一、iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达（论文文献综述）
朱雄[1]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中研究表明神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
宁改星[2]（2020）在《苹果MdbHLH51和MdbHLH155的基因克隆及其在花青素合成中的作用》文中研究说明苹果（Malus domestica Borkh.）是一种具有很高经济价值的果树,红色果皮的苹果深受人们喜爱,因此分离与果实着色相关的基因并进一步进行功能验证具有很重要的意义。前期,课题组研究发现‘元帅’苹果中MdbHLH51和MdbHLH155的表达量与花青素含量显着相关,本研究进一步分离了MdbHLH51和MdbHLH155,构建了过表达载体MdbHLH51-GFP和MdbHLH155-GFP,并通过农杆菌介导的方法进行洋葱表皮亚细胞定位分析,苹果果皮瞬时表达和转化‘嘎啦’愈伤组织实验,并成功转入烟草和拟南芥,对MdbHLH51和MdbHLH155在花青素合成中的作用进行了初步研究。主要研究结果如下:1.以‘元帅’苹果果皮的cDNA为模板,通过RT-PCR克隆MdbHLH51（基因序列号:MD01G1155000）和MdbHLH155（基因序列号:MD11G1252200）。MdbHLH51的氨基酸数目是279,开放阅读框837 bp,MdbHLH155的氨基酸数目是416,开放阅读框1248 bp。生物信息学分析表明,对两个转录因子的亚细胞定位预测均定位在细胞核。进化树分析表明,MdbHLH51与玉米中参与花青素生物合成的蛋白ZmB和ZmLC同源关系较近,MdbHLH155与MdbHLH3、AtTT8和PhAN1同源关系较近。将MdbHLH51和MdbHLH155与其他物种中调控花青素合成的bHLH蛋白进行序列分析表明,MdbHLH51和MdbHLH155属于典型的bHLH转录因子。2.洋葱表皮亚细胞定位结果表明,MdbHLH51和MdbHLH155均定位于细胞核,与生物信息学的预测结果一致。MdbHLH51和MdbHLH155在‘金冠’苹果果皮中过量表达能够促进注射孔周围的花青素积累,与花青素合成相关基因也上调表达,包括MdCHI,MdCHS,MdF3H和MdUFGT。在强光条件下,MdbHLH51和MdbHLH155在‘嘎啦’苹果愈伤组织中过量表达能够促进愈伤组织的着色,其花青素含量是对照的3.4倍。3.为了进一步验证MdbHLH51和MdbHLH155的功能,在烟草和拟南芥中过表达MdbHLH51和MdbHLH155,结果表明MdbHLH51和MdbHLH155促进拟南芥叶脉处花青素的积累以及与花青素合成相关结构基因（AtF3H,AtCHS,AtCHI和AtDFR）的上调表达,这说明MdbHLH51和MdbHLH155在花青素的合成中起着正调控的作用。
袁小铃[3]（2020）在《新型内质网靶向阳离子脂质体的胞内基因递送机制研究》文中研究表明癌症是威胁健康的重大公共卫生问题,其发病率和致死率呈逐年上升趋势。肿瘤基因治疗通过导入外源性抑癌基因以抑制肿瘤增值、侵袭和转移,在肿瘤治疗领域表现出可观的应用前景。为实现优良的肿瘤基因治疗效果,安全高效的基因递送系统亟待开发。目前常用于基因治疗的递送系统包括病毒类载体、仿病毒类载体、非病毒类载体,其中病毒类载体有着较高的基因转染效率,但因其存在随机整合病毒基因至宿主基因组、基因包装能力有限等缺点,限制了病毒类载体在临床应用上的发展。阳离子脂质体是由阳离子磷脂和中性磷脂在适当条件下形成的的磷脂双分子层结构的封闭囊泡,是用于肿瘤基因治疗的一种常见纳米级非病毒载体,具备无免疫原性、生物可降解、制备方便等优势,但是有限的转染效率是其进一步发展应用的瓶颈。为提高阳离子脂质体的靶向性和转染效率,目前常对其进行PEG、糖基、多肽等修饰,以期达到可与病毒载体相媲美的基因递送效率。基因递送机制对新型阳离子脂质体的开发和制备有着极为重要的参考意义。通过研究阳离子脂质体/外源基因复合物胞内转运、外源基因的核递送等科学问题,有助于了解胞内基因递送的关键步骤及关键位点,有助于发现基因递送的新靶点,开发特异性好、安全性高的优质载体。同时,以猿猴病毒（SV40）为代表的具有高效基因递送效率的病毒,对我们设计和制备高效的非病毒基因载体具有重要的借鉴意义。SV40可通过小窝蛋白介导的内吞入胞,突破局部皮质细胞骨架屏障,并沿着微管进行胞内转运,直接到达细胞核周围的内质网,在内质网内完成脱壳,在核孔附近释放遗传物质,使其更有效地进入细胞核内。本论文在此基础上,制备了阳离子多肽pardaxin（GE33）修饰的内质网靶向阳离子脂质体（Liposome-Paraxin,Lipo-Par）。Paradaxin是源于红海比目鱼的阳离子抗菌肽,其氨基酸序列为NH2-GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGGQE,具备疏水性和孔形成特性,可以插入到磷脂双分子层,以非溶酶体胞内转运途径的方式快速定位到内质网并引起内质网的应激反应,利用DSPE-PEG2000-NH2的氨基与Pardaxin多肽的羧基发生缩合反应可获得DSPE-PEG2000-Par,与阳离子磷脂DOTAP、中性磷脂DOPE及DSPE-PEG通过薄膜分散法制备获得Pardaxin修饰的阳离子脂质体Lipo-Par。制得的脂质体Lipo-Par粒径均一,大小为120 nm左右,ζ电位约为27 mV。通过琼脂糖凝胶电泳实验发现,当N/P比为6:1时Lipo-Par与pDNA、ssDNA复合紧密,获得Lipo-Par/DNA复合物。在HEK 293T,MCF-7,MCF-7（PDX）,SKOV-3,Hela细胞系的体外转染实验中,Pardaxin修饰的脂质体Lipo-Par均表现出可与商用脂质体LipofectamineTM 2000相媲美的转染效率。为了探究Lipo-Par实现外源基因高效转染的体外机制,我们设计了包括细胞摄取、胞内转运、基因核递送在内的相关细胞水平试验。细胞摄取试验发现,Lipo-Par的摄取依赖细胞膜表面富集胆固醇和鞘磷脂的脂筏区域,主要通过小窝蛋白介导的内吞途径实现摄取。在Lipo-Par的细胞内转运路径机制研究中,我们发现Lipo-Par通过包括微管、微丝在内的细胞骨架靶向内质网,使其所携带的DNA避开溶酶体酸性环境的降解。同时相比于非Pardaxin修饰的脂质体Lipo-Non,Lipo-Par与DNA的复合物可以更早地释放出其携带的DNA。此外,由钙离子螯合剂BAPTA-AM和布雷非得菌素（brefeldin,BFA）引起的轻微内质网应激（ER stress,ERS）均可以提高Lipo-Non和Lipo-Par的基因递送效率。众所周知,有丝分裂对阳离子脂质体的基因转染效率具有重要影响。相比于分裂间期的细胞,处于有丝分裂时期的细胞摄取DNA的几率更大,速度更快。为探究MCF-7细胞有丝分裂如何影响Lipo-Par的转染表现,我们利用有丝分裂化学抑制剂紫杉醇（paclitaxol,PTX）抑制细胞有丝分裂,结果显示,在单纯抑制有丝分裂而不破坏微管结构的条件下,Lipo-Par依旧靶向至内质网。同时相比LipofectamineTM 2000,PTX引起的有丝分裂抑制对Lipo-Par转染效率产生的影响较小。综上所述,本研究制备了阳离子内质网靶向多肽pardaxin修饰的阳离子脂质体Lipo-Par,Lipo-Par/DNA复合物通过小窝蛋白介导的内吞实现摄取,沿细胞骨架靶向内质网,并在内质网中释放DNA,最终借助内质网膜与核膜的亲密关系实现外源基因的核递送。
祁宇[4]（2019）在《基于氨基-环氧开环反应构建多羟基支化阳离子基因载体》文中研究指明基因治疗是一种新型的治疗手段,为癌症、遗传病、免疫疾病等恶性疾病提供了一种新的治疗途径。基因治疗的基本策略是将治疗基因递送到靶细胞从而达到预防或治疗疾病的效果。由于DNA分子在生理环境下带有负电荷不易进入细胞,且易于被核酸酶降解而失去活性,基因递送过程大多依靠基因载体的协助才能完成。目前,基因载体主要分为病毒类与非病毒类基因载体。由于病毒类基因载体具有免疫原性,且容易产生致癌风险,因此新型安全高效的非病毒类基因载体日益引起研究者的关注。非病毒类基因载体主要包括脂质体、多肽、阳离子聚合物、有机/无机复合纳米颗粒等体系。与其它基因载体相比,阳离子聚合物（如聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯等）具有免疫反应小、易于大量制备、易于化学修饰等优点,因此已经被广泛研究。但是,上述阳离子型基因载体具有转染效率较低、细胞毒性较高、降解性能较差、功能单一等缺点。因此如何构建转染效率高、细胞毒性低、降解性能优异的多功能阳离子基因载体成为了生物材料领域的重要问题。另一方面,与线性和树枝状阳离子基因载体相比,支化阳离子基因载体具有结构丰富、合成简便、且易于大量制备等优点,因此被广泛研究。本论文主要阐述基于氨基-环氧开环反应构建新型多羟基支化阳离子基因载体,并研究上述阳离子聚合物的基因转染效率、细胞毒性、以及该阳离子聚合物在基因治疗活体动物模型中的应用。由于传统阳离子基因载体缺乏实时成像的能力,如何构建一种安全高效可视化的基因载体成为了核酸递送领域的新问题。本论文第二章基于四苯基乙烯（TPE）分子合成了一种星形引发剂TPE-Br,并利用原子转移自由基聚合（ATRP）反应构建四臂支化聚合物TPE-PGMA。之后,通过TPE-NH2与乙醇胺（EA）分子与TPE-PGMA聚合物进行氨基-环氧开环反应得到TPE-PGEA/TPE。