一、转Bt抗虫工程菌的离体生物测定及发酵工艺研究(论文文献综述)
何玲敏[1](2017)在《吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究》文中研究指明随着我国杨树种植面积的逐年增加,以及在杨树造林过程中林木抚育、管理、保护、防治不当等原因,杨树病虫害的发生日趋严重,同时阻碍了我国林业的生产和发展。我国杨树病虫害的综合治理仍以化学防治为主导,然而化学农药的长期使用不但防治效果变差,而且给自然环境造成一定的污染和残留。因此,利用微生物代替化学农药来防治植物病虫害越来越受林业保护工作者的青睐。植物内生细菌定殖于健康植物体内,与寄主植物在长期进化过程中形成和谐联合关系,并对寄主植物具有抗病、促生、固氮和生物修复等生防潜力,是潜在的天然生物防治资源。此外,内生细菌还可作为外源基因的良好载体,通过基因工程技术将外源抗病、杀虫基因导入内生细菌中,提高植物抗病虫害等能力的同时不改变植物自身的基因组。因此,利用植物有益内生细菌及其工程菌株促进植物生长,并提高植物的抗病虫害能力已成为植物病虫害生物防治的研究热点。课题组前期从杨树干部分离到一株杨树内生细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007,该菌株不仅能促进杨树生长,还对杨树溃疡病具有一定防治效果,是一株安全的杨树溃疡病生防菌株。洋葱伯克氏菌群Burkholderia cepacia complex(Bcc)的许多菌株对多种植物病原真菌具有拮抗作用,并已被广泛应用与植物病害的生物防治,但目前国内外有关Bcc工程菌构建的报道尚不多见。本研究以B.pyrrocinia JK-SH007菌株为研究对象,分别将外源抗病、杀虫基因导入JK-SH007中,构建具有促生、抗病、抗虫多重生防能力的高效生防工程菌。同时,对工程菌株JK-SH007E1在杨树根际产生的微生态效应进行研究,初步评估工程菌株释放到环境后的生物安全性。根据同源重组原理,分别将枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因Chi113、苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry218、苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白基因vip3A和松材线虫的几丁质酶基因Bxchi插入到pHKT2载体上的启动子与gfp报告基因之间,成功构建了四个重组质粒pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi。质粒遗传稳定性试验表明,除重组质粒pHKT2-Bxchi外,其余三个重组质粒均有较高的遗传稳定性,其中重组质粒pHKT2-Chi113的遗传稳定性最高。利用热激法将pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi四个重组质粒分别转化JK-SH007感受态细胞,获得了四株工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4。这四株工程菌在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光信号,并且四个外源基因在mRNA水平均得到过表达,而在蛋白水平只有工程菌JK-SH007E1检测到外源基因的表达。与野生型菌株JK-SH007相比,工程菌JK-SH007E1产生的几丁质酶活性及其对杨树溃疡病菌的抑菌活性和拮抗能力均得到显着提高。通过对工程菌JK-SH007E1在杨树体内的定殖规律研究,发现工程菌JK-SH007E1能够以较快的速度进入杨树体内,并能在杨树体内长期稳定地定殖。GFP标记法观察工程菌JK-SH007E1在杨树无菌苗体内的定殖,发现JK-SH007E1在杨树组织细胞内和细胞间隙均有分布。此外,工程菌JK-SH007E1的引入明显增强了杨树的光合作用能力和加快了杨树的生长速度。对工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4的生长特性进行研究,并与野生菌JK-SH007进行比较,结果表明外源基因的导入并未影响原有的菌落特征及细胞形态,但外源重组质粒的导入在一定程度上减缓了宿主菌的生长速度。作为转基因微生物,工程菌JK-SH007E1释放到自然环境中前,必须对其生物安全性进行充分评估。本研究同时利用生物化学法、Biolog生态板法和16S rRNA高通量测序技术,充分评估工程菌JK-SH007E1的引入对杨树根际土壤产生的微生态效应。通过测定杨树根际四种主要土壤酶活性,发现工程菌JK-SH007E1的引入增强了杨树根际的土壤酶活性,尤其是对土壤脱氢酶活性的促进作用尤为显着;同时提高了土壤的肥力,从而促进杨树生长。Biolog生态板分析结果表明,工程菌JK-SH007E1在一定程度上提高了杨树根际土壤微生物的整体活性,丰富了土壤微生物种群及其功能多样性,但随着接种时间的延长促进作用逐渐减弱。16S rRNA高通量测序结果表明工程菌JK-SH007E1的引入会引起杨树根际微生物群落结构发生变化,但该影响会随接种时间的延长而变弱。以上研究结果均表明,从长期来看工程菌JK-SH007E1的应用对杨树根际微生物多样性和种群结构不构成潜在威胁或威胁较小。因此,将工程菌JK-SH007E1释放到环境中是安全可行的。该研究为杨树溃疡病生物防治提供了高效生防菌株,并为今后工程菌JK-SH007E1的安全应用奠定了理论基础。
李茂业[2](2012)在《对褐飞虱高毒力的真菌菌株筛选及其应用研究》文中研究指明褐飞虱Nilaparvata lugens St l是我国及东南亚地区一种远距离迁飞性水稻重要害虫。为了寻求对该虫生物防治的新途径,本论文在既有资料的基础上,进一步筛选对褐飞虱高毒力的真菌菌株,系统研究了所得高毒力黄绿绿僵菌Metarhiziumflavoviride(Mf)菌株的生物学特性、对褐飞虱不同虫态的毒力以及致病机理,研制了该菌株乳悬剂剂型,并对黄绿绿僵菌(Mf)菌株的固相发酵培养基组分的配方进行了优化,为防治褐飞虱真菌杀虫剂的开发与规模化生产提供有价值的技术资料。本研究主要获得以下结果:1、从褐飞虱N. lugens罹病虫体上新分离出的一种黄绿绿僵菌菌株M. flavoviride(Mf),与实验室保存的黄绿绿僵菌、金龟子绿僵菌和白僵菌3种菌种5个菌株作对比,研究了在SDAY和PDA培养基上的培养性状,并测定了它们对褐飞虱成虫的毒力。结果表明:在SDAY培养基上,6个菌株菌落特征差异明显,Mf菌株菌落直径增长量最大,产孢量最高,分别为2.59mm,17.34×107孢子/cm2。与其它菌株相比差异显着。Mf菌株在SDAY培养基上生生长优于PDA,Mf菌株对褐飞虱成虫具有很强的毒力,以1.0×108孢子/mL的孢子液接种到褐飞虱成虫体表上,累积校正死亡率达83.8%,LT50为4.47d,致死率明显高于其他真菌。2、用分子生物学主方法对褐飞虱成虫高毒力真菌菌株进行了鉴定。采用氯化苄法、CTAB法以及裂解液法分别提取了该菌的基因组DNA;以ITS1和ITS4为绿僵菌通用引物,对供试菌株的rDNA ITS序列进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和序列分析,并在核酸序列数据库中进行同源序列对比。实验结果表明裂解液法提取的该种绿僵菌的基因组DNA纯度高且质量好,氯化苄法次之,CTAB法不适合提取此菌的基因组DNA;分子鉴定结果显示该菌为绿僵菌属黄绿绿僵菌(M. flavoviride)。明确侵染褐飞虱的绿僵菌种类,进而掌握其生物学征和对寄主的致病性。3、对新分离鉴定黄绿绿僵菌Mf82菌株,将其与实验室保存的8株绿僵菌M. spp.一起,分别测定其对褐飞虱成虫毒力和几丁质酶活力,并用扫描电镜观察了Mf82菌株侵入昆虫表皮的过程和体表的形态变化,进而分析侵入能力与几丁质酶的相关性。结果表明:菌株Mf82累计校正死亡率和几丁质酶活力均最高,为82.1%和9.78U/mg,与其他菌株差异显着。同时,扫描电镜照片显示Mf82分生孢子既可以由褐飞虱体壁节间膜和凹陷处侵入,还可以从含几丁质较多的胸部背板侵入,可见筛选的Mf82菌株对褐飞虱成虫致病力强。比较9株绿僵菌菌株菌落生长速度、产孢初始时间、产孢量和萌发率显示,Mf82菌株具有生长速度快、产孢初始时间短、萌发率高和产孢量大等优点。4、利用黄绿绿僵菌M. flavoviride82菌株五种浓度5296-5368、1055-1121、585-623、126-144和22-31孢子/mm2侵染不同龄期褐飞虱成虫和若虫并以1100孢子/mm2孢子悬浮液侵染褐飞虱怀卵雌成虫、雌成虫、雄成虫和不同龄期卵。结果表明:其不同浓度孢子液对褐飞虱3个发育阶段有不同程度的致病力,毒力大小顺序为成虫>高龄若虫>低龄若虫。同时,Mf82菌株对不同性别褐飞虱成虫的敏感性顺序为怀卵雌成虫>雌成虫>雄成虫。黄绿绿僵菌孢子液对各处理稻株褐飞虱产卵痕部位、卵粒均有侵染作用,10d侵染率分别为66.7%和51.2%,卵龄越低,侵染效果越好,卵龄为0.5d时侵染率最高。本研究表明黄绿绿僵菌Mf82菌株对褐飞虱成虫、若虫和卵均有较强的致病性,5、利用扫描电镜观察了黄绿绿僵菌M. flavoviride菌株分生孢子对褐飞虱的侵染过程。结果表明:分生孢子多分布在褐飞虱节间膜、体表的褶皱凹陷等部位,主要以芽管或产生附着胞入侵,然后在体表长出菌丝和产孢。菌体进入寄主血腔后,利用体腔内营养大量增殖、扩散并侵染褐飞虱卵巢中的卵块。侵染卵块的菌丝虽被体液包裹但依然能继续生长,使卵粒失活,抑制害虫下代的数量。通过体表及体内的侵染过程,可直观地表现黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染能力和侵入方式,为评价该菌的杀虫作用和应用前景提供了证据。6、用新分离出的黄绿绿僵菌M. flavoviride(Mf82)菌株与实验室保存的黄绿绿僵菌、金龟子绿僵菌和白僵菌3种菌种9个菌株作对比,测定了它们的悬乳剂对褐飞虱成虫的毒力。结果表明:Mf82菌株对褐飞虱成虫的毒力最高,以1.0×108个孢子/mL的孢子悬乳剂喷雾接种到褐飞虱成虫体表上,累积死亡率高达81.7%,LT50为4.6d,致病效果显着高于其他受测菌株。在此基础上研制了黄绿绿僵菌悬乳剂,并研究了其对褐飞虱的致病力。结果表明:随着黄绿绿僵菌浓度的增加,褐飞虱的累计死亡率增加,在浓度为1048个孢子/mm2时,累计死亡率达到85.0%。利用时间-剂量-死亡率模型对数据进行处理,所建模型均顺利通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验,表明模型拟合良好,并由模型估计出了该剂型对褐飞虱的致死剂量与致死时间。在接种后第7d和第9d,LC50值分别为2.1×103、9.9×102个孢子/mm2, LC90分别为7.8×104、3.7×104个孢子/mm2。黄绿绿僵菌悬乳剂对褐飞虱的致死时间与对数剂量相关,供试菌剂LT50值随着对数剂量的增加而递减,对数剂量由7.0增加到8.0时,LT50由8.9d降为5.7d。可见该黄绿绿僵菌悬乳剂对褐飞虱具有较强的毒力。7、以大米粉、黄粉虫蛹壳、花生壳和瓜子壳为培养基组成成分,研究黄绿绿僵菌固相发酵最佳配方。在固相发酵条件下,利用Design-Expert软件分析各因素对产孢量的显着性,采用响应面法对黄绿绿僵菌发酵培养基配方进行研究和优化。结果表明:影响产孢量的显着成分为黄粉虫蛹壳;黄绿绿僵菌发酵最佳配方组合为:0.25g大米、0.14g黄粉虫蛹壳、1.00g花生壳、0.25g瓜子壳。在此最佳组合为培养基的条件下得到产孢量为100.013×108个/mL菌液,比初始设计提高了31.7%。使用本研究优化后的培养基配方,可以降低生产成本,得到较高产量的孢子,且在生产时无环境污染,对以后的大规模生产非常有利。综上所述:本研究研究筛选所得黄绿绿僵菌Mf82菌株对褐飞虱成虫、若虫和卵均有较强的致病性,且生产容易、使用方便,是一株极具应用潜力的生防真菌。
