的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05,或P<0.01）;而复方叶下珠对SMO以及GLI-2在mRNA以及蛋白水平均没有抑制作用,无统计学差异（P>0.05）。免疫组化结果显示:过表达HBx能增加细胞质中SHH、PTCH-1、GLI-1和SMO的表达,而复方叶下珠在625mg/kg的条件下,能明显抑制细胞质中HBx以及SHH、PTCH-1、GLI-1的表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;复方叶下珠对SMO没有抑制作用,无统计学差异（P>0.05）。3.关于铁离子含量的变化,与HepG2-NC相比,HepG2-HBx组表达没有明显变化;但是,在环巴胺（cyclopamine）和复方叶下珠（625mg/kg）组,铁离子浓度明显增加,说明环巴胺和复方叶下珠可以提高肿瘤组织中铁离子含量。而对于FTH mRNA,HepG2-HBx组的表达水平明显升高（P<0.05）,而环巴胺和复方叶下珠可以降低其表达（P<0.05）。与HepG2-NC相比,CISD1和GPx4在HepG2-HBx组表达降低,但GPx4没有统计学差异（P>0.05）。复方叶下珠组（625mg/kg,300mg/kg）和环巴胺组能明显提高肿瘤组织中CISDlmRNA表达水平（P<0.01或P<0.00）,而对GPx4没有明显作用。在HepG2-HBx组中,CISD2表达明显降低（P<0.05）,并且环巴胺和复方叶下珠能明显提高其表达,尤其是复方叶下珠,有统计学差异（P<0.05或P<0.00）。而对于ACSL4,在HepG2-HBx组和复方叶下珠组,没有明显变化,无统计学差异（P>0.05）。4.LncRNA高通量测序结果显示,经过复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞,与未处理的HepG2-HBx细胞相比,分别上调114个和下调65个LincRNA,通过real-time PCR 对 LncRNA MALAT1,LincRNA 0023,LncRNA GAS5,LncRNA ROR,LncBISPR,Lnc PSMB8-AS1,LncH19 以及 LncRP11-998D10.4 进行进一步验证,发现复方叶下珠对LncBISPR具有明显的抑制作用,并且具有量效关系,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.01）;而复方叶下珠在120mg/mL的药物浓度下,能明显提高Lnc PSMB8-AS1和Lnc RP11-998D10.4的表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.001）。而对于LncRNA MALAT1,在30mg/mL和60mg/mL的药物浓度下,复方叶下珠能明显降低其表达水平,而在120mg/mL的条件下,能促进其表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。对于 LncRNA 0023,LncRNA GAS5,LncRNA ROR 和 LncH19,复方叶下珠无明显的抑制或者是促进作用。结论通过体内外实验证明:复方叶下珠能够抑制HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆;能够抑制裸鼠移植瘤生长,降低肿瘤/体重比,提高肿瘤抑制率,说明复方叶下珠具有抗HBV相关HCC的作用。复方叶下珠可以抑制HBx表达,同时,也可以抑制Hedgehog信号通路中SHH,PTCH-1,GLI-1的表达,说明抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC的作用机制之一。铁死亡是铁离子依赖性的,以脂毒性活性氧聚集为特性的非凋亡性细胞坏死形式。复方叶下珠能够提高肿瘤组织中铁离子浓度,降低FTH mRNA表达,提高CISD2 mRNA表达,有可能诱导肿瘤组织发生铁死亡,这也许是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC作用的另外一个机制。此外,Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺能明显提高肿瘤组织中铁离子浓度以及抑制CISD1和GPX4 mRNA,说明Hedgehog信号通路能促进过氧化物反应,有可能参与调节铁死亡过程,因此,Hedgehog信号通路与铁死亡在HBV相关HCC以及HCC中的关系需要进一步深入研究。复方叶下珠能有效抑制LncBISPR的表达,并且呈量效关系,基因测序分析发现,复方叶下珠能对LncBLSPR的三个转录本有明显影响,但是,对于LncBISPR和这三个转录本在HCC以及HBV相关HCC中的作用还不清楚,需要进一步研究。LncRNA MALAT1作为致癌基因,在肿瘤组织中高表达,复方叶下珠能抑制其表达,但是,复方叶下珠是否能通过降低其表达而抑制肿瘤增长尚不清楚。同时,LncPSMB8-AS1在HBV相关HCC中的作用以及是否能作为HBV相关HCC的治疗靶点,需要更多的体内外实验去证实。
马宁[9]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中研究指明第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