由于TPE-PGEA/TPE聚合物具有两亲性,它能够在水溶液中自组装形成纳米颗粒。利用该纳米体系中TPE分子的聚集诱导发光（AIE）效应可以实现基因转染过程的实时荧光成像功能。该研究为可视化阳离子基因载体的构建提供了研究思路。羟基化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯虽然是一种安全高效的基因载体,但是由于其主链为碳链,导致释放核酸后在细胞中不容易降解。如何根据细胞的生理环境构建一种安全高效而且易于降解的阳离子基因载体是需要解决的一个关键科学问题。本论文第三章制备了一种具有缩醛结构的双氨基化合物,通过该缩醛双氨基化合物与三环氧化合物异氰尿酸三缩水甘油酯进行氨基-环氧开环反应构建了一种多羟基支化聚合物ARP,并通过修饰氟化烷基链制备得到ARP-F。由于缩醛基团在癌细胞的弱酸环境中容易断裂,因此可以制备一种可降解阳离子型基因载体。另一方面,该具有氟化烷基链的基因载体具有细胞毒性低、转染效率高、生物相容性好等优势,在后续介导pCas9-surv进行体内与体外抗癌实验的结果表明,无论在细胞实验还是在活体动物模型中,ARP-F介导的pCas9-surv不但能够有效的抑制癌细胞的增殖,还可以增强癌细胞对于广谱抗癌药物替莫唑胺的敏感性。ARP-F的成功制备为构建pH响应性可降解阳离子基因载体提供了新的研究思路。靶向性对于阳离子基因载体来说是至关重要的,优异的靶向性可以大幅度提高载体的递送效率。本论文第四章基于乳糖分子制备了一种具有还原响应性的支化多羟基阳离子基因载体LBP,并将其应用于肝脏原为肿瘤的治疗。首先我们将胱胺分子修饰在β-乳糖分子上得到了氨基化的乳糖（Lac-NH2）,随后将Lac-NH2与异氰尿酸三缩水甘油酯通过氨基-环氧开环聚合反应得到具有还原响应性的支化多羟基阳离子基因载体LBP。利用乳糖中的半乳糖单元与肝实质细胞表面去唾液酸糖蛋白受体之间的异性识别提升该基因载体的肝癌细胞靶向性。活体动物实验结果表明LBP递送pCas9-survivin质粒不但具有抑制肿瘤组织生长的效果,而且还可以提高肝癌化疗药物索拉菲尼的治疗效果。LBP聚合物的成功合成为靶向型阳离子基因载体的构建提供了新的研究思路。综上所述,本论文基于氨基-环氧开环反应,构建了系列多羟基支化阳离子基因载体TPE-PGEA/TPE,ARP-F和LBP。上述三种多羟基支化阳离子基因载体不但具有较低的细胞毒性和较高的转染效率,还分别实现了实时成像、可降解、与癌细胞靶向的功能。以上三种多羟基支化阳离子基因载体的制备为多功能核酸递送体系的构建提供了一种安全高效的方法。
董川[5]（2019）在《miRNA介导的GAS1下调对骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖、凋亡的调控作用》文中研究表明研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种常见的慢性、无菌性、关节炎性疾病。膝关节OA最为多见。OA在全球范围患病率高,治疗难度大,患者需长期忍耐疼痛、活动障碍等症状,随着疾病的进展,患者可发生残疾。OA的以上临床特点给全社会造成了严重的经济负担。因此,对OA发病机制的研究具有很大的价值。近年来学者们普遍认为,滑膜炎症在OA发展的过程中起到重要作用。OA滑膜炎症的主要特点是滑膜成纤维细胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs）的异常增生。本课题组前期对FLSs进行基因表达谱芯片分析结果发现,生长特异性阻滞基因1（Growth arrest-specific 1,GAS1）在骨关节炎滑膜成纤维细胞（OAFLSs）中表达下调。GAS1基因的主要作用是抑制细胞增殖、诱导细胞的凋亡。在胚胎发育过程中有重要调控作用,并且参与抑制多种恶性肿瘤的生长、促进肿瘤细胞凋亡。GAS1蛋白是GAS1基因的表达产物,它通过PI3K-Akt等信号通路的介导,调控细胞的增殖及凋亡等生物学特性。由于GAS1在异常增生的OAFLSs中的下调,我们推测GAS1的下调可能与OAFLSs增殖能力及抗凋亡能力的提高相关。MiRNA是一种由20-26个脱氧核苷酸组成的小分子非编码RNA,是重要的转录后水平调节因子,对特定靶基因的表达具有抑制作用。有文献报道,正常或OAFLSs中多种miRNA的表达异常,而在OA环境下,GAS1基因在FLSs中的下调是否由特定miRNA的调控我们也不得而知。目的原代培养获取人源正常及OAFLSs,并比较两者增殖能力的差异;比较正常FLSs与OAFLSs之间、正常与OA滑膜组织之间及正常FLSs用IL-1β刺激前后GAS1的表达差异;构建并验证GAS1高、低表达的FLSs模型;比较GAS1高、低表达的FLSs模型细胞增殖、凋亡等生物学特性的变化;探索GAS1影响FLSs增殖、凋亡特性的分子机制及可能的下游调控通路;进一步探索OA环境下,特定miRNAs下调GAS1基因的分子机制。方法1.运用原代培养技术获取人源正常FLSs和OAFLSs,运用流式细胞仪对FLSs进行分子标记物鉴定;使用CCK-8细胞增殖活性实验检测正常FLSs和OAFLSs的增殖能力的差异;2.使用qPCR、Westernblot、IHC染色等方法验证正常和OAFLSs之间、正常与OA滑膜组织之间以及正常FLSs实施IL-1β刺激前后GAS1的表达差异;3.应用分子克隆、细胞瞬时转染等技术构建GAS1高、低表达FLSs模型并用qPCR、荧光免疫细胞化学染色（Cellular immunofluorescence staining）实验验证其GAS1的表达差异;4.应用CCK-8细胞增殖实验、流式细胞仪细胞周期及凋亡检测验证GAS1的高、低表达对FLSs增殖、凋亡的影响;5.用qPCR、Westernblot等实验方法,探索GAS1调控FLSs增殖、凋亡能力的分子机制及下游分子信号通路;6.结合Targetscan与文献回顾预测可能调控GAS1的潜在miRNA;通过qPCR、Westernblot、荧光素酶报告基因（Luciferase assay）等方法探索miRNA调控GAS1的分子机制。结果1.成功从术中滑膜组织样品中原代培养出人源正常及OAFLSs,并用流式细胞仪检测分子标记物后证实所得FLSs纯度较高,满足后续实验要求;通过CCK-8实验证实了OAFLSs增殖活性高于正常FLSs;2.GAS1基因在OAFLSs的表达低于正常FLSs;对正常FLSs实施IL-1β刺激后GAS1表达水平下降;OA滑膜组织中GAS1表达低于正常滑膜组织;3.正常FLSs转染过表达GAS1重组载体后GAS1表达升高;相反,转染GAS1特异性siRNA后GAS1表达下降;证实了GAS1高、低表达FLSs模型构建成功;4.高表达GAS1能抑制FLSs的增殖活性及诱导其凋亡;相反,低表达GAS1可提高FLS的增殖活性及抗凋亡能力;5.GAS1通过阻断PI3K-Akt通路的活化从而抑制FLS增殖、促进其凋亡;OA炎症环境下,GAS1的下调解除了对PI3K-Akt通路的抑制,从而增强了FLSs的增殖活性及抗凋亡能力;6.在OA环境下,FLSs中miR-34a-5p、miR-181a-5p表达上调;转染miR-34a-5p、miR-181a-5p模拟物可抑制FLSs的GAS1表达。通过荧光素酶报告基因实验证明miR-34a-5p、miR-181a-5p可特异结合GAS1 mRNA的3’UTR进而调控GAS1的表达。结论本章节实验结果证明在OA环境下,由miR-34a-5p、miR-181a-5p介导的GAS1下调,通过影响其下游PI3K-Akt通路的转导,进而引起FLSs增殖活性和抗凋亡能力提高,最终表现为OA炎症环境下的滑膜的异常增生。本课题组的研究结论可为针对OA的新型分子靶向药物的开发提供了一定的理论基础。
贺思佳[6]（2018）在《放疗肿瘤细胞释放的HMGB1在肿瘤再增殖中的作用》文中指出肿瘤细胞再增殖被认为是肿瘤复发的重要机制之一,目前人们对其分子机制的了解却比较匮乏。本课题组前期研究结果揭示了以放疗诱导凋亡细胞中的caspase 3为核心的肿瘤细胞再增殖的分子机制。放疗诱导的凋亡细胞中caspase 3被激活,将剪切并激活下游不依赖钙离子的磷脂酶A2,促进前列腺素E2的合成和释放,刺激肿瘤细胞增殖。另外,我们还发现活化的caspase 3剪切并激活底物蛋白激酶Cδ,通过p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路,诱导eIF4E（eukaryotic initiation factor 4E）磷酸化和Sox2表达水平升高,促进肿瘤细胞增殖。上述研究表明凋亡细胞在放疗后肿瘤细胞再增殖过程当中的起着重要作用。然而,放疗除了诱导产生细胞凋亡之外,还能直接引起细胞坏死。已知细胞在坏死过程中会释放诸多细胞内容物,其中高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）被认为是细胞坏死的标志物之一。本研究拟探讨放疗后的坏死细胞产生的HMGB1是否在肿瘤再增殖过程中起作用。我们首先采用Western Blot技术检测肿瘤细胞培养液,发现放疗处理后的肿瘤细胞确实能够释放大量HMGB1。通过基因敲除HMGB1或应用HMGB1抑制剂,我们发现在肿瘤再增殖体外模型中放疗处理后的肿瘤细胞对少量的活的肿瘤细胞的促增殖作用依赖于坏死细胞产生的HMGB1,并呈剂量相关性。此外,我们检测了放疗处理后肿瘤细胞HMGB1受体晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced gylcation end products,RAGE）的表达情况,发现放疗前后均呈高水平表达,在体外再增殖模型中RAGE抑制剂却能明显抑制肿瘤再增殖,提示RAGE参与了 HMGB1促肿瘤细胞增殖作用。同时,我们还发现HMGB1缺失的肿瘤细胞ERK磷酸化程度受到明显抑制,表明ERK是HMGB1促增殖作用的下游信号分子。另外,我们通过对结肠癌组织芯片进行分析,结果发现HMGB1的高表达常与肿瘤患者的预后不良呈正向相关。本研究结果揭示放疗诱导的坏死细胞可通过释放HMGB1,通过旁分泌效应激活RAGE/ERK信号通路,有效地促进肿瘤细胞的增殖,提示HMGB1有可能作为潜在的针对放疗后肿瘤细胞再增殖的新的治疗靶点。