苏俊平[3](2012)在《苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究》文中研究说明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种可以形成芽胞和晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,属于芽胞杆菌属,在自然界中分布广泛,很多高毒力或具有特异杀虫活性的新菌株不断被发现。本论文围绕苏云金芽胞杆菌新菌株的筛选、鉴定、评价及杀虫基因克隆等方面开展了一系列的研究,主要结果如下:1.从河北省、内蒙古及吉林省等不同地区共采集367份土样,利用醋酸钠-抗生素筛选法并结合复红染色分离鉴定苏云金芽胞杆菌,共得到75株Bt菌株,出菌率为12.27%。这75株野生菌株的伴胞晶体有菱形、球形、米粒形和不规则形等。2. PCR-RFLP基因型分析结果表明,这75株Bt菌含有cry1、cry1I、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry8N、cry9、cry13-14、cry18、cry22、cry26-28、cry34-35、cyt2和vip3A 18种基因型。其中cry2基因含量最高,占总菌株数的43.24%,cry1I基因位居第二,占36.49%。还有12株菌未鉴定出基因型。3.通过生物测定,发现了菌株L-2、L-10、L-13、L-17、L-22、SC-39和SC-40对二点委夜蛾(Athetis lepigone)的幼虫均表现出较高的杀虫活性,基因型分析表明这些菌株均同时含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、vip3A这四种杀虫基因,初步证实cry1Ac是对二点委夜蛾起主要作用的基因。4. Bt YX-1菌株对梨小食心虫(Grapholita molesta)、苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana)、苹掌舟蛾(Phalera flavescens)苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)以及小菜蛾(Plutella xylostella)等果树及蔬菜害虫表现出广谱杀虫活性,Bt YX-1菌株对这些害虫幼虫的毒力均高于Bt HD-1菌株。Bt YX-1菌株产生菱形伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明该菌株表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa和60kDa;基因型鉴定表明,Bt YX-1菌株含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、cry34-35和vip3Aa基因。Bt YX-1的最佳培养基配方为:黄豆饼粉32g/L、花生饼粉30g/L、鱼粉16g/L、蛋白胨6g/L、玉米粉18g/L、酵母粉6g/L、蔗糖1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、KH2PO4 1g/L、CaCO3 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.06g/L、余者用水补足。5. L-27菌株产生球形伴胞晶体,SDS-PAGE检测显示主要表达130kDa和60kDa的蛋白,基因型分析表明该菌株含有cry8、cry8N、cry22、cry26-28基因。利用PCR方法从菌株L-27中分离克隆了cry8的全长基因。序列分析显示,cry8全长基因含有3525个碱基,编码由1175个氨基酸组成的蛋白质。通过在NCBI上应用BLAST软件比较相似性显示,与已发表的登录号为AY551093.1的cry8基因同源性达99%,已提交GenBank登记,登录号为JQ389477。该基因已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Fa3。
吴孔明,陈万权,倪汉祥,文丽萍[4](2011)在《植物保护学学科研究现状与展望》文中指出一、引言植物保护学科(P1ant Protection)属于农学学科门类之中的一级学科,是研究植物病害、虫害、杂草、鼠害等有害生物的生物学特性和发生危害规律及其与环境因子的互作机制,以及监测预警和防控技术的一门综合性学科,它与生物领域中的植物学、动物学、微生物学、遗传学、生态学、细胞生物学、生物化学和分子生物学以及生命科学、化学工程等学科交叉与融合,形成了较完整的植物保护学科体系。植物保护学科在国民经济建设和社
陈建峰[5](2008)在《中国苏云金杆菌杀虫剂商品化生产、质量标准化及应用研究技术成果回顾与展望》文中指出苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫剂是世界公认对人、畜禽、水生生物和自然生态环境安全、无污染的微生物杀虫剂,自20世纪80年代至今,始终是国内外微生物农药研究开发的热点和全球微生物杀虫剂市场的主体。"七五"、"八五"期间,我国科学家依托国家科技攻关项目支持,开展科研大协作,研究攻克了困扰我国20多年的Bt产品质量检测技术,成为世界上第三个实现Bt产品质量标准化的国家。在Bt商品化生产技术创新方面,引进选育优良生产菌株,研究解决了发酵单位低、噬菌体污染引起的倒灌率高、后处理工艺落后、产品剂型单一,田间防治效果不稳定等关键技术瓶颈,使我国Bt杀虫剂的生产工艺、发酵水平、产品质量和应用范围取得了历史性跨跃,迅速缩短了与欧美发达国家Bt商品化技术水平的差距,为促进发展无公害农业,保障农产品安全生产发挥出独有的技术贡献。
杨春平[6](2008)在《卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究》文中指出植物内生菌作为筛选农用抗生素的一类资源微生物,在农药的研究与开发中越来越受到重视。为了开发卫矛科植物内生菌资源,以期发现新的具有农药研究价值的微生物,本论文对4种卫矛科植物内生菌进行了研究,主要涉及菌种的分离、筛选、菌株鉴定、菌株诱变选育、代谢产物活性及活性成分分离以及发酵条件优化等的研究,取得了如下结果:(1)分别采用组织块培养法和匀浆法从4种新鲜卫矛科植物中分离到161株内生真菌和28株内生放线菌,通过杀虫活性、抑菌活性及遗传稳定性实验,从中筛选到能产生抑菌活性成分的内生真菌3株(Hd3、2QR1和1F8)和内生放线菌4株(a4、a5、c4和YDG17)。其中,菌株Hd3和2QR1的代谢产物也具有杀虫活性。(2)利用引入链霉素耐药性,分别对5株无抑菌活性和1株弱抑菌活性的卫矛科植物内生放线菌进行诱突,共获得链霉素变异株301株。对301株变异菌株发酵产物以枯草芽孢杆菌为指示菌进行活性筛选,获得具有显着抑菌活性且遗传稳定的突变株2株,即YDG05-44和YDG09-32。室内生物测定结果表明,YDG05-44和YDG09-32菌株的发酵产物对其它几种细菌及植物病原真菌也具有显着的抑菌活性。(3)对YDG17、YDG09-32和Hd3菌株的发酵条件进行了优化研究,确定了最佳培养基组成及培养条件。响应面分析及正交实验结果表明,YDG17菌株发酵的摇瓶培养基配方为:葡萄糖32.00 g/L,小米28.77 g/L,蛋白胨3.00 g/L。发酵条件为:pH 7,250mL三角瓶装60mL发酵液,接入6×107cfu/mL菌量,32℃培养120h。YDG09-32菌株发酵的摇瓶培养基配方为:乳糖21.06 g/L,小米20.82 g/L,牛肉膏4.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.38g/L。发酵条件为:pH 7~9,250mL三角瓶装80mL发酵液,接入6×106cfu/mL菌量,29℃培养96h。Hd3菌株的摇瓶培养基配方为:葡萄糖24.71g/L,MgSO4·7H2O 1.08 g/L,土豆244.17 g/L。发酵条件为:pH 6~7,250mL三角瓶装90mL发酵液,接入9×103cfu/mL菌量,31℃培养9d。(4)研究了YDG17菌株的代谢产物。室内生测结果表明,YDG17菌株的发酵液对几种供试细菌和病原真菌均有一定的抑制作用。对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichis coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为27.0,27.0,15.3,11.3,14.0mm。