张丹[10]（2020）在《基于高效液相色谱-质谱联用技术的HBV相关性肝纤维化血清代谢标志物筛选研究》文中提出目的:探讨乙型肝炎病毒（HBV）相关肝纤维化和慢性乙型肝炎（CHB）患者血清代谢组的差异,寻找与HBV相关性肝纤维化相关的潜在标志物。方法:采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）分析16名HBV相关性肝纤维化和16名CHB患者血清代谢谱;应用主成分分析、变量投影重要性分析值等统计分析及数据库检索,筛选鉴定有差异的代谢物;利用Metabo Analyst 4.0软件对差异代谢物进行代谢通路富集分析,筛选出富集于主要代谢通路上的关键代谢物;利用受试者工作特征曲线（ROC）评价主要关键代谢物作为潜在标志物的诊断性能。结果:（1）共筛选并鉴定出神经鞘磷脂、1-磷酸-鞘氨醇、磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、尿酸、苏氨酸、乳酸、脱氧胆酸、肉桂酸、左旋肉碱（卡尼丁）、（神经）鞘氨醇、神经酰胺、酪氨酸、甘露醇等54种内源性差异代谢产物。（2）代谢通路分析和富集分析发现,神经鞘磷脂、1-磷酸-鞘氨醇、（神经）鞘氨醇、神经酰胺等4种差异代谢物主要富集于鞘脂代谢通路（-log（p）=9.747,impact=0.420）,而磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油等5种差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢通路（-log（p）=10.899,impact=0.063）,磷酸乙醇胺既存在于鞘脂代谢通路,也存在于甘油磷脂代谢通路。（3）ROC分析显示,磷脂酰甘油（PG）的曲线下面积（AUC）为0.914,灵敏度87.5%,特异度93.75%,阳性预测值93.33%,阴性预测值88.24%;1-磷酸-鞘氨醇（S1P）的AUC为0.781,灵敏度75%,特异度81.25%,阳性预测值80%,阴性预测值76.47%;磷脂酰丝氨酸（PS）的AUC为0.883,灵敏度81.25%,特异度87.5%,阳性预测值86.67%,阴性预测值82.35%;磷脂酸（PA）的AUC为0.756,灵敏度68.75,特异度75%,阳性预测值73.33%,阴性预测值70.59%;神经酰胺（Ceramide）的AUC为0.82,灵敏度为93.75%,特异度75%,阳性预测值78.95%,阴性预测值为92.3%;神经鞘磷脂（SM）的AUC为0.855,灵敏度为87.5%,特异度81.25%,阳性预测值82.35%,阴性预测值为86.67%;磷脂酰胆碱（PC）的AUC为0.813,灵敏度为81.25%,特异度62.5%,阳性预测值68.42%,阴性预测值为76.92%;磷脂酰肌醇（PI）的AUC为0.879,灵敏度为87.5%,特异度87.5%,阳性预测值87.5%,阴性预测值为87.5%;（神经）鞘氨醇（Sphingosine）的AUC为0.834,灵敏度81.25%,诊断特异度81.25%,阳性预测值81.25%,阴性预测值81.25%。结论:乙肝肝纤维化患者和慢性乙肝患者两组中代谢谱存在显着差异。有9种富集于鞘脂代谢通路和甘油磷脂代谢通路的主要差异代谢产物,在乙肝纤维化的诊断中具有良好的性能,是乙肝纤维化的潜在代谢指标,可能在乙肝肝纤维化的发生发展中起着重要的作用。
二、“前S1”挑战传统乙肝检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、“前S1”挑战传统乙肝检测（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 |
| 前言 |
| 第一节 抑制剂筛选靶点GRP78 的确定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 以GRP78 为靶点的抑制剂筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 最佳小肽GBP-68 抗病毒机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于免疫捕获的新型HBV分子检测方法 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果及发表的学术论文 |
（3）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（4）基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 肝癌的流行病学研究 |
| 1.2 肝癌的西医治疗现状 |
| 1.3 中医对肝癌的认识及诊疗进展 |
| 1.3.1 中医治疗肝癌的历史沿革 |
| 1.3.2 当代肿瘤学家对肝癌的认识 |
| 1.3.3 中西医结合治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4 参桃软肝方治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4.1 参桃软肝片的组方基础 |
| 1.4.2 参桃软肝方的研究现状 |
| 1.5 高通量测序的发展现状 |
| 1.5.1 高通量测序概述 |
| 1.5.2 转录组测序研究进展 |