姚绎[7]（2018）在《RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究》文中进行了进一步梳理代谢工程领域的主旨即通过人工改造的微生物生产人类所需的产物,而微生物改造技术的发展是其领域进步的基石。对于微生物特定性状的改造十分依赖于对于人工设计的外源基因在目的菌株内进行高效而可控的表达,而本课题即开发出一种全新的对于目的基因表达进行增强的方式。相较于传统菌种表达技术主体针对目的基因的拷贝数、转录、稳定性、翻译等过程进行优化,本课题首次提出可以通过RNA复制的方式针对目的基因的mRNA进行直接扩增,通过mRNA量的直接增加增强目的基因的表达。该方式提升的是目的基因的mRNA含量,与现有对于目的基因的调控方式互不干扰,从而可以实现其与其余调控方式的联合使用。本课题自Qβ噬菌体序列改造得到同样可在大肠杆菌内复制的表达序列,并将其进行通用化改造得到仿造噬菌体的RNA复制系统,以之实现针对人们需求目的基因的表达增强。本课题证明了该系统的有效性、复制性及通用性,可以为后续将之使用于具体工程菌株改造中提供基础。此外,本课题还对RNA复制系统发挥功能时与底盘菌株之间的关联进行了探索,并得出在敲除底盘菌株Rnc基因时,RNA复制系统的效果具有很大改善。同时,本课题也对RNA复制系统在两种目的产物ALA及PHB生产中的效果进行验证,并均使产物产量得到了提升。本课题还验证了RNA复制系统在革兰氏阳性菌乳酸菌（Lb.caseil Zhang）中同样可以发挥功能。这些研究同样预示着本课题所提出的RNA复制系统在代谢工程领域的应用前景。综上所述,本课题构建了促进目的基因表达的一种新方法,即通过RNA复制系统增加mRNA表达量。该方法在报告基因与实际产物中均工作良好,有望成为未来代谢工程菌种改造的又一有力工具。
高文青[8]（2017）在《人信号传导与转录激活因子（STAT）家族5’非翻译区内部核糖体进入位点的研究》文中认为信号传导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）家族包括7个成员:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b以及STAT6。它们参与细胞生长、凋亡、分化及免疫应答等多种生理功能的调节,研究表明该家族蛋白的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关。目前,STAT家族成员翻译水平的调控机制尚不明确。通过搜索NCBI数据库,发现STAT家族成员的5′非翻译区（untranslated region,UTR）相对较长,且能形成稳定、复杂的二级茎环结构,存在潜在的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）活性,可能是细胞基础生命活动过程中STATs蛋白稳定表达的重要机制。本文对STAT家族成员的IRES元件在结构、细胞生理学活性以及结合蛋白等方面进行研究,旨在为STAT家族蛋白的调控和细胞IRES元件的研究提供新视角。主要结果如下:1.利用双荧光素报告基因检测系统检测STAT家族成员5′-UTR的IRES活性。随后,通过实验分别排除了潜在启动子、核糖体通读以及内部剪切位点对IRES活性鉴定的干扰作用。结果发现STAT1、STAT2和STAT4的5′-UTR存在IRES活性。此外,本文比较了STAT家族成员的IRES在一系列肿瘤细胞中的活性,发现STAT1和STAT4的IRES活性与其在细胞中的蛋白表达量正相关。2.为了探究STAT1、STAT2和STAT4 IRES的活性中心域,本研究根据模拟的二级茎环结构对其分别进行了5′和3′端碱基的逐步截短实验。结果显示:STAT1 5′-UTR的活性中心位于5′端1-232碱基之间,其中两段序列（1-26 bp和94-232 bp）是STAT1IRES元件中必不可少的活性区域。STAT2 IRES的活性域位于5′-UTR中间区域的31-170碱基之间。STAT4 IRES的序列特点与STAT1相反,其活性中心域定位于3′端101-315碱基之间。为了进一步定位影响STAT1和STAT4 IRES活性的关键茎环结构,本文针对它们活性中心域的二级结构,设计并构建了含有全长IRES元件的突变体质粒,其中,STAT1对应12个突变体质粒,STAT4对应11个突变体质粒。通过检测不同突变体质粒的IRES活性后,我们发现位于5′末端的1GCUGAG6和22UGAUUGG28以及两个嘧啶密集序列61CCUUUU66或86CUUUCC91是STAT1 IRES元件中的重要茎环结构。而位于3′末端的199AGAAAUGCAAAU210,273GGAC276和301UGAGAGA307是STAT4 IRES元件中不可或缺的部分。3.为探究细胞应激条件下STAT1和STAT4 IRES的生理功能,本文利用血清饥饿和化学药物紫杉醇对肝癌细胞进行加压处理,通过Western Blot和细胞免疫荧光检测STAT1和STAT4的蛋白表达。结果显示:血清饥饿和药物处理都能导致肝癌细胞中STAT1和STAT4蛋白表达量的增加,且均呈现出浓度依赖性。同时,细胞压力条件下IRES活性的检测结果证明这两种蛋白表达量的上调与IRES介导的翻译方式相关。4.IRES介导的翻译起始不仅与其一级序列和二级茎环结构相关,还依赖于一些反式作用因子（IRES trans-acting factors,ITAFs）的参与。其中,La蛋白（La）、Y-盒结合蛋白1（YB1）、多嘧啶序列结合蛋白1（PTB1）和p97蛋白（DAP5/p97）是四种重要的反式作用因子。本研究通过RNA-蛋白免疫共沉淀实验探究这四种ITAFs是否结合STAT1和STAT4的5′-UTR,并参与调控它们的IRES活性。结果显示:STAT1和STAT45′-UTR均能结合YB1和p97,而PTB1选择性结合STAT1 5′-UTR,La选择性结合STAT4 5′-UTR。利用RNA干扰技术分别沉默肿瘤细胞内La、YB1、PTB1和P97,发现STAT家族成员的IRES活性被抑制,证明这四种反式作用因子促进STAT家族成员的IRES在肿瘤细胞内介导翻译起始。考察La、YB1、PTB1和P97在细胞压力条件下的表达与分布后发现,四种ITAFs在肝癌细胞质中的表达量均呈现显着上升趋势。此外,La和PTB1蛋白由胞核转移到胞质,提示细胞压力条件下,反式作用因子参与调控STAT家族成员的IRES活性。5.通过比较STAT家族成员的IRES元件与其他已鉴定的IRES元件后发现,结合相同反式作用因子的IRES元件有相似的茎环结构。结合IRES元件的二级结构特点和生理作用,预测四种与细胞压力相关的因子mRNA 5′-UTR有潜在的IRES活性,并通过实验证实了这一猜测。
张娟[9]（2016）在《拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的互作蛋白研究》文中认为光合作用是生物圈中最重要的化学反应之一。叶绿体是植物进行光合作用的场所,因此,对叶绿体发育过程的研究,将有助于提高绿色植物光能利用率和光合作用效率。拟南芥叶色花斑突变体在研究叶绿体基因功能中有重要的价值。拟南芥花斑突变体variegated2（var2）和pale cress（pac）是两个重要的与叶绿体发育相关的突变体,突变基因分别是VAR2/AtFtsH2和PAC。其中AtFtsH2编码一个位于叶绿体类囊体膜的FtsH家族金属蛋白酶,PAC编码一个叶绿体功能未知的蛋白,而且纯合的pac突变体呈现白化致死的突变表型,这为PAC功能的研究带来了很大的不便。为了阐明PAC蛋白参与调控叶绿体发育的机制,实验室前期利用酵母双杂交系统对PAC的互作蛋白进行了筛选,发现PAC蛋白和VAR2蛋白物理互作。因此本论文通过蛋白互作的相关方法对二者的互作进行了验证,主要取得了如下结果:1.构建原核表达载体pET28a-VAR2714-1995,并在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达。利用His标签蛋白纯化柱和咪唑洗脱等方法得到了纯度较高的VAR2238-665重组蛋白,并以该蛋白作为抗原对家兔进行了免疫处理,得到了含有VAR2238-665多克隆抗体的抗血清。对抗血清的免疫印迹检测表明,VAR2238-665多克隆抗体可检测原核表达VAR2238-665蛋白。2.通过构建CaMV 35S启动子调控的VAR2过表达材料VAR2OE来进一步证明制备的VAR2238-665抗血清能特异识别植物中VAR2蛋白。这为Co-IP、GST Pull-down等技术验证VAR2和PAC互作提供了实验材料。3.通过构建BiFC载体和拟南芥原生质体瞬时表达实验,验证了 VAR2和PAC之间存在着植物体内相互作用,且二者在叶绿体内发生互作。4.通过酵母双杂交技术检测到PAC与VAR2蛋白的476-665氨基酸区域有明显的互作,即与M41多肽酶结构域互作,且该结构域与蛋白质水解密切相关。综上所述,本论文成功制备了纯度高、特异性强的VAR2238-665多克隆抗体,为通过免疫共沉淀和GST Pull-down等技术验证VAR2和PAC互作创造了条件。同时通过酵母双杂技术检测到PAC蛋白和VAR2蛋白的M41多肽酶结构域互作,为深入研究PAC基因的功能提供了理论依据。