对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.niveum)和桃腐烂病菌(Cytospora leucostoma)抑制菌丝生长的EC50(以发酵液中的干物质计)值分别为259.98、336.13、100.72、470.11和198.58mg/L;对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)和番茄灰霉病菌(B.cinerea)抑制孢子萌发的EC50值为分别为151.67、220.69和87.84mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。通过捷克八溶剂系统纸色谱测定YDG17菌株发酵液中主要活性成分为碱性水溶性抗生素。采用离子交换法,通过抑菌活性追踪法,分离得到YDG17菌株发酵液的主要抑菌活性组分YA,ESI-MS/MS对YA化学成分进行分析,结果表明YA中的主要活性成分为链丝菌素类化合物,通过MS/MS谱图和母离子碎片峰信息,以及与标准化合物谱图进行对比,鉴定其中5个化合物为N-乙酰化链丝菌素D、N-乙酰化链丝菌素C、链丝菌素D、链里定酸-链丝菌素E和链丝菌素F。(5)研究了YDG09-32菌株的代谢产物。离体活性测定结果表明,YDG09-32菌株的发酵滤液和菌丝体中均有含有抑菌活性成分,不仅对供试细菌有一定的抑制作用,同时对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、玉米弯孢菌(Curvularia lunta)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)和苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等植物病原真菌有较强的抑制活性。通过Doskocilova八溶剂系统分析,判断YDGA09-32菌株发酵滤液和菌丝体提取物中的抑菌活性成分为同一类物质,即放线菌素类抗生素。YDG09-32菌株代谢的抑菌活性成分对光、热、酸和碱均有较好的稳定性。发酵产物在pH 5~11之间处理3h,或在90℃处理30min以及日光照射10d后,对抑菌活性均无明显影响。采用大孔吸附树脂吸附、硅胶柱层析及薄层制备等技术对YDG093-32菌株发酵滤液中抑菌成分进行分离纯化,得到Bh1~Bh7 7个组分,生测结果表明,仅组分Bh1、Bh5和Bh6对枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌活性。Bh1~Bh7组分由于纯度不够,未能进行结构鉴定。(6)研究了Hd3菌株的代谢产物。分别对Hd3菌株菌丝体甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物及发酵滤液乙酸乙酯萃提物进行了杀虫、抑菌活性研究。结果表明,Hd3菌株的杀虫活性物质主要存在于菌丝体乙酸乙酯提取物中,在1000mg/L时,对粘虫3龄幼虫的24h死亡率为100%;抑菌活性物质主要在发酵液中,其乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、苹果炭疽病菌(C.gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制菌丝生长的EC50值分别为77.7,74.9、75.6、138.3、166.0和130.9 mg/L,对棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、小麦根腐病菌(B.sorokiniana)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制孢子萌发EC50值分别为184.4,102.8,154.5和79.7mg/L;盆栽试验结果表明,Hd3菌株发酵滤液乙酸乙酯萃取物在浓度为2000mg/L时,对小麦白粉病的保护和治疗效果分别为61.9%和81.6%。对Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物中的杀虫活性成分进行分离,得到一个纯化合物H4.5,经波谱分析,鉴定为2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚,该化合物对3龄粘虫(平均体重3.75mg)的LD50为3.78μg/头。通过活性追踪,采用硅胶柱层析、HPLC制备对菌株发酵滤液乙酸乙酯萃提物中抑菌活性成分进行分离,得到H03~H09,H20 8个化合物,生测结果表明,化合物H03、H04、H20具有较强的抑菌活性。经波谱分析,化合物H03、H04、H05、H07、H08和H20分别鉴定为geodin、chlorotrypacidin、methyl asterrate、methyl dichloroasterrate、methyl chloroasterrate和asterric acid,均为首次从内生黄柄曲霉代谢物中分离到的化合物。(7)通过对YDG17、YDG09和Hd3菌株形态学及分子生物学鉴定,确定Hd3菌株为曲霉属真菌:YDG09和YDG17菌株均为链霉菌属放线菌。YDG17菌株与菌株S.vinaceusdrappuss的16SrDNA同源性为99%,同时,菌株在形态特征、培养特征、生理生化特征等方面与模式菌株也比较相似。因此,将YDG17菌株鉴定为Streptomyces vinaceusdrappuss。YDG09菌株与模式菌株S.rubrolavendulae的16SrDNA同源性为99%。除了YDG09菌株不利用阿拉伯糖、甘露醇而利用鼠李糖及在克氏一号培养基上难于生长与S.rubrolavendulae菌株存在差异外,在生理生化及形态特征上两株菌均相似。因此,建议将YDG09菌株定为S.rubrolavendulae菌株的一个变种(Streptomycesrubrola vendulae var euonymus)。Hd3菌株与模式菌株Aspergillus flavipes的ITS区序列同源性为100%,在形态特征等方面两株菌也相似,因此,鉴定Hd3菌株为黄柄曲霉Aspergillus flavipes。
高芬[7](2008)在《抗真菌农用抗生素KA08的研究》文中提出本文针对近年来烟草生产上危害严重的烟草赤星病(Alternaria alternata(Freis)Keissler),筛选获得了多株具有自主知识产权的拮抗链霉菌,并对具有优良特性的拮抗菌进行了分类鉴定、发酵条件优化、抗菌物质的分离纯化、抑菌防病机理及温室盆栽防效和安全性测定等方面的系统研究,开发出了一种极富研究和应用价值,且性质显着不同于多氧霉素的广谱农用抗生素KA08,对解决生产上有效防治链格孢属真菌病害的生防制剂品种单一、病原菌对多氧霉素的耐药性等问题,具有重要意义。研究结果如下:1、从采自辽宁、黑龙江、河北、山西等地的36份土样中分离到371株链霉菌。以烟草赤星病菌为靶标,利用活体对峙拮抗、发酵液抑菌活性测定和离体叶片防效试验相结合的多重筛选法,得到4株抑菌效果明显、抑菌谱较广且效果稳定的拮抗链霉菌:菌株182-2、163、88和127。拮抗菌发酵液理化性质测定表明:4菌株对温度、紫外线、自然光、酸碱的耐受性,发酵液的耐贮性和菌株的遗传特性虽有差异,但均较为稳定。其中菌株182-2显示出了良好的抑菌防病效果和优良的稳定性,有开发应用价值。2、采用经典分类和分子分类相结合的方法,对菌株182-2和菌株163进行了分类鉴定,明确了两菌株的分类地位,菌株182-2为链霉菌属可可链霉菌辽宁变种(Streptomyces cacaoi var.liaoningensis),属灰褐类群;菌株163为链霉菌属细黄链霉菌辽宁变种(Streptomyces microflavus var.liaoningensis),属粉红孢类群,并首次报道了细黄链霉菌对烟草赤星病菌的拮抗作用。3、通过培养基优化设计,获得了菌株182-2的次生代谢产物抗生素KA08的最佳发酵培养基配方:可溶性淀粉100g,花生饼粉24.0 g,酵母粉2.0 g,NH4NO4 2.0 g,CaCO32.7g,NaCl 2.7 g,水1000ml,pH7.2。抗生素KA08摇床发酵的最佳条件为:制备种子液的菌种种龄为斜面培养5d,接种量4.5%(种子液浓度108cfu/ml),初始pH7.0,装液量40ml/三角瓶(250ml),发酵温度28℃,发酵时间5d。对代谢过程中菌体浓度、可溶性糖、pH变化的检测结果表明:抗生素KA08来自能量代谢所用的基质,但其形成是在与初级代谢分开的次级代谢中。同时,抗生素产生和菌丝体生长有各自的最适pH,应分别加以严格控制才能优化发酵过程。4、通过捷克Doskochilova 8溶剂系统及pH纸层析证明:抗生素KA08为一类碱性水溶性抗生素,含有多个活性组分;Betina溶媒系统纸层析证明:KA08极性大,极易溶于水,且随溶剂极性的减小,溶解度降低。分析纸电泳试验中各组分的移动距离和方向,可知抗生素KA08含有多个强碱或弱碱性活性组分,属于链霉素型或放线菌素型。根据上述性质,在活性追踪下,采用草酸酸化、丙酮沉淀、活性炭吸附、大孔树脂富集、离子交换柱层析和Pharmadex LH20柱层析精制,以及二次薄层层析分离,对抗生素KA08进行了分离纯化,得到一个抗菌活性较高的组分Ha,四个活性较弱的组分a、c、d和Be。经HPLC纯度检测,组分Ha纯度较低,其两个主要成分的含量分别为62.90%和17.53%;组分a、c、d和Be的纯度分别为97.53%、98.79%、97.64%和96.06%,达到了结构测定的标准。紫外和红外谱图分析表明:组分a、c、d为氨基糖苷类物质,组分Be则更接近于核苷类物质的特点。官能团反应显示:组分Be和d含有醛基和不饱和键;组分a含有氨基酸、肽类或蛋白质结构;组分c含有不饱和键,及肽类或蛋白质结构。液质联用测定表明:组分c是分子量为269.0的小分子物质。总体分析:抗生素KA08不同于生产上广泛使用的可可链霉菌阿索变种产生的多氧霉素。5、抑菌防病机理研究表明:抗生素KA08能显着抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发,并对菌丝和孢子萌发后的芽管有明显致畸作用。抗生试验表明:KA08对赤星病菌主要起抑菌作用,杀菌作用很弱或基本无杀菌效果。抑菌机理研究发现:该物质能导致菌丝体内电解质泄漏,同时,细胞膜上麦角甾醇的含量显着降低,菌丝内和培养液中脂质过氧化产物-丙二醛的含量明显升高,证明其作用位点在病菌细胞膜上。它还可显着抑制菌丝体内蛋白质的含量,但不能通过产生几丁质酶对菌丝细胞壁中的几丁质产生影响。抗生素KA08处理能诱导烟草防御酶系中POD、PPO、PAL、SOD、CAT活性的提高并在一定程度上诱导产生PR蛋白。同时,KA08处理还可以诱导抗病信号通路中NPR1和PR1基因的表达,且PR1基因的表达有持效性,推测其可能启动了水杨酸防御反应信号传导途径。但ERF1基因的表达未被检测到。6、温室盆栽防效试验证明:采用保护性处理时,抗生素KA08溶液(2.0mg/ml)对烟草赤星病的防效为60.63%,同时,对具有伤口的叶片有轻微损害。安全性测定表明:KA08有较好的体内运转能力。当浓度≥2.0mg/ml,通过根部吸收时,KA08对烟草3~4叶期幼苗有轻微致萎作用;浓度<2.0mg/ml时表现安全。当浓度≥2.0mg/ml,KA08叶面喷施对成株期植株没有影响,同时具有一定的刺激生长作用。总之,抗生素KA08是一种具有优良特性的农用抗生素,它的开发和应用符合现代植物保护的生防理念,具有重要的实际应用价值。