| 1.5.3 基因功能富集分析 |
| 1.6 肝癌的表观遗传研究进展 |
| 1.6.1 表观遗传与甲基化 |
| 1.6.2 甲基化在肝癌中的研究现状 |
| 1.6.3 中医证候的DNA甲基化研究现状 |
| 1.7 网络药理学的发展概况 |
| 第二章 基于网络药理学的参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 参桃软肝方冻干粉的制备及质谱分析 |
| 2.1.2 主要药物化学成分搜集及筛选 |
| 2.1.3 药物靶点搜集与整理 |
| 2.1.4 GEO数据库寻找乙肝相关性肝癌的靶点 |
| 2.1.5 参桃软肝方化学成分-作用靶点网络的构建及关键靶点的分析 |
| 2.1.6 基因本体功能(GO)及KEGG通路富集分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 STR质谱分析及STR在网络药理学平台筛选的化合物及其对应靶点筛选结果 |
| 2.2.2 GEO数据库中乙肝相关性肝癌靶点基因获取结果 |
| 2.2.3 STR抗 HBV-HCC靶点基因的获取和GO功能注释及KEGGG通路富集分析 |
| 2.2.4 “药物-活性成分-关键作用靶点-通路”网络构建及分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 参桃软肝方的体外疗效研究 |
| 3.1 细胞实验研究 |
| 3.1.1 STR抑制人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 的增殖 |
| 3.1.2 STR 对人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 迁移的影响 |
| 3.2 STR对 BALB/c裸鼠皮下成瘤模型的抑瘤作用及安全性研究 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于高通量测序筛选STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及机制 |
| 4.1 STR对 HepG2.2.15 荷瘤裸鼠疗效的转录组学研究 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 对HepG2.2.15 荷瘤裸鼠肿瘤组织全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析 |
| 4.2.1 实验步骤 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 转录组测序和WGBS关联分析 |
| 4.3.1 关联基因的筛选 |
| 4.3.2 关联基因的GO注释与KEGG通路富集分析 |
| 4.4 临床HBV-HCC肝癌术后标本WGBS及差异甲基化基因筛选 |
| 4.4.1 临床样本的搜集 |
| 4.4.2 肝癌及癌旁组织样本WGBS测序 |
| 4.4.3 检测结果 |
| 4.5 临床样本WGBS与动物测序结果关联分析 |
| 4.5.1 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因筛选 |
| 4.5.2 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因GO与 KEGG分析 |
| 4.5.3 Hub基因的外部数据库验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）广州献血人群隐匿性乙肝病毒感染者乙肝病毒S基因分子生物学特性及其对乙肝表面抗原表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 广州献血人群隐匿性HBV S区分子生物学特性研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 引物设计与合成 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒核酸提取 |
| 1.2.2 病毒载量的测定(qPCR) |
| 1.2.3 PreS/S和Whole genome片段的巢式PCR扩增 |
| 1.2.4 PreS/S和Whole genome PCR产物的克隆与鉴定 |
| 1.2.5 OBI与对照组序列S基因核苷酸和氨基酸序列的获取 |
| 1.2.6 OBI和对照组样品基因分型 |
| 1.2.7 OBI与对照组S基因核苷酸和氨基酸序列比较分析 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 OBI献血者的一般情况 |
| 1.3.2 OBI样品qPCR和Nested-PCR的检测 |
| 1.3.3 OBI和对照组样品构建系统进化树 |
| 1.3.4 OBI样品的S区序列特征 |
| 1.3.5 OBI相关突变 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 OBI献血者的一般情况 |