李咏懋[10]（2016）在《具有长循环功能的基因/药物载体用于肿瘤治疗的研究》文中进行了进一步梳理高分子材料作为基因/药物协同给药系统在肿瘤治疗中是一种新的药物输送方式。然而传统的基因/药物载体表现出较差的血液稳定性和较低的细胞内吞效率,使其在肿瘤临床治疗方面的应用受到了很大的阻碍。本论文针对血液和细胞内吞这两大关键屏障,构建了两种具有长循环功能的阳离子载体,主要包括以下两项研究内容:本文合成了一种二甲基马来酸酐修饰的壳聚糖-胍基丁胺衍生物（CS-DM-Agm）。该衍生物与基因形成的复合物,在中性pH条件下,其表面带有负电荷,能有效抵抗血液中大量带负电蛋白的吸附,提高了基因复合物的血液稳定性;当pH值降低到6.5时,基因复合物表面电荷迅速地由负转为正,显着提高了肿瘤细胞的内吞能力,进而使得基因复合物表现出比中性培养条件下更高的基因表达效率或基因沉默效率。进一步构建了裸鼠Hela移植瘤模型,证明CS-DM-Agm/VEGF siRNA基因复合物经尾静脉注射方式进入裸鼠体内后,显着地抑制了裸鼠肿瘤的增长。此外,该治疗体系有效地延长了裸鼠的寿命,并且对裸鼠的主要器官表现出较低的毒性,在高效治疗肿瘤的同时,也保障了治疗体系的体内安全性。本文还通过原子转移自由基聚合技术一锅法合成了一种两亲性POSS基星型嵌段共聚物（POSS@PDMAEMA-b-PMPDSAH）,该聚合物能有效压缩质粒DNA形成基因复合物。磺酸型甜菜碱聚两性电解质PMPDSAH的修饰能够有效屏蔽阳离子载体的正电荷,提高了基因复合物的血液相容性,并降低了细胞毒性。此外PMPDSAH的修饰还显着抑制了基因复合物的蛋白吸附,并且在一定程度上促进了细胞的摄取能力,协同提高了基因复合物在体外高血清浓度下和动物体内的转染效率。POSS基星型共聚物能够形成核-壳-冠结构的球状胶束,实现了基因和药物的共载。进一步构建了裸鼠MCF-7移植瘤模型,研究了药物阿霉素和p53基因共载胶束体系对肿瘤的治疗效果。结果表明,共载胶束体系能发挥基因和药物的协同作用,极大程度上抑制了裸鼠肿瘤的增长,治疗效果明显高于单独给药或单独给基因体系,且该体系在裸鼠体内并未造成明显的血液毒性和组织器官毒性,该高效安全的治疗体系在实体瘤的临床治疗方面具有良好的应用价值和前景。
二、iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（2）苹果MdbHLH51和MdbHLH155的基因克隆及其在花青素合成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 缩略词 Abbreviatio |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花青素概述 |
| 1.1.1 花青素的组成 |
| 1.1.2 花青素的功能 |
| 1.2 调控花青素生物合成途径的基因 |
| 1.2.1 控制花青素合成的结构基因 |
| 1.2.2 控制花青素合成的调节基因 |
| 1.3 植物中bHLH转录因子研究进展 |
| 1.3.1 结构和分类 |
| 1.3.2 功能和研究进展 |
| 1.4 根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第二章 苹果MdbHLH51和MdbHLH155 的基因克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 菌株、载体和试剂 |
| 2.1.3 培养基及抗生素 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 反转录得到cDNA |
| 2.2.3 基因的克隆 |
| 2.2.4 PCR扩增产物的回收 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.7 测序 |
| 2.2.8 质粒DNA的提取 |
| 2.2.9 质粒DNA的酶切 |
| 2.2.10 生物信息学分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 转录因子的克隆 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 2.3.3 MdbHLH51和MdbHLH155 转录因子进化树构建和序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 苹果MdbHLH51和MdbHLH155 的过表达载体构建及瞬时表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 过表达载体的构建 |
| 3.2.2 农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位 |
| 3.2.3 苹果果皮注射 |
| 3.2.4 农杆菌介导的苹果愈伤组织的转化 |
| 3.2.5 花青素提取 |
| 3.2.6 与花青素合成相关基因的表达 |
| 3.2.7 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞的定位 |
| 3.3.2 苹果果皮瞬时表达 |
| 3.3.3 农杆菌介导的苹果愈伤组织的转化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位 |
| 3.4.2 苹果果皮瞬时表达 |
| 3.4.3 农杆菌介导的苹果愈伤组织的转化 |
| 第四章 在烟草和拟南芥中过表达MdbHLH51和MdbHLH |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 农杆菌介导转化烟草 |
| 4.2.2 利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植株 |
| 4.2.3 农杆菌介导转化拟南芥 |
| 4.2.4 花青素含量的测定 |
| 4.2.5 拟南芥花青苷合成相关基因表达量的测定 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 烟草转基因植株的获得及抗性鉴定 |
| 4.3.2 拟南芥转基因植株的获得及抗性鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 在烟草中过表达 MdbHLH51 和 MdbHLH155 |
| 4.4.2 在拟南芥中过表达 MdbHLH51 和 MdbHLH155 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文 |
| 导师简介 |
（3）新型内质网靶向阳离子脂质体的胞内基因递送机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 绪论 |
| 第一章 阳离子脂质体的构建及理化性质表征 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 合成pardaxin修饰磷脂DSPE-PEG2000-Par |
| 1.3.2 pardaxin修饰阳离子脂质体的处方设计 |
| 1.3.3 TEM形态学观察 |
| 1.3.4 脂质体的粒径与电位考察 |
| 1.3.5 琼脂糖凝胶电泳筛选脂质体/DNA质量比 |
| 1.3.6 荧光显微成像观察复合物结合能力 |
| 1.4 结果与讨论 |
| 1.4.1 Lipo-Par及 Lipo-Non形态观察结果 |
| 1.4.2 Lipo-Par及 Lipo-Non粒径分布与ζ电位考察 |
| 1.4.3 琼脂糖凝胶电泳及荧光显微成像评估脂质体/DNA结合能力 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 阳离子脂质体外源基因递送效率研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 阳离子脂质体稳定性考察 |
| 2.3.2 阳离子脂质体的细胞毒性测定 |
| 2.3.3 阳离子脂质体介导pEGFP-N1 基因的转染研究 |
| 2.3.4 阳离子脂质体介导FITC-ssDNA的摄取研究 |
| 2.3.5 阳离子脂质体介导FITC-ssDNA的外排研究 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 阳离子脂质体的体外稳定性结果 |
| 2.4.2 MTT比色法测定脂质体细胞毒性 |
| 2.4.3 阳离子脂质体的体外转染效率 |
| 2.4.4 阳离子脂质体介导外源基因的摄取研究结果 |
| 2.4.5 Lipo-Par介导的ssDNA外排情况 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 阳离子脂质体的内在化机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试剂与仪器 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞摄取机制研究 |