胡南[8](2007)在《Bt毒蛋白cryIAb/Ac基因在毕赤酵母GS115中的表达研究》文中认为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是农业生产中运用得非常广泛的一种重要的杀虫微生物。由于在使用过程中存在一些不足和害虫抗药性的产生,人们通过生物技术的手段将Bt毒蛋白基因转入其它植物或微生物中,扩展了Bt的杀虫谱并降低害虫对其的抗性。本研究将Bt毒蛋白基因CryIAb/Ac克隆到毕赤酵母GS115中,构建带有cryIAb/Ac基因的工程菌。运用primer5软件设计带有限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物,通过PCR的方法扩增cryIAb/Ac基因带编码毒蛋白3个结构域的1.8kb序列,并对这两条基因片段进行了亚克隆,构建出载体pMD-cryIAb/Ac。将建载体pMD-cryIAb/Ac进行序列测定,其中cryIAb基因有2个碱基发生改变,编码一个氨基酸发生改变,但不编码毒蛋白的活性中心;cryIAc基因与原基因序列相同。选择毕赤酵母表达载体pPIC9K,利用限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-cryIAb/Ac和表达载体pPIC9K,再通过T4连接酶连接,构建出分泌型重组载体pPIC9K-CryIAb/Ac。用电转化方法转化到毕赤酵母GS115,筛选出阳性转化子。PCR鉴定证明cryIAb/Ac基因已成功转入毕赤酵母GS115中。在甲醇的诱导下,CryIAb/Ac毒蛋白都得到了有效分泌和表达。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析,cryIAb/Ac基因表达的重组蛋白都在70kDa左右。当诱导pH值为6.6时,摇瓶诱导发酵72小时的蛋白表达量都达到最大。生物测定结果表明,CryIAb/Ac毒蛋白对甜菜夜蛾和二化螟都有较强的毒杀作用。CryIAc毒蛋白对甜菜夜蛾的LC50为0.28μg/ml,CryIAb毒蛋白对甜菜夜蛾的LD50为0.76μg/ml,CryIAb毒蛋白对二化螟的LC50为0.40μg/ml,CryIAc毒蛋白对二化螟的LC50为0.28μg/ml。
沈丽珍[9](2007)在《马铃薯内生细菌StC01的鉴定及其促生作用初步研究》文中进行了进一步梳理内生细菌是存在于植物体内与宿主之间具有共生关系的寄生菌,已在许多植物中发现。研究表明,内生细菌在宿主的生长和环境适应中起重要作用。在马铃薯上,已有从田间生长的植株上内生细菌分离的报道。本实验室在保存的马铃薯组培苗中发现内生细菌的存在,为了研究该内生细菌对组培苗生长的影响及机制,本研究首先对该内生细菌进行了鉴定,然后分析了其对宿主生长的影响。结果如下:从马铃薯cv92028-1中分离到一株内生细菌,菌体短杆状,菌落呈圆形黄色。经过生理生化分析及16S rRNA基因测序鉴定,属于短小杆菌属Curtobacterium,命名为StC01。对StC01在植株体内的分布研究表明,该细菌在根组织中种群密度最高,茎组织次之,叶片中种群密度最低。将StC01接种到非宿主植物中后,种群密度经历了一个先升高后下降最后达到一个稳定的数值的过程。为了从带菌植株中获得无菌苗,本研究采用溶菌酶法进行除菌。溶菌酶对内生细菌的MIC为0.4mg mL-1,在本试验中,合适于马铃薯组培苗茎段溶菌酶处理浓度为2 mg mL-1。StC01对马铃薯组培苗的生长和结薯都会产生影响。在促生方面,与对照相比,接种StC01的马铃薯组培苗,不论是栽培种还是野生种,都表现出明显的生长变快。接种StC01的栽培种马铃薯,培养5周后,平均株高增加17.85%,整株平均鲜重、单株平均地上部分鲜重、根鲜重分别增加17.56%、25.87%和2.26%。整株干重、地上部分干重、根部干重增加24.46%、38.13%和1.67%。接种StC01的的野生种A组培苗的地上部分干重和鲜重增加量分别是13.72%和10.63%,与全株的增加量(分别是16.29%和10.39%)相似,根部的干重和鲜重增加量都相对较大(分别是24.52%和14.05%)。对接种StC01的组培苗进行结薯诱导试验,发现StC01对微型薯结薯数和重量都有影响,与对照相比,带菌茎段外植体平均结薯数减少6.80%,薯块平均鲜重减少70.18%,平均干重减少70.84%。
冯亮[10](2007)在《透明颤菌血红蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及对其发酵特性的影响》文中认为苏云金芽胞杆菌(Bt)在发酵过程中需要消耗大量氧气用以维持细胞正常代谢和杀虫蛋白的合成。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种来源于原核生物的氧结合蛋白。本研究将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达于Bt中,通过提高细胞对氧气的利用能力,达到促进菌体生长和产物合成的目的。1.本研究构建了包含luxS启动子和vgb基因的整合载体pEG491-vgb+,利用该载体,将vgb基因整合到Bt菌株BMB171的染色体上,构建了菌株BMB171-VHb+。再将携带cry1Ac10基因的质粒pHT304-Kanr-cry转入BMB171-VHb+中,得到了菌株BMB667-VHb+。vgb和cry1Ac10基因在BMB667-VHb+中都得到了表达。同时构建了不表达VHb的对照菌株BMB667-VHb-。2.在高、中、低3种供氧条件的发酵实验中,BMB667-VHb+的细胞浓度(CFU)分别为对照菌株的0.94,1.23,和1.59倍;其晶体蛋白(ICP)产量分别为1.22,1.63和3.13倍;BMB667-VHb+的ICP产量最大值出现也比对照菌株提前4-8h。高、低两种装液量摇瓶发酵中,VHb表达菌株与对照相比,其对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫的LC50值分别下降了36.6%和10.0%。3.在临界氧浓度(COC)实验中,临界氧浓度最高出现在第4h;第4h时,BMB667-VHb+的COC为12%,较对照菌株COC18%下降了33%。发酵过程中,BMB667-VHb+最大摄氧率(OUR)值达到68.6 mmol/Lh;较对照菌株的最大OUR值39.6 mmol/Lh提高73%;BMB667-VHb+的最大呼吸强度(Qo2)为18.6mmol/gh与对照的呼吸强度14.8 mmol/gh相比,有20.4%的增长。在相同发酵条件下,VHb表达菌株和对照菌株分别摄取了通入氧气量的3.1%和2.2‰VHb的表达菌株比对照菌株多利用了41%的氧气。BMB667-VHb+和BMB667-VHb-的最大比生长速率分别为0.783h-1和0.801h~(-1),葡萄糖半饱和常数分别为0.272g/L和0.297g/L。4.本研究结果表明,vgb在Bt中表达以后,促进了菌数和晶体产量的增长,产物较菌数的增长明显,促进效果随着供氧条件的降低而增加。与氧代谢有关的菌株发酵特性也因vgb的表达而改变,COC、OUR和Qo2都得到提高,这些发酵特性的改变增强了菌株摄取氧气的能力。5.在利用浊度仪监测发酵罐菌体浓度实验中,首先得到消除搅拌和通气影响浊度值的的校正公式。然后建立了在稳定期以前,浊度值和细胞浓度的对应关系。利用有、无晶体两种Bt菌株发酵的比较,测定出单位菌体、芽胞、晶体对浊度值的影响比例为1、1.3、0.5。根据这一比例,可以监测到芽胞的形成,并能够判断芽胞形成比例,预测发酵结束时间。
二、转Bt抗虫工程菌的离体生物测定及发酵工艺研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转Bt抗虫工程菌的离体生物测定及发酵工艺研究(论文提纲范文)
(1)吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
abstract |
前言 |
第一章 文献综述 |
1 洋葱伯克霍尔德氏菌研究进展 |
1.1 洋葱伯克霍尔德氏菌概述 |
1.2 Bcc的生防作用 |
1.3 Bcc研究展望 |
2 植物内生细菌研究进展 |
2.1 植物内生细菌的概念 |
2.2 植物内生细菌的分类及分离鉴定 |
2.2.1 传统的分离培养法 |
2.2.2 分子生物学方法 |
2.3 植物内生细菌的生物学功能及其作用机制 |
2.3.1 与病原菌竞争生态位和营养物质 |
2.3.2 产生抗菌活性物质 |
2.3.3 诱导系统抗性(ISR) |
2.4 内生细菌在植物病虫害生物防治中的应用 |
2.5 杨树内生细菌的研究进展 |
3 杨树溃疡病研究现状 |
3.1 杨树溃疡病的发生及危害 |
3.2 杨树溃疡病的种类 |
3.3 杨树溃疡病的防治现状 |
4 杨树虫害研究现状 |
4.1 杨树虫害的发生及危害 |
4.2 杨树虫害的防治现状 |
5 植物内生细菌工程菌及其生物安全性评价 |
5.1 植物内生细菌工程菌研究进展 |
5.2 工程菌的生物安全性评价的内容 |
6 本研究的立题背景和研究目的 |
6.1 立题背景 |
6.2 研究目的 |
第二章 B. pyrrocinia JK-SH007抗病、抗虫生防工程菌构建 |
1 材料与方法 |
1.1 供试质粒、菌株及培养条件 |
1.2 培养基 |
1.3 构建重组质粒 |
1.3.1 质粒pHKT2的提取 |
1.3.2 制备线性载体 |
1.3.3 制备插入片段 |
1.3.3.1 启动子部分序列的克隆与纯化 |
1.3.3.2 gfp基因的克隆与纯化 |
1.3.3.3 Chi113基因的克隆与纯化 |
1.3.3.4 cry218基因的克隆与纯化 |