| 1.4.2 OBI样品S区序列特征 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 HBV保守型质粒的构建及OBIB基因型相关突变的验证 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 HBVB基因型基因组全长序列获取 |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HBV B基因型保守型质粒构建及验证 |
| 2.2.2 定点诱变 |
| 2.2.3 HepG2细胞培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 细胞上清的收集和细胞裂解 |
| 2.2.6 电化学发光法检测HepG2细胞内、外的HBsAg表达情况 |
| 2.2.7 细胞免疫荧光检测HepG2细胞中的HBsAg表达情况 |
| 2.2.8 HBsAg荧光光密度分析 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pHBV 1.3B测序鉴定结果 |
| 2.3.2 突变型质粒的测序鉴定结果 |
| 2.3.3 突变型质粒转染HepG2细胞内、外的HBsAg表达情况 |
| 2.3.4 突变型质粒转染HepG2细胞内的HBsAg免疫荧光 |
| 2.3.5 E2G转染HepG2细胞中HBsAg分布情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章以及其他成绩 |
| 致谢 |
（6）云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎 |
| 1.2 HBV传播方式 |
| 1.3 HBV的基因组和生命周期 |
| 1.3.1 HBV的复制与转录 |
| 1.4 HBV基因分型与重组变异 |
| 1.5 HBV基因型地理分布情况 |
| 1.5.1 HBV基因型在世界的流行 |
| 1.5.2 HBV基因型在中国的流行 |
| 1.5.3 HBV基因型在云南的流行 |
| 1.6 国内外不同种族/民族基因型流行现状 |
| 1.6.1 全球不同种族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.2 中国不同民族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.3 HBV在云南各少数民族的流行 |
| 1.7 乙型病毒性肝炎的治疗 |
| 1.7.1 乙型肝炎的治疗现状 |
| 1.7.2 乙肝治疗的新型血清标志物HBV PgRNA |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 云南地区HBV在少数民族中的流行 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要的仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乙肝表面抗原(HBs Ag)ELISA检测 |
| 2.3.2 病毒DNA核酸提取 |
| 2.3.3 引物设计与样本巢式PCR扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.3.6 送测序 |
| 2.3.7 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.8 菌落PCR |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 云南省HBV的流行病学 |
| 2.4.2 部分受试样本乙型肝炎表面抗原检测阳性结果 |
| 2.4.3 受试者临床生化分析 |
| 2.4.4 HBV部分基因组序列扩增结果及测序分析 |
| 2.4.5 HBV部分基因组序列的系统发育分析 |
| 2.4.6 云南省HBV基因型在少数民族中的流行分布情况 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 HBV基因分型 |
| 2.5.2 HBV在云南地区少数民族中的分布 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 HBV基因组全长扩增 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 测序 |
| 3.3.4 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HBV基因组序列全长扩增结果及测序分析 |
| 3.4.2 基于全长HBV基因组序列的重组分析 |
| 3.4.3 毒株YNKM91 的全长HBV基因组序列的系统发育和重组分析 |
| 3.4.4 HBV B/I重组毒株(YNKM91)的子区域进化树 |
| 3.4.5 HBV基因型重组序列的重组片段和断点位置分析 |
| 3.4.6 新型HBV亚型C17的全长基因组序列分析 |
| 3.4.7 新型HBV亚型C17的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.4.8 HBV新亚型B10全长基因组序列分析 |
| 3.4.9 新型HBV亚型B10的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 HBV新亚型的鉴定与命名 |
| 3.5.2 HBV重组分析 |