| 3.3.2 小窝蛋白caveolin-1 共定位 |
| 3.3.3 转染验证摄取试验结果 |
| 3.3.4 ssDNA从阳离子脂质体中释放的研究 |
| 3.3.5 阳离子脂质体及其介导的ssDNA与溶酶体、内质网共定位分析 |
| 3.3.6 高分辨显微成像技术观察脂质体/ssDNA与内质网的空间位置关系 |
| 3.3.7 分析高尔基体-内质网的膜交流对Lipo-Par胞内转运的影响 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Lipo-Par和 Lipo-Non摄取研究结果 |
| 3.4.2 转染验证摄取研究结果 |
| 3.4.3 阳离子脂质体对ssDNA释放速率的研究结果 |
| 3.4.4 阳离子脂质体及其介导的ssDNA与亚细胞器共定位研究结果 |
| 3.4.5 高尔基体-内质网的膜交流对Lipo-Par/Lipo-Non胞内转运产生的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 内质网应激对阳离子脂质体基因转染的影响评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试剂与仪器 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白免疫印迹法测Lipo-PAR对 CHOP蛋白表达量的影响 |
| 4.3.2 钙离子螯合剂BAPTA-AM对 Lipo-Par转染效率的影响 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Lipo-PAR对 CHOP蛋白表达量的影响 |
| 4.4.2 胞内钙离子紊乱对Lipo-Par转染效率的影响 |
| 4.4.3 内质网应激反应对Lipo-Par基因递送效率的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 细胞骨架对阳离子脂质体基因转染的影响评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试剂与仪器 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 流式细胞术考察微管解聚对Lipo-Par转染效率的影响 |
| 5.3.2 Lipo-Par与微管的的共定位研究 |
| 5.3.3 Lipo-Par与微丝的共定位研究 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 微管解聚对Lipo-Par摄取和转染的影响 |
| 5.4.2 微管和Lipo-Par的荧光共定位结果 |
| 5.4.3 微丝和Lipo-Par的荧光共定位结果 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 有丝分裂对阳离子脂质体基因递送的影响评估 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试剂与仪器 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 紫杉醇的细胞毒性测定 |
| 6.3.2 紫杉醇对Lipo-Par转染效率的影响 |
| 6.3.3 流式细胞术检测Lipo-Par对细胞周期的影响 |
| 6.3.4 有丝分裂时期Lipo-Par及其介导的ssDNA的摄取试验 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 MTT比色法测定PTX的细胞毒性 |
| 6.4.2 流式细胞术分析细胞周期 |
| 6.4.3 抑制细胞有丝分裂对Lipo-Par转染效率的影响 |
| 6.4.4 Lipo-Par及其介导的ssDNA在有丝分裂时期的摄取情况 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）基于氨基-环氧开环反应构建多羟基支化阳离子基因载体（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 基因载体 |
| 1.2.1 病毒类基因载体 |
| 1.2.2 脂质体类基因载体 |
| 1.2.3 多肽类基因载体 |
| 1.2.4 天然阳离子衍生类基因载体 |
| 1.2.4.1 天然多糖类 |
| 1.2.4.2 明胶类 |
| 1.2.5 合成阳离子聚合物基因载体 |
| 1.2.5.1 聚乙烯亚胺类 |
| 1.2.5.2 树枝状阳离子类 |
| 1.2.5.3 丙烯酸衍生物类 |
| 1.2.5.4 其它类 |
| 1.2.6 有机/无机复合纳米基因载体 |
| 1.3 支化阳离子基因载体 |
| 1.3.1 支化聚合物 |
| 1.3.2 支化阳离子基因载体的优势 |
| 1.3.3 多功能支化阳离子基因载体 |
| 1.4 聚集诱导发光效应 |
| 1.5 CRISPR-Cas9基因编辑系统 |
| 1.6 本课题的具体设计 |
| 第二章 基于四苯基乙烯分子构建多羟基支化阳离子基因载体 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 星形引发剂TPE-Br的合成 |
| 2.2.4 TPE-NH_3~+CF_3OO~-的合成 |
| 2.2.5 TPE-PGMA的合成 |
| 2.2.6 TPE-PGEA和TPE-PGEA/TPE的合成 |
| 2.2.7 聚合物材料的表征 |
| 2.2.8 细胞毒性与转染实验 |
| 2.2.9 细胞吞噬实验 |
| 2.2.10 细胞成像实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纳米颗粒的合成与表征 |
| 2.3.2 核酸络合能力测试 |
| 2.3.3 体外毒性与转染测试 |
| 2.3.4 细胞吞噬实验 |
| 2.3.5 递送行为研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 pH响应型氟化多羟基支化阳离子基因载体的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.0 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 ARP与ARP-F的制备 |
| 3.2.3 ARP与ARP-F的表征 |
| 3.2.4 细胞毒性实验 |
| 3.2.5 体外报告基因介导转染实验 |
| 3.2.6 细胞吞噬实验 |
| 3.2.7 蛋白吸附实验 |
| 3.2.8 溶血实验 |
| 3.2.9 体外介导pCas9-surv转染实验 |
| 3.2.10 体内肿瘤抑制实验 |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 ARP与ARP-F的制备 |
| 3.3.2 ARP-F的表征 |
| 3.3.3 降解实验 |
| 3.3.4 聚合物生物物理学性能测试 |
| 3.3.5 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.6 体外报告基因介导转染实验 |
| 3.3.7 递送行为研究 |
| 3.3.8 生物相容性评价 |
| 3.3.9 体外介导pCas9-surv转染实验 |
| 3.3.10 体内肿瘤抑制实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 肝靶向性多羟基支化阳离子基因载体的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 胱胺二盐酸盐的脱保护 |
| 4.2.4 Lac-NH_2的制备与表征 |
| 4.2.5 LBP的制备与表征 |
| 4.2.6 LBP的生物物理学性能表征 |
| 4.2.7 细胞毒性实验 |
| 4.2.8 体外报告基因介导转染实验 |
| 4.2.9 细胞吞噬实验 |
| 4.2.10 体外介导pCas9-surv转染实验 |
| 4.2.11 体内分布实验 |
| 4.2.12 体内抑瘤实验 |
| 4.2.13 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 LBP的制备与表征 |
| 4.3.2 LBP生物物理性能表征 |
| 4.3.3 体外细胞毒性与转染实验 |
| 4.3.4 体外报告基因介导转染实验 |
| 4.3.5 细胞吞噬实验 |
| 4.3.6 体外介导pCas9-surv转染实验 |
| 4.3.7 体内分布实验 |
| 4.3.8 体内抑瘤实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（5）miRNA介导的GAS1下调对骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖、凋亡的调控作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 骨关节炎概况 |
| 2 膝关节OA的研究进展 |
| 3 GAS1 及其作用研究进展 |
| 4 miRNA在 OA中的研究 |