1.3.3.5 vip3A基因的克隆与纯化 |
1.3.3.6 Bxchi基因的克隆与纯化 |
1.3.4 重组质粒的构建及验证 |
1.3.4.1 pHKT2-Chi113重组质粒的构建及验证 |
1.3.4.2 pHKT2-cry218重组质粒的构建及验证 |
1.3.4.3 pHKT2-vip3A重组质粒的构建及验证 |
1.3.4.4 pHKT2-Bxchi重组质粒的构建及验证 |
1.4 制备B. pyrrocinia JK-SH007感受态细胞 |
1.5 重组质粒转化B. pyrrocinia JK-SH007感受态细胞 |
1.6 阳性转化子的筛选与鉴定 |
1.7 外源基因在mRNA水平的表达 |
1.7.1 工程菌株的总RNA提取 |
1.7.2 反转录PCR |
1.7.3 实时荧光定量PCR(qPCR) |
1.8 外源基因在蛋白质水平的表达 |
1.8.1 蛋白粗提液的制备 |
1.8.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达 |
1.8.3 Western Blot(WB)检测蛋白表达 |
1.8.4 融合蛋白的质谱分析 |
1.9 重组质粒的遗传稳定性测定 |
1.10 工程菌株的生长特性 |
1.10.1 工程菌株的菌落及细胞形态观察 |
1.10.2 工程菌株的生长曲线绘制 |
2 结果与分析 |
2.1 含外源抗病、杀虫基因的重组质粒的构建 |
2.2 重组质粒转化B. pyrrocinia JK-SH007感受态细胞及阳性克隆的筛选 |
2.2.1 JK-SH007转化子的荧光观察 |
2.2.2 JK-SH007转化子的PCR验证 |
2.3 外源基因在mRNA水平的表达 |
2.4 四株工程菌的WB分析 |
2.5 四株工程菌的遗传稳定性研究 |
2.6 工程菌株与野生菌株生长特性的比较分析 |
3 结论与讨论 |
第三章 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1对杨树溃疡病病原真菌的拮抗能力 |
1 材料与方法 |
1.1 供试菌株及培养条件 |
1.2 培养基 |
1.3 胶体几丁质的制备 |
1.4 JK-SH007和JK-SH007E1菌株的几丁质酶活及抑菌活性测定 |
1.4.1 标准曲线的绘制 |
1.4.2 几丁质粗酶液的制备 |
1.4.3 几丁质酶活的测定及比较分析 |
1.4.4 抑菌活性的测定及比较分析 |
1.5 JK-SH007和JK-SH007E1菌株对杨树溃疡病菌的平板对峙试验 |
1.6 对峙平板上杨树溃疡病菌菌丝形态的显微观察 |
2 结果与分析 |
2.1 工程菌JK-SH007E1产几丁质酶能力及其产生的几丁质酶活性测定 |
2.2 工程菌JK-SH007E1对杨树溃疡病菌的抑制作用 |
2.3 JK-SH007及工程菌JK-SH007E1对杨树溃疡病菌菌丝形态的影响 |
3 结论与讨论 |
第四章 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1在杨树体内的定殖及促生性 |
1 材料与方法: |
1.1 供试细菌及培养条件 |
1.2 供试植株 |
1.3 培养基 |
1.4 杨树无菌苗的准备 |
1.5 杨树实生苗的准备 |
1.6 细菌接种剂的制备 |
1.7 杨树无菌苗和实生苗的接种与培养 |
1.8 工程菌株JK-SH007E1在杨树实生苗体内的定殖动态 |
1.9 荧光显微镜下观察工程菌株JK-SH007E1在杨树无菌苗体内的定殖 |
1.10 工程菌株JK-SH007E1对杨树实生苗的生长效应 |
2 结果与分析 |
2.1 工程菌JK-SH007E1在杨树实生苗体内的定殖动态 |
2.2 工程菌JK-SH007E1在杨树无菌苗体内的定殖观察 |
2.3 工程菌JK-SH007E1对杨树实生苗的生长效应 |
3 结论与讨论 |
第五章 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1在杨树根际产生的微生态效应 |
1 材料与方法 |
1.1 供试细菌及培养条件 |
1.2 供试植株 |
1.3 培养基 |
1.4 杨树实生苗的准备 |
1.5 细菌接种剂的制备 |
1.6 杨树实生苗的接种 |
1.7 杨树根际土壤酶活性的测定 |
1.7.1 土壤磷酸酶活性的测定 |
1.7.2 土壤转化酶活性的测定 |
1.7.3 土壤脱氢酶活性的测定 |
1.8 Biolog生态板对杨树根际微生物群落多样性的分析 |
1.916S rRNA高通量测序技术对杨树根际微生物多样性和种群结构分析 |
2 结果与分析 |
2.1 工程菌JK-SH007E1对杨树根际主要土壤酶活性的影响 |
2.2 Biolog生态板法研究工程菌JK-SH007E1对杨树根际微生物多样性的影响 |
2.2.1 工程菌JK-SH007E1对杨树根际微生物整体活性的影响 |
2.2.2 工程菌JK-SH007E1对杨树根际微生物功能多样性的影响 |
2.3 16S高通量测序技术分析工程菌JK-SH007E1对杨树根际微生物多样性和种群结构的影响 |
2.3.1 OTUs分析及物种注释 |
2.3.1.1 OTUs分析 |
2.3.1.2 物种相对丰度组成及聚类分析 |
2.3.2 杨树根际微生物组成的复杂度分析 |
2.3.2.1 稀释曲线的绘制 |
2.3.2.2 α-多样性分析 |
2.3.2.3 Rank abundance曲线分析 |
2.3.3 不同土壤样本间微生物组成的比较分析 |
2.3.3.1 β-多样性分析 |
2.3.3.2 土壤样本间的主坐标分析 |
3 结论与讨论 |
第六章 全文总结和展望 |
1 全文总结 |
1.1 B. pyrrocinia JK-SH007抗病、抗虫生防工程菌构建 |
1.2 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1对杨树溃疡病病原真菌的拮抗能力 |
1.3 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1在杨树体内的定殖及促生性 |
1.4 工程菌B. pyrrocinia JK-SH007E1在杨树根际产生的微生态效应 |
2 论文创新点 |
3 问题与展望 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
参考文献 |
(2)对褐飞虱高毒力的真菌菌株筛选及其应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 文献综述 |
1.1 稻飞虱的危害与防治现状 |
1.2 利用昆虫病原虫生真菌防治害虫 |
1.3 绿僵菌及其生物学特性 |
1.4 绿僵菌对昆虫的致病机理 |
1.5 虫生真菌的发酵工艺 |
1.6 本课题选题的意义与总体思路 |
第二章 几种虫生真菌菌株的培养性状及其对褐飞虱的毒力 |
引言 |
2.1 材料与方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 不同培养基上菌落的形态特征 |
2.2.2 不同培养基对菌落生长速度及产孢量的影响 |
2.2.3 不同菌株对褐飞虱成虫的毒力 |
2.3 讨论 |
第三章 一种褐飞虱病原真菌的分子生物学鉴定 |
引言 |
3.1 材料与方法 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 三种方法提取 DNA 结果的电泳图谱比较 |
3.2.2 三种方法提取 DNA 浓度比较 |
3.2.3 PCR 扩增产物的分子量 |
3.2.4 核糖体 DNA ITS 序列分析与同源性比对 |
3.3 讨论 |
第四章 褐飞虱高毒力绿僵菌菌株的筛选及其致病性研究 |
引言 |
4.1 材料与方法 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 绿僵菌不同菌株对褐飞虱成虫的致病性 |
4.2.2 不同菌株的几丁质酶活力比较 |
4.2.3 Mf82 和 Ma25 菌株侵染褐飞虱体表的电镜观察 |
4.2.4 生物学特性研究 |
4.3 讨论 |
第五章 黄绿绿僵菌 Mf82 菌株对不同虫态褐飞虱的毒力 |
引言 |
5.1 材料与方法 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 不同种真菌菌株对褐飞虱成虫的致病作用 |
5.2.2 黄绿绿僵菌 Mf82 菌株对不同虫态褐飞虱的毒力和侵染症状 |
5.2.3 黄绿绿僵菌 Mf82 菌株孢子液对褐飞虱怀卵雌成虫、雌成虫和雄成虫的毒力 |
5.2.4 黄绿绿僵菌 Mf82 菌株对褐飞虱卵的侵染 |
5.3 讨论 |
第六章 黄绿绿僵菌对褐飞虱侵染过程的扫描电镜观察 |
引言 |
6.1 材料和方法 |
6.2 结果与分析 |
6.2.1 分生孢子在褐飞虱体表的侵染过程 |
6.2.2 分生孢子侵染褐飞虱体内组织和体内卵块的观察 |
6.3 讨论 |
第七章 黄绿绿僵菌 Mf82 悬乳剂对褐飞虱作用的时间-剂量-死亡率模型分析 |
引言 |
7.1 材料与方法 |
7.2 结果与分析 |
7.2.1 不同菌株对褐飞虱成虫的毒力 |
7.2.2 黄绿绿僵菌 Mf82 悬乳剂对褐飞虱作用的时间-剂量-死亡率模型分析 |
7.2.3 黄绿绿僵菌 Mf82 悬乳剂对褐飞虱的时间-剂量-死亡率模型模拟 |
7.3 讨论 |
第八章 响应面法优化黄绿绿僵菌固相发酵培养基 |
引言 |
8.1 材料与方法 |
8.2 结果与分析 |
8.2.1 方差分析 |
8.2.2 主效应分析 |
8.2.3 两因素间的交互效应分析 |
8.2.4 黄绿绿僵菌发酵培养基的优化及结果验证 |
8.3 讨论 |
第九章 结论与创新点 |
9.1 结论与讨论 |
9.1.1 褐飞虱高毒力真菌菌株筛选 |
9.1.2 对褐飞虱高毒力绿僵菌菌株的分子生物学鉴定 |
9.1.3 黄绿绿僵菌 M. flavoviride 对褐飞虱的致病机理 |
9.1.4 真菌悬乳剂对褐飞虱的致病效果 |
9.1.5 利用响应面法优化黄绿绿僵菌(Mf82)菌株的固相培养基配方 |
9.2 论文创新之处 |
参考文献(References) |
致谢 |
作者简介 |
(3)苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 苏云金芽胞杆菌 |
1.1.1 苏云金芽胞杆菌的简介 |
1.1.2 苏云金芽胞杆菌的生境与分布 |