| 3.5.3 HBV耐药突变分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 HBV PgRNA定量检测方法的建立及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 主要的数据分析方法 |
| 4.3 引物设计 |
| 4.3.1 普通PCR引物设计 |
| 4.3.2 荧光定量PCR引物和探针的设计 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 样品准备 |
| 4.4.2 样品RNA提取 |
| 4.4.3 PCR扩增HBV PgRNA目的片段 |
| 4.4.4 PCR电泳检测 |
| 4.4.5 目的片段和质粒载体片段双酶切 |
| 4.4.6 PCR产物及质粒载体的纯化 |
| 4.4.7 送测序 |
| 4.4.8 PET32a-PgRNA质粒的构建 |
| 4.5 阳性重组质粒的提取 |
| 4.6 质粒酶切验证和测序验证 |
| 4.6.1 重组阳性质粒双酶切验证 |
| 4.7 HBV PGRNA产物体外转录及纯化 |
| 4.7.1 HBV PgRNA产物体外转录 |
| 4.7.2 HBV PgRNA体外转录产物的纯化 |
| 4.8 荧光定量PCR反应条件的建立 |
| 4.9 荧光定量PCR的反应体系和反应条件 |
| 4.10 结果 |
| 4.10.1 阳性质控品的构建 |
| 4.10.2 Taq_Man的灵敏性实验 |
| 4.10.3 Taq_Man的重复性实验 |
| 4.10.4 Taq_Man的特异性实验 |
| 4.10.5 两种HBV pgRNA检测方法的评价 |
| 4.10.6 临床样本的检测 |
| 4.11 讨论 |
| 4.11.1 Taq Man探针法的灵敏性、特异性和重复性的评价 |
| 4.11.2 临床样本的检测结果评价 |
| 4.12 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（7）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 乙肝相关性肝癌中的研究综述 |
| 第一节 HBX在乙肝相关性肝癌中研究综述 |
| 第二节 HEDGEHOG信号通路在肝脏疾病中的研究进展 |
| 第三节 长链非编码RNA在HBV相关HCC中的作用 |
| 第四节 中医对肝癌的认识 |
| 第二章 复方叶下珠通过抑制HBX激活HEDGEHOG信号通路防治HCC的作用机制研究 |
| 第一节 HEPG2-HBX稳定细胞株的构建 |
| 一、质粒构建 |
| 二、病毒包装 |
| 第二节 复方叶下珠通过抑制HBX激活HEDGEHOG信号通路防治HCC的体外实验 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 试验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 第三节 复方叶下珠抑制HBX介导HEDGEHOG信号通路的抗肝癌作用的体内实验 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 试验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 第四节 复方叶下珠对HEPG2-HBX细胞中LINRNA表达的影响 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（9）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于高效液相色谱-质谱联用技术的HBV相关性肝纤维化血清代谢标志物筛选研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 肝纤维化的血清标志物诊断进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、“前S1”挑战传统乙肝检测（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究[D]. 刘俊叶. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制[D]. 贺凡. 广州中医药大学, 2020(09)
- [5]广州献血人群隐匿性乙肝病毒感染者乙肝病毒S基因分子生物学特性及其对乙肝表面抗原表达的影响[D]. 王淏. 南方医科大学, 2020
- [6]云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价[D]. 刘莹. 昆明理工大学, 2020(05)
- [7]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)
- [8]复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究[D]. 栗昀. 广州中医药大学, 2020(06)
- [9]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [10]基于高效液相色谱-质谱联用技术的HBV相关性肝纤维化血清代谢标志物筛选研究[D]. 张丹. 西南医科大学, 2020(02)