| 实验一 正常或OA人源滑膜成纤维细胞的培养及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 正常或OA滑膜成纤维细胞及滑膜组织中GAS1 的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 GAS1 高、低表达的滑膜成纤维细胞模型的建立和验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 GAS1 对人源滑膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 GAS1 调控滑膜成纤维细胞增殖、凋亡的分子机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 OA环境下mi RNA调控滑膜成纤维细胞中GAS1 的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）放疗肿瘤细胞释放的HMGB1在肿瘤再增殖中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 建立肿瘤细胞再增殖模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 成功构建稳定表达荧光素酶报告基因的肿瘤细胞 |
| 2.3.2 放疗处理后的肿瘤细胞能够促进未放疗的肿瘤细胞再增殖 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 放疗处理对肿瘤细胞HMGB 1表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 放疗后肿瘤细胞释放HMGB1增加 |
| 3.3.2 放疗诱导的肿瘤细胞HMGB1释放增加主要来源于坏死细胞 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 HMGB1在肿瘤再增殖中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抑制HMGB1的释放削弱肿瘤细胞再增殖能力 |
| 4.3.2 构建HMGB1基因敲除肿瘤细胞株 |
| 4.3.3 HMGB1基因敲除的肿瘤细胞再增殖能力受限 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 HMGB1调节肿瘤再增殖的信号通路研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 放疗后肿瘤细胞内的ERK信号通路被激活 |
| 5.3.2 放疗后细胞释放的HMGB1能够激活残存肿瘤细胞内的ERK信号通路 |
| 5.3.3 HMGB1通过肿瘤细胞表面受体RAGE参与肿瘤再增殖的调控 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 HMGB1在肿瘤中的表达、对肿瘤生物学行为及患者预后的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 HMGB1在绝大多数人类恶性肿瘤中表达的情况 |
| 6.3.2 HMGB1的表达水平与肿瘤患者临床病理特征的关系 |
| 6.3.3 HMGB1的表达水平与肿瘤患者生存期呈负相关 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间论文 |
（7）RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 选题背景及意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 代谢工程综述 |
| 1.3.2 细菌中传统提升目的基因表达的方法综述 |
| 1.3.3 病毒及真核生物中的RNA复制行为综述 |
| 1.3.4 Qβ噬菌体及其复制过程综述 |
| 1.3.5 RNA复制过程在方法学中的应用 |
| 1.4 论文研究方法 |
| 1.5 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 细菌细胞培养实验试剂 |
| 2.1.4 分子生化实验试剂 |
| 2.1.5 DNA分子量测定 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基的配置 |
| 2.3.2 分子克隆技术 |
| 2.3.3 使用酶标仪测量细菌生长曲线 |
| 2.3.4 使用流式细胞分析仪测定细菌荧光表达量 |
| 2.3.5 使用实时荧光定量核酸扩增检测仪检测RNA含量 |
| 2.3.6 ALA发酵及产量测定 |
| 2.3.7 PHB发酵及产量测定 |
| 2.3.8 HEK293T细胞培养及转染 |
| 2.3.9 转基因鼠的构建 |
| 2.3.10 血清生长激素浓度的测量 |
| 第3章 RNA复制系统的建立 |
| 3.1 在大肠杆菌中使用DNA对Qβ噬菌体序列进行表达 |
| 3.2 仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.2.1 使用报告基因替换噬菌体结构蛋白 |
| 3.2.2 匹配复制系统功能的启动子筛选 |
| 3.2.3 简化仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.3 仿噬菌体RNA复制系统复制功能的验证 |
| 3.3.1 对接头序列的必要性进行验证 |
| 3.3.2 对序列完整的必要性进行验证 |
| 3.3.3 对负链的存在进行验证 |
| 3.3.4 对负链的必要性进行验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 对噬菌体生成过程的讨论 |
| 3.4.2 复制系统的构建及其简化 |
| 3.4.3 复制系统的复制功能验证 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RNA复制相关基因的改造 |
| 4.1 对RNA复制抑制基因的敲除 |
| 4.1.1 对推测RNA复制抑制基因Rnc的敲除 |
| 4.1.2 敲除Rnc基因后复制功能的验证 |
| 4.1.3 敲除Rnc基因后显着改善高浓度模板时的复制效率 |
| 4.2 对RNA复制必须基因的过表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 对Rnc基因的敲除 |
| 4.3.2 对EF-Ts和EF-Tu基因的过表达 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RNA复制系统的优化 |
| 5.1 对于启动子的更换 |
| 5.2 对于复制系统相关元件的更换 |
| 5.2.1 对于复制必须序列的优化 |
| 5.2.2 对于复制酶的优化 |
| 5.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.3.1 对于目的基因容量的探索 |
| 5.3.2 对于复制调节序列的添加 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 对于启动子的优化 |
| 5.4.2 对于复制系统本身的优化 |
| 5.4.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 复制系统在代谢工程方面的应用 |
| 6.1 使用复制系统增强目的产物的产量 |
| 6.1.1 使用复制系统增强ALA的产量 |
| 6.1.2 使用复制系统增强PHB的产量 |
| 6.2 在乳酸菌中测试RNA复制系统 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 使用复制系统增强实际产物的产量 |
| 6.3.2 在乳酸菌中应用RNA复制系统 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 复制系统应用于真核系统尝试 |
| 7.1 RNAe技术的开发 |
| 7.2 RNAe技术的应用前景 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 论文展望 |
| 8.2.1 对底盘菌株与RNA复制系统之间的互作探讨 |
| 8.2.2 对通过优化设计减少复制过程中双链RNA的产生的探讨 |
| 8.2.3 对筛选更优复制系统的探讨 |
| 8.2.4 对将RNA复制系统与其余改造手段相结合的探讨 |
| 8.2.5 对将RNA复制系统应用于代谢工程领域的展望 |
| 8.2.6 对将RNA复制系统应用于真核系统的展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 人工合成DNA序列 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）人信号传导与转录激活因子（STAT）家族5’非翻译区内部核糖体进入位点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 信号传导及转录激活因子STAT家族研究进展 |
| 1.1.1 STATs蛋白结构与信号通路 |
| 1.1.2 STAT家族与肿瘤关系的研究进展 |
| 1.2 内部核糖体进入位点（IRES）研究进展 |
| 1.2.1 IRES元件的发现 |
| 1.2.2 IRES元件的活性检测 |
| 1.2.3 IRES的结构与功能 |
| 1.2.4 反式作用因子（ITAFs）调控IRES活性 |