1.1.3 苏云金芽胞杆菌的分离方法 |
1.1.4 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体形态与生物活性 |
1.1.5 苏云金芽胞杆菌的毒素 |
1.1.6 苏云金芽胞杆菌的晶体杀虫蛋白 |
1.1.7 苏云金芽胞杆菌发酵培养基的筛选及优化 |
1.2 苏云金芽胞杆菌的应用 |
1.2.1 杀虫剂的发展及存在的问题 |
1.2.2 Bt 转基因植物的应用 |
1.3 二点委夜蛾的研究进展 |
1.4 本研究的目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料与仪器 |
2.1.1 土样 |
2.1.2 菌株与质粒 |
2.1.3 供试昆虫 |
2.1.4 试剂 |
2.1.5 仪器设备 |
2.2 研究方法 |
2.2.1 土样的采集 |
2.2.2 菌株的筛选 |
2.2.3 菌株形态观察 |
2.2.4 菌种的保存 |
2.2.5 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE 分析 |
2.2.6 PCR-RFLP 基因分析 |
2.2.7 生物活性测定 |
2.2.8 YX-1 菌株生长特性观察 |
2.2.9 YX-1 菌株发酵液不同组分杀虫活性的测定 |
2.2.10 YX-1 菌株发酵培养基的筛选 |
2.2.11 L-27 菌株cry8 基因的克隆 |
3 结果与分析 |
3.1 Bt 菌株筛选及形态特征 |
3.2 Bt 菌株的SDS-PAGE 分析 |
3.3 Bt 菌株的基因型鉴定 |
3.4 Bt 菌株对二点委夜蛾的杀虫活性 |
3.5 YX-1 菌株的特性 |
3.5.1 YX-1 菌株的杀虫活性 |
3.5.2 YX-1 菌株的生长特性 |
3.5.3 YX-1 菌株上清液的增效作用 |
3.5.4 YX-1 菌株发酵培养基的筛选 |
3.6 cry8 基因的克隆与分析 |
4 讨论 |
4.1 Bt 野生菌株的筛选 |
4.2 Bt 菌株基因型的鉴定 |
4.3 对二点委夜蛾有特异性杀虫活性的菌株 |
4.4 YX-1 菌株的研究 |
4.5 cry8 基因的克隆 |
4.6 后续研究的设想与存在的问题 |
5 结论 |
参考文献 |
附录:核苷酸序列及氨基酸序列 |
在读期间发表的学术论文 |
作者简历 |
致谢 |
(6)卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 植物内生菌研究概况 |
1.1.1 植物内生菌的定义及其异质性 |
1.1.2 内生菌的研究简史 |
1.1.3 植物内生菌的普遍存在性和生物多样性 |
1.1.4 内生菌的潜在应用价值 |
1.2 植物内生菌活性代谢产物研究进展 |
1.2.1 抗菌活性物质 |
1.2.2 抗肿瘤活性物质 |
1.2.3 杀虫活性物质 |
1.2.4 植物激素类物质 |
1.2.5 其它活性物质 |
1.3 卫矛科植物及内生菌研究概况 |
1.4 产农用抗生素内生菌研究中存在的问题及策略 |
1.5 立题依据及研究内容 |
1.6 拟采用的技术路线 |
第二章 4种卫矛科植物内生菌的分离及活性菌株筛选 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 主要试剂与仪器 |
2.1.3 培养基 |
2.1.4 供试昆虫 |
2.1.5 供试真菌及细菌 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 植物材料的表面消毒 |
2.2.2 内生菌的分离培养 |
2.2.3 菌株的纯化和归类 |
2.2.4 内生菌的液体培养 |
2.2.5 生物活性测定样品准备 |
2.2.6 内生菌代谢产物生物活性测定 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 表面消毒效果 |
2.3.2 内生菌分离结果 |
2.3.3 内生菌代谢产物生物活性测定 |
2.3.4 能代谢活性产物内生菌形态归类及遗传稳定性测定 |
2.4 小结 |
第三章 利用链霉素耐药性诱变筛选抑菌活性菌株 |
3.1 试验材料 |
3.1.1 供试菌株 |
3.1.2 培养基 |
3.1.3 仪器及试剂 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 突变菌株获得 |
3.2.2 变异菌株的发酵培养 |
3.2.3 变异菌株活性筛选 |
3.2.4 变异菌株遗传稳定性的测定 |
3.2.5 遗传稳定抗性菌株杀菌活性测定 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 供试菌株对链霉素的MIC及链霉素耐药性菌株的获得 |
3.3.2 链霉素耐药性变异菌株活性筛选结果 |
3.3.3 链霉素变异菌株YDG05-44,YDG09-11,YDG09-28,YDG09-32和YDG09-34发酵液杀菌活性的传代稳定性 |
3.3.4 链霉素耐药性变异菌株YDG05-44和YDG09-32及其原始菌株发酵液抑菌活性比较 |
3.3.5 耐药性变异菌株YDG05-44和YDG09-32及其出发菌株形态比较 |
3.4 小结与讨论 |
第四章 YDG17、YDG09-32和HD3菌株发酵条件优化 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 实验菌株 |
4.1.2 生测菌株 |
4.1.3 试剂及原料 |
4.1.4 培养基 |
4.2 方法 |
4.2.1 平板培养 |
4.2.2 摇瓶发酵 |
4.2.3 发酵产物活性评估 |
4.2.4 发酵培养基优化实验设计及分析 |
4.2.5 初始pH值影响测定 |
4.2.6 发酵条件优化试验 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 发酵培养基配方的初步选择 |
4.3.2 YDG17发酵培养基配方筛选结果 |
4.3.3 YDG09-32菌株发酵培养基配方筛选结果 |
4.3.4 Hd3菌株发酵培养基配方筛选结果 |
4.3.5 发酵条件优化 |
4.4 小结及讨论 |
第五章 YDG17菌株发酵液抑菌活性及活性成分研究 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 供试菌株 |
5.1.2 培养基 |
5.1.3 供试生物 |
5.1.4 主要试剂与仪器 |
5.2 试验方法 |
5.2.1 液体培养及产物处理 |
5.2.2 抑菌活性测定 |
5.2.3 YDG17菌株发酵液中抑菌活性成分分离 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 YDG17菌株发酵液的抑菌活性 |
5.3.2 YDG17菌株发酵滤液中抑菌活性成分分离 |
5.3.3 YDG17菌株发酵滤液活性馏分YA中化合物的结构鉴定 |
5.4 小结及讨论 |
5.4.1 YDG17菌株发酵液抑菌生物活性 |
5.4.2 YDG17菌株发酵液中抑菌活性成分分离及结构鉴定 |
第六章 YDG09-32菌株发酵产物的抑菌活性及活性成分研究 |
6.1 实验材料 |
6.1.1 供试菌株 |
6.1.2 培养基 |
6.1.3 供试菌 |
6.1.4 主要试剂与仪器 |
6.2 试验方法 |
6.2.1 液体培养及产物处理 |
6.2.2 抑菌活性测定 |
6.2.3 YDG09-32菌株抑菌活性成分的初步定性 |
6.2.4 YDG09-32菌株发酵液抑菌活性成分稳定性测定 |
6.2.5 菌株发酵液中抑菌活性物质分离纯化 |
6.3 结果与分析 |
6.3.1 YDG09-32菌株发酵产物抑菌活性测定 |
6.3.2 YDG09-32菌株发酵产物抑菌活性物质的初步定性 |
6.3.3 YDG09-32菌株发酵产物中活性成分稳定性测定 |
6.3.4 大孔吸附树脂分离 |
6.3.5 一级柱层析分离 |
6.3.6 二级柱层析分离 |
6.3.7 Pre-TLC分离 |
6.4 小结与讨论 |
6.4.1 关于YDG09-32菌株发酵产物活性物质的分离 |
6.4.2 关于发酵液中抗生素粗提物的获得 |
6.4.3 关于YDG09-32产生抗生素的潜在应用价值 |
第七章 HD3菌株代谢产物的杀虫抗菌活性研究 |
7.1 实验材料 |
7.1.1 供试菌株 |
7.1.2 培养基 |
7.1.3 供试昆虫 |
7.1.4 供试病原菌 |
7.1.5 供试植物 |
7.1.6 主要试剂与仪器 |
7.2 试验方法 |
7.2.1 液体培养 |
7.2.2 发酵产物活性成分的提取 |
7.2.3 杀虫活性测定 |
7.2.4 抑菌离体活性测定 |
7.2.5 小麦白粉盆栽试验 |
7.2.6 Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物杀虫活性成分的分离 |
7.2.7 Hd3菌株发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌活性成分的分离 |
7.2.8 化合物的结构鉴定 |
7.3 结果与分析 |
7.3.1 Hd3菌株代谢产物的杀虫活性 |
7.3.2 Hd3菌株代谢产物的离体杀菌活性 |
7.3.3 Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物杀虫活性分离结果 |
7.3.4 Hd3菌株发酵液乙酸乙酯萃取物抑菌成分分离结果 |
7.3.5 化合物的结构鉴定 |
7.3.6 化合物生物活性测定 |
7.4 小结及讨论 |
7.4.1 Hd3菌株代谢产物的生物活性 |
7.4.2 Hd3菌株代谢产物活性成分分离 |
7.4.3 关于化合物2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚 |
7.4.4 关于asterric acid类化合物 |
第八章 菌种鉴定 |
8.1 试验材料 |
8.1.1 供试菌株 |
8.1.2 试剂 |
8.1.3 仪器 |
8.1.4 培养基 |
8.2 试验方法 |
8.2.1 形态特征观察 |
8.2.2 培养特征观察 |
8.2.3 YDG17和YDG09菌株生理生化特征性测定 |
8.2.4 YDG17和YDG09菌株细胞壁的化学成分分析 |
8.2.5 分子鉴定 |
8.3 结果与分析 |
8.3.1 形态特征 |