| 1.2.5 病毒IRES在联合基因治疗中的应用 |
| 1.2.6 细胞IRES与肿瘤关系的研究进展 |
| 1.3 课题研究意义 |
| 1.4 课题主要研究内容 |
| 第二章 STAT家族成员IRES活性的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒、菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 2.2.4 双顺反子待检质粒的构建 |
| 2.2.5 分子克隆步骤 |
| 2.2.6 细胞培养与转染 |
| 2.2.7 双顺反子报告基因的活性检测 |
| 2.2.8 qRT-PCR分析 |
| 2.2.9 Western Blot |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 STAT家族成员 5′-UTR序列与结构分析 |
| 2.3.2 STAT家族成员IRES活性的初步鉴定 |
| 2.3.3 排除STATs IRES元件含有内部启动子活性 |
| 2.3.4 排除双荧光素酶检测质粒含有内部剪切位点 |
| 2.3.5 排除核糖体连续翻译机制的干扰作用 |
| 2.3.6 双荧光蛋白检测系统对STATs IRES活性的辅助鉴定 |
| 2.3.7 STAT家族成员在不同肿瘤细胞中IRES活性比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 STAT家族成员IRES活性结构域的探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 质粒、菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 3.2.4 IRES二级结构模拟 |
| 3.2.5 STATs IRES逐步截短重组质粒的构建 |
| 3.2.6 STATs IRES定点突变重组质粒的构建 |
| 3.2.7 分子克隆步骤及细胞培养 |
| 3.2.8 细胞转染以及双荧光素酶活性检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 STAT1 IRES活性中心域的探究 |
| 3.3.2 STAT2 IRES活性中心域的探究 |
| 3.3.3 STAT4 IRES活性中心域的探究 |
| 3.3.4 STAT1 IRES活性区域关键茎环结构的探究 |
| 3.3.5 STAT4 IRES活性区域关键茎环结构的探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 细胞应激条件下STAT1和STAT4 IRES元件的功能探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 质粒及细胞株 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 4.2.4 共聚焦检测STAT家族蛋白的表达与分布 |
| 4.2.5 Western Blot与qRT-PCR |
| 4.2.6 细胞转染及压力处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 紫杉醇（PTX）处理肝癌细胞后STAT1蛋白及mRNA的表达 |
| 4.3.2 紫杉醇（PTX）处理肝癌细胞后STAT4蛋白及mRNA的表达 |
| 4.3.3 紫杉醇（PTX）处理肝癌细胞后p-STAT1和p-STAT4蛋白的表达 |
| 4.3.4 IRES调控紫杉醇药物压力下肝癌细胞中STAT1和STAT4蛋白的表达 |
| 4.3.5 IRES调控血清饥饿条件下肝癌细胞中STAT1和STAT4蛋白的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 STAT1和STAT4 IRES元件所需的反式作用因子的探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 质粒及细胞株 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 5.2.4 RNA-蛋白免疫共沉淀实验 |
| 5.2.5 Western Blot检测胞质胞核蛋白的表达 |
| 5.2.6 siRNA干扰技术 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 STAT1和STAT4的IRES元件与四种ITAFs的结合 |
| 5.3.2 四种ITAFs正调控STAT1和STAT4的IRES元件 |
| 5.3.3 药物压力条件下Bel7402细胞中四种ITAFs的表达与分布 |
| 5.3.4 血清饥饿条件下Bel7402细胞中四种ITAFs的表达与分布 |
| 5.3.5 STAT1和STAT4的IRES元件与四种ITAFs结合位点的预测 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 基于STAT1和STAT4 IRES元件对细胞IRES结构的初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 质粒及细胞株 |
| 6.2.2 实验试剂和仪器 |
| 6.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 6.2.4 质粒构建 |
| 6.2.5 分子克隆步骤 |
| 6.2.6 细胞培养和转染及双荧光素酶的活性检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 STAT1与已鉴定的IRES元件的结构对比 |
| 6.3.2 STAT4与已鉴定的IRES元件的结构对比 |
| 6.3.3 STAT1与MDR15′-UTR的结构对比 |
| 6.3.4 STAT4与RRBP1、CDX2和AHR 5′-UTRs的结构对比 |
| 6.3.5 MDR1、RRBP1、CDX2和AHR IRES活性的鉴定 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的互作蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花斑突变体用于研究叶绿体发育 |
| 1.1.1 花斑突变体概述 |
| 1.1.2 花斑突变体分类 |
| 1.1.3 与叶绿体发育相关的花斑突变体 |
| 1.1.4 与叶绿素、类胡萝卜素合成相关的花斑突变体 |
| 1.2 FtsH蛋白研究进展 |
| 1.2.1 FtsH蛋白酶同源蛋白多样性 |
| 1.2.2 FtsH蛋白酶结构 |
| 1.2.3 FtsH蛋白酶的功能 |
| 1.3 PALE CRESS蛋白研究进展 |
| 1.3.1 pale cress突变体研究进展 |
| 1.3.2 PAC蛋白功能初步分析 |
| 1.4 蛋白质相互作用研究进展 |
| 1.4.1 双分子荧光互补技术(BiFC) |
| 1.4.2 酵母双杂交技术 |
| 1.4.3 蛋白互作的其它研究技术 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 VAR2_(238-665)蛋白的原核表达和抗体制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 载体和质粒 |
| 2.2.3 菌株 |
| 2.2.4 试剂 |
| 2.2.5 溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 表达载体的构建 |
| 2.3.2 VAR2_(238-665)蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 2.3.3 VAR2_(238-665)蛋白的纯化及定量 |
| 2.3.4 VAR2_(238-665)抗体的制备及其效价检测 |
| 2.3.5 VAR2基因过表达突变体植株的获得 |
| 2.3.6 VAR2_(238-665)抗体在植物蛋白中的特异性检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 pET28a-VAR2_(714-1995)表达载体的构建 |
| 2.4.2 重组蛋白在原核细胞中的表达分析 |
| 2.4.3 VAR2_(238-665)蛋白亲和纯化 |
| 2.4.4 抗血清的效价检测 |
| 2.4.5 VAR2基因过表达突变体植株的获得 |
| 2.4.6 抗血清在植物样品中的特异性检测 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 利用BiFC检测PAC和VAR2的互作 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 载体和质粒 |
| 3.2.3 菌株 |
| 3.2.4 试剂 |
| 3.2.5 溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pTF486-PAC-SPYC载体的构建 |
| 3.3.2 pTF486-VAR2-SPYN载体的构建 |
| 3.3.3 拟南芥叶片原生质体的分离及转化 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 pTF486-PAC-SPYC载体的构建 |