8.3.2 培养特征 |
8.3.3 生理生化特征 |
8.3.4 细胞壁化学成分分析 |
8.3.5 分子鉴定 |
8.4 小结及讨论 |
8.4.1 关于内生放线菌菌株YDG09和YDG17种属地位的确定 |
8.4.2 真菌ITS区序列结构应用及内生真菌菌株Hd3种属地位的确定 |
论文总结 |
论文的创新点 |
参考文献 |
附图 |
致谢 |
作者简介 |
(7)抗真菌农用抗生素KA08的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一章 抗真菌农用抗生素的研究进展 |
1 抗真菌农用抗生素的发展历史和概况 |
2 几种在生产上应用较广的抗真菌农用抗生素 |
3 农用抗生素的定义和特点 |
4 农用抗生素的作用机理 |
5 农用抗生素的筛选和获得 |
6 农用抗生素高产菌的选育 |
7 农用抗生素的分离纯化 |
8 抗生素的结构分析 |
9 农用抗生素的结构改造 |
10 抗真菌农用抗生素发展中存在的问题和展望 |
第二章 烟草赤星病拮抗链霉菌的分离与多重筛选 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 链霉菌的分离与纯化 |
2.2 拮抗链霉菌的筛选与获得 |
3 小结 |
第三章 拮抗链霉菌发酵液抑菌效果及理化性质测定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 拮抗菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制效果 |
2.2 发酵液理化性质的测定 |
3 小结 |
第四章 拮抗链霉菌的鉴定 |
第一节 形态学分类研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 气生菌丝和孢子丝的形态观察 |
2.2 培养特征观察 |
2.3 生理生化特性测定结果 |
2.4 菌种鉴定 |
3 小结 |
第二节 分子分类鉴定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 拮抗菌株的16S rDNA序列分析 |
2.2 拮抗菌株的系统发育分析 |
3 小结 |
第五章 抗生素KA08发酵条件的优化 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 发酵培养基主要营养成分的筛选 |
2.2 均匀设计优化发酵培养基 |
2.3 发酵条件对抗生素产量的影响 |
2.4 发酵过程中的代谢变化 |
3 小结 |
第六章 抗生素KA08的初步提取及鉴定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 抗生素的初步提取及活性测定 |
2.2 抗生素类型的鉴别 |
3 小结 |
第七章 抗生素KA08的分离纯化及类型分析 |
第一节 抗生素KA08的分离纯化 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 抗生素KA08的初步提取 |
2.2 溶媒萃取法提取抗生素KA08 |
2.3 活性炭吸附法提取抗生素KA08 |
2.4 大孔树脂吸附法富集抗生素KA08 |
2.5 离子交换层析法分离纯化抗生素KA08 |
2.6 薄层层析法分离纯化抗生素KA08 |
2.7 Pharmadex LH20柱层析法精制各组分 |
2.8 分离物纯度的测定 |
3 小结 |
第二节 抗生素KA08各组分类型的初步分析 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 官能团反应试验 |
2.2 各组分的紫外吸收光谱 |
2.3 各组分的红外吸收光谱 |
2.4 液质联用测定组分C的分子量 |
3 小结 |
第八章 抗生素KA08防病机理研究 |
第一节 抗生素KA08对病原菌的作用机理研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 抗生素KA08的抑菌效果和特性 |
2.2 抗生素KA08对赤星病菌的作用方式 |
2.3 抗生素KA08对赤星病菌的作用机理 |
3 小结 |
第二节 抗生素KA08诱导烟草防卫反应的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 抗生素KA08对烟草防御酶系的影响 |
2.2 抗生素KA08对烟草病程相关蛋白的诱导作用 |
3 小结 |
第三节 抗生素KA08诱导烟草抗病信号通路的初步研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 烟草总RNA的提取 |
2.2 目的基因的RT-PCR扩增 |
3 小结 |
第九章 抗生素KA08的温室防效试验及安全性测定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 菌株182-2发酵液的温室盆栽防病效果 |
2.2 抗生素KA08的温室盆栽防病效果 |
2.3 抗生素KA08对烟草幼苗的影响 |
2.4 抗生素KA08对烟草成株期植株的影响 |
3 小结 |
第十章 结论与讨论 |
1 拮抗链霉菌的分离与多重筛选 |
2 拮抗链霉菌发酵液抑菌效果和理化性质测定 |
3 拮抗链霉菌的分类鉴定 |
4 抗生素KA08发酵条件的优化 |
5 抗生素KA08的初步提取及鉴定 |
6 抗生素KA08的分离纯化及类型分析 |
7 抗生素KA08的防病机理研究 |
8 抗生素KA08的温室防效试验及安全性测定 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间参与的课题和发表的文章 |
(8)Bt毒蛋白cryIAb/Ac基因在毕赤酵母GS115中的表达研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一部分 前言 |
1 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)研究进展 |
1.1 苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的分类 |
1.2 苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的结构、功能及作用机理 |
1.3 苏云金芽胞杆菌的抗性对策研究 |
1.3.1 抗性管理研究 |
1.3.2 转基因植物和工程菌的构建 |
1.3.3 融合基因的构建 |
2 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统简介 |
2.1 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统的优点 |
2.2 影响毕赤酵母(Pichia pastoris)中外源蛋白表达的因素及优化策略 |
2.2.1 外源基因序列的内在特性 |
2.2.2 表达条件 |
第二部分 实验部分 |
1 实验材料 |
1.1 菌株与质粒 |
1.2 供试昆虫 |
1.3 酶与试剂 |
1.4 培养基及储备液 |
1.4.1 培养基 |
1.4.2 储备液 |
1.5 试剂与缓冲液 |
1.5.1 质粒抽提试剂 |
1.5.2 质粒快速检测试剂 |
1.5.3 酵母总DNA抽提液 |
1.5.4 SDS-PAGE电泳试剂 |
1.5.5 蛋白质浓度测定试剂 |
1.6 常用储液 |
2 实验方法 |
2.1 pMD-cryIAb/Ac质粒的构建 |
2.1.1 pUC18-cryIAb/Ac质粒的抽提及纯化 |
2.1.2 引物设计与PCR扩增 |
2.1.3 凝胶回收PCR产物 |
2.1.4 目的基因连接到pMD-18T载体 |
2.1.5 大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞的制备 |
2.1.6 大肠杆菌(E.coli)DH5α的转化 |
2.1.7 大肠杆菌质粒的快速检测 |
2.1.8 cryIAb/Ac基因的PCR检测 |
2.2 重组质粒pPIC9K-cryIAb/Ac的构建 |
2.2.1 重组质粒pMD-cryIAb/Ac和穿梭载体pPIC9K的抽提 |
2.2.2 重组质粒pMD-cryIAb/Ac和穿梭载体pPIC9K的线性化及纯化回收 |
2.2.3 表达载体pPIC9K-cryIAb/Ac的构建 |
2.3 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 |
2.3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
2.3.2 线性化重组质粒pPIC9K-cryIAb/Ac |
2.3.3 毕赤酵母的电转化 |
2.3.4 表达菌株的PCR检测确定 |
2.3.5 cryIAb/Ac基因在毕赤酵母中的诱导表达 |
2.4 SDS-PAGE凝胶的制备及发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析 |
2.4.1 SDS-PAGE凝胶的制备 |
2.4.2 SDS-PAGE电泳分析 |
2.5 重组酵母CryIAb/Ac毒蛋白杀虫活性检测 |
2.5.1 Lowry法检测重组酵母CryIAb/Ac毒蛋白含量 |
2.5.2 以甜菜夜蛾1龄幼虫做杀虫活性测定 |
2.5.3 以二化螟2龄幼虫做杀虫活性测定 |
3 实验结果与分析 |
3.1 Bt毒蛋白CrylAb/Ac基因的PCR扩增 |
3.2 Bt毒蛋白crylAb/Ac基因在T载体上的克隆 |
3.3 重组质粒pPIC9K-CryIAb/Ac的构建及鉴定 |
3.4 酵母的电转化及重组子的筛选 |
3.4.1 重组质粒的pPIC9K-CryIAb/Ac的线性化 |
3.4.2 重组子的筛选 |
3.4.3 重组酵母总DNA中的CryIAb/Ac基因PCR检测 |
3.5 CryIAb/Ac基因的诱导培养及SDS-PAGE电泳分析 |
3.6 CryIAb/Ac毒蛋白含量检测 |
3.7 CryIAb/Ac毒蛋白杀虫活性检测 |
4 小结 |
5 讨论 |
参考文献 |
致谢 |
(9)马铃薯内生细菌StC01的鉴定及其促生作用初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩写词表及其英汉对照 |
前言 |
第一章 文献综述 |
1 内生细菌的生态学 |
1.1 内生细菌的来源 |
1.2 侵入模式 |
1.3 内生细菌种群研究 |
1.4 影响内生细菌种群的因素 |
2 内生细菌对宿主的有益影响 |
2.1 固氮作用 |
2.2 促进植物生长 |
2.3 对植物病害的控制作用 |
2.4 内生细菌对病原线虫和害虫的控制 |
2.5 生物修复 |
2.6 解毒作用 |
3 内生细菌代谢产物 |
3.1 植物内生细菌产生的抗菌物质 |
3.2 植物内生细菌产生的植物生长激素 |
3.3 氨基酸 |
3.4 多糖 |
3.5 铁载体 |
4 内生菌及其活性产物的实际应用 |
4.1 生物肥料的开发 |
4.2 生防剂的开发 |
4.3 基因工程载体的构建 |
4.4 植物内生细菌的研究展望 |
5 内生细菌的检测方法 |
5.1 培养的方法 |
5.2 抗性标记 |
5.3 印迹法 |
5.4 电子显微镜 |
5.5 免疫印迹和ELISA定量分析 |
5.6 核酸杂交 |
5.7 放射自显影 |
6 植物内生细菌的去除 |
6.1 抗生素除菌 |
6.2 溶菌酶除菌 |
第二章 内生细菌的分离与鉴定 |
1. 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果与分析 |
2.1 内生细菌分离结果 |
2.2 内生细菌StC01的形态描述及生理生化实验 |
2.3 生长曲线 |
2.4 16S rRNA基因特异性扩增 |
2.5 16S rRNA基因系统发育分析 |
3 讨论 |
第三章 马铃薯内生细菌生态和除菌实验 |
1. 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果与分析 |
2.1 内生细菌种群的组织特异性 |
2.2 接种内生细菌的组培苗中细菌种群的动态变化 |
2.3 细菌分离物对溶菌酶的敏感度 |
2.4 溶菌酶控制细菌生长的活性 |
2.5 组培苗生长与增殖 |
3 讨论 |
第四章 内生细菌对马铃薯生长的影响 |
1. 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果与分析 |
2.1 内生细菌StC01对马铃薯cv92065-1组培苗的促生作用 |
2.2 内生细菌StC01对和野生种A组培苗的促生作用 |
2.3 内生细菌对微型薯诱导的影响 |
3 讨论 |
全文总结 |
创新点 |
参考文献 |
附录I: 培养基基本成分 |
附录II: 试剂 |
攻读硕士学位期间发表的研究论文 |
致谢 |
(10)透明颤菌血红蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及对其发酵特性的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
1 前言 |
1.1 苏云金芽胞杆菌 |
1.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫活性谱 |
1.1.2 鞭毛抗原血清型分类 |
1.1.3 杀虫晶体蛋白分类 |
1.1.4 苏云金芽胞杆菌的活性因子 |
1.1.4.1 杀虫晶体蛋白 |
1.1.4.2 苏云金素 |
1.1.4.3 Vip蛋白 |
1.1.4.4 芽胞 |
1.1.4.5 几丁质酶 |
1.1.4.6 双效菌素 |
1.1.4.7 其他活性成分 |
1.1.5 苏云金芽胞杆菌的应用 |
1.1.6 外源基因在苏云金芽胞杆菌中的表达 |
1.1.7 供氧在苏云金芽胞杆菌发酵过程中的重要意义 |
1.2 透明颤菌血红蛋白及其研究应用进展 |
1.2.1 血红蛋白简介 |
1.2.2 透明颤菌概述 |
1.2.3 透明颤菌血红蛋白的结构与特性 |
1.2.4 VHb的生理功能 |
1.2.5 透明颤菌血红蛋白基因的克隆、调控与表达 |
1.2.6 透明颤菌血红蛋白的应用 |
1.2.6.1 VHb在大肠杆菌中的应用 |
1.2.6.2 VHb在芽胞杆菌中的应用 |
1.2.6.3 VHb在酵母菌中的应用 |
1.2.6.4 VHb对霉菌发酵生产的影响 |
1.2.6.5 VHb在链霉菌中的作用 |
1.2.6.6 VHb在植物细胞中的表达 |
1.2.6.7 VHb的表达对降解毒害物质的作用 |
1.2.6.8 vgb基因启动子的应用 |
1.3 研究目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株和质粒 |
2.1.2 PCR引物 |
2.1.3 培养基、抗生素及培养温度 |
2.1.4 试剂 |
2.1.5 抽提液和缓冲液 |
2.1.6 实验仪器 |
2.1.7 生物测定供试昆虫 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 核酸操作方法 |
2.2.1.1 DNA的体外重组操作 |
2.2.1.2 大肠杆菌质粒的小量抽提制备 |
2.2.1.3 苏云金芽胞杆菌质粒的小量抽提制备 |
2.2.1.4 苏云金芽胞杆菌总DNA小量抽提 |
2.2.1.5 DNA的回收及纯化 |
2.2.1.6 PCR扩增 |
2.2.2 重组质粒的转化 |
2.2.2.1 大肠杆菌感受态制备及常规转化 |
2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌的电转化 |
2.2.3 大肠杆菌转化子的快检 |
2.2.4 蛋白质SDS-PAGE |
2.2.4.1 SDS-RAGE样品的制备 |
2.2.4.2 SDS-PAGE凝胶的制备 |
2.2.4.3 电泳、染色及脱色 |
2.2.4.4 蛋白质的密度定量 |
2.3 几丁质酶活的测定 |
2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌株的筛选 |
2.4.1 苏云金芽胞杆菌基因整合菌株的筛选 |
2.4.2 苏云金芽胞杆菌晶体产生菌株筛选 |
2.5 血红蛋白一氧化碳差光光谱法检测 |
2.5.1 一氧化碳的制备 |
2.5.2 样品处理与扫描 |
2.6 发酵实验 |
2.6.1 分批发酵实验 |
2.6.2 连续发酵实验 |
2.6.3 临界氧浓度测定 |
2.6.4 发酵液光密度的测定 |
2.6.5 细胞干重的测定 |
2.6.6 细胞浓度的测定 |
2.6.7 摄氧率的测定 |
2.6.8 呼吸强度的测定 |
2.6.9 还原糖浓度的测定 |
2.6.10 对棉铃虫毒力的生物测定 |
2.7 发酵中浊度仪的使用 |
3 结果与分析 |
3.1 vgb基因在苏云金芽胞杆菌中的表达 |
3.1.1 携带vgb基因载体的构建 |
3.1.1.1 基因pluxs-vgb的构建 |
3.1.1.2 质粒pET28a-Erm~r和pET28a-P_(luxS)-vgb-Erm~r的构建 |
3.1.1.3 质粒pEG491-ehi’、pEG491-vgb~-和pEG491-vgb~+的构建 |
3.1.2 苏云金芽胞杆菌vgb基因整合菌株的构建 |
3.1.2.1 BMB171-VHb~+及其对照菌株BMB171-VHb~-构建 |
3.1.2.2 质粒pHT304-Kan~r-cry的构建 |
3.1.2.3 BMB667-VHb~+及其对照菌株BMB667-VHb~-构建 |
3.1.3 苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性的检测结果 |
3.1.4 VHb在苏云金芽胞杆菌中的表达检测结果 |
3.2 VHb对苏云金芽胞杆菌菌株发酵特性的影响 |
3.2.1 VHb对临界氧浓度的影响 |
3.2.2 VHb对菌数和晶体蛋白浓度的影响 |
3.2.3 VHb对溶解氧浓度的影响 |
3.2.4 VHb对摄氧率和呼吸强度的影响 |
3.2.5 VHb对最大比生长速率的影响 |
3.2.6 VHb对菌株杀虫毒力的影响 |
3.3 苏云金芽胞杆菌发酵中浊度仪的在线监控作用 |
3.3.1 浊度值影响因素的排除 |
3.3.1.1 发酵液体积对浊度值的影响 |
3.3.1.2 通气量、搅拌转速对浊度值的影响 |
3.3.2 浊度仪对Bt发酵的监测和预测 |
3.3.2.1 浊度值与苏云金芽胞杆菌生长周期的关系 |
3.3.2.2 浊度值与营养体细胞浓度的关系 |
3.3.2.3 浊度值测定芽胞形成比例及预测发酵结束时间 |
3.3.2.4 预测最大浊度值及芽胞形成时间实例验证 |
4 讨论 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
四、转Bt抗虫工程菌的离体生物测定及发酵工艺研究(论文参考文献)
- [1]吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究[D]. 何玲敏. 南京林业大学, 2017(02)
- [2]对褐飞虱高毒力的真菌菌株筛选及其应用研究[D]. 李茂业. 安徽农业大学, 2012(08)
- [3]苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究[D]. 苏俊平. 河北农业大学, 2012(08)
- [4]植物保护学学科研究现状与展望[A]. 吴孔明,陈万权,倪汉祥,文丽萍. 2010-2011植物保护学学科发展报告, 2011
- [5]中国苏云金杆菌杀虫剂商品化生产、质量标准化及应用研究技术成果回顾与展望[A]. 陈建峰. 植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集, 2008
- [6]卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究[D]. 杨春平. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [7]抗真菌农用抗生素KA08的研究[D]. 高芬. 沈阳农业大学, 2008(01)
- [8]Bt毒蛋白cryIAb/Ac基因在毕赤酵母GS115中的表达研究[D]. 胡南. 华中农业大学, 2007(02)
- [9]马铃薯内生细菌StC01的鉴定及其促生作用初步研究[D]. 沈丽珍. 南京农业大学, 2007(05)
- [10]透明颤菌血红蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及对其发酵特性的影响[D]. 冯亮. 华中农业大学, 2007(02)