| 3.4.2 pTF486-VAR2-SPYN载体的构建 |
| 3.4.3 BiFC检测VAR2和PAC的相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 酵母双杂交检测PAC和VAR2截短蛋白的互作 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒和载体 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 pGADT7-VAR2_(714-1995)载体的构建 |
| 4.3.2 pGBKT7-PAC_(69-939)载体的构建 |
| 4.3.3 VAR2_(238-665)截短蛋白载体的构建 |
| 4.3.4 酵母质粒的转化 |
| 4.3.5 酵母双杂交 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 pGADT7-VAR2_(714-1995)载体的构建 |
| 4.4.2 pGBKT7-PAC_(69-939)载体的构建 |
| 4.4.3 VAR2_(238-665)截短蛋白载体的构建 |
| 4.4.4 酵母双杂交检测PAC_(23-313)和VAR_(238-665)截短蛋白的互作 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）具有长循环功能的基因/药物载体用于肿瘤治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤的基因治疗及基因传递系统的构建 |
| 1.2.1 肿瘤的基因治疗 |
| 1.2.2 基因传递系统的构建 |
| 1.3 基因传递过程中所面临的障碍 |
| 1.3.1 血液屏障 |
| 1.3.2 组织屏障 |
| 1.3.3 靶细胞摄取屏障 |
| 1.3.4 内涵体屏障 |
| 1.3.5 基因解离屏障 |
| 1.3.6 入核屏障 |
| 1.4 基因传递障碍的克服方法 |
| 1.4.1 提高基因复合物的血液稳定性 |
| 1.4.2 提高基因复合物的肿瘤组织穿透能力 |
| 1.4.3 提高基因复合物的细胞摄取能力 |
| 1.4.4 提高基因复合物的内涵体逃逸能力 |
| 1.4.5 提高基因复合物的解离能力 |
| 1.4.6 提高DNA的细胞核运输能力 |
| 1.5 基因药物共载体系 |
| 1.5.1 聚合物载体 |
| 1.5.2 脂质体 |
| 1.5.3 聚合物胶束 |
| 1.5.4 无机纳米粒子 |
| 1.5.5 纳米石墨烯 |
| 1.6 课题的提出及研究内容 |
| 第二章 具有电荷反转功能的壳聚糖衍生物的制备及其与基因形成复合物的表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 二甲基马来酸酐修饰的壳聚糖-胍基丁胺衍生物（CS-DM-Agm）的合成与表征 |
| 2.2.4 菌种的培养和质粒的提取 |
| 2.2.5 基因复合物的制备 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 基因复合物形貌的观察 |
| 2.2.8 基因复合物粒径及表面电位测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 二甲基马来酸酐修饰的壳聚糖-胍基丁胺衍生物的合成及结构表征 |
| 2.3.2 聚合物蛋白吸附水平分析 |
| 2.3.3 基因复合物的表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 具有电荷反转功能的壳聚糖衍生物体外基因转染和体内抑瘤的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验原料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 细胞毒性实验 |
| 3.2.5 细胞转染实验 |
| 3.2.6 pGL3质粒表达效率的检测 |
| 3.2.7 GFP基因沉默效率的检测 |
| 3.2.8 VEGF基因沉默效率的检测 |
| 3.2.9 细胞内吞效率的检测 |
| 3.2.10 细胞凋亡测试 |
| 3.2.11 肿瘤裸鼠模型的构建 |
| 3.2.12 肿瘤模型的治疗实验 |
| 3.2.13 体内VEGF基因沉默效率的检测 |
| 3.2.14 肿瘤组织学检测 |
| 3.2.15 体内毒性的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细胞毒性分析 |
| 3.3.2 体外转染效率的分析 |
| 3.3.3 细胞内吞效率分析 |
| 3.3.4 细胞凋亡分析 |
| 3.3.5 体内肿瘤治疗效果分析 |
| 3.3.6 体内生物安全性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 聚两性电解质修饰的POSS基星型聚合物合成及其作为基因/药物载体性能的表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验原料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 POSS基两亲性星型共聚物的合成与表征 |
| 4.2.4 POSS基星型共聚物与基因形成复合物的表征 |
| 4.2.5 胶束的制备及表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 POSS基ATRP引发剂的合成与结构表征 |
| 4.3.2 POSS为核的星型共聚物的合成与结构表征 |
| 4.3.3 基因复合物的表征 |
| 4.3.4 胶束的表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 聚两性电解质修饰的POSS基星型聚合物体外体内基因转染和体内抑瘤的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验原料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 血液相容性实验 |
| 5.2.4 细胞毒性实验 |
| 5.2.5 细胞体外转染实验 |
| 5.2.6 细胞体外转染效率检测 |
| 5.2.7 细胞内吞效率检测 |
| 5.2.8 体内转染实验 |
| 5.2.9 体内转染效率检测 |
| 5.2.10 药物细胞内释放检测 |
| 5.2.11 肿瘤细胞毒性检测 |
| 5.2.12 肿瘤细胞凋亡检测 |
| 5.2.13 肿瘤细胞周期检测 |
| 5.2.14 肿瘤裸鼠模型的构建 |
| 5.2.15 肿瘤模型的治疗实验 |
| 5.2.16 p53体内表达效率检测 |
| 5.2.17 肿瘤组织学检测 |
| 5.2.18 体内毒性检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 血液相容性分析 |
| 5.3.2 细胞毒性分析 |
| 5.3.3 体外转染效率的分析 |
| 5.3.4 细胞内吞效率分析 |
| 5.3.5 体内转染效率分析 |
| 5.3.6 药物细胞内释放分析 |
| 5.3.7 药物基因共载胶束对肿瘤细胞的作用分析 |
| 5.3.8 体内肿瘤治疗效果分析 |
| 5.3.9 体内生物安全性分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
四、iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [2]苹果MdbHLH51和MdbHLH155的基因克隆及其在花青素合成中的作用[D]. 宁改星. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [3]新型内质网靶向阳离子脂质体的胞内基因递送机制研究[D]. 袁小铃. 浙江大学, 2020
- [4]基于氨基-环氧开环反应构建多羟基支化阳离子基因载体[D]. 祁宇. 北京化工大学, 2019(06)
- [5]miRNA介导的GAS1下调对骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖、凋亡的调控作用[D]. 董川. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [6]放疗肿瘤细胞释放的HMGB1在肿瘤再增殖中的作用[D]. 贺思佳. 上海交通大学, 2018(01)
- [7]RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究[D]. 姚绎. 清华大学, 2018(04)
- [8]人信号传导与转录激活因子（STAT）家族5’非翻译区内部核糖体进入位点的研究[D]. 高文青. 江南大学, 2017(01)
- [9]拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的互作蛋白研究[D]. 张娟. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [10]具有长循环功能的基因/药物载体用于肿瘤治疗的研究[D]. 李咏懋. 天津大学, 2016(12)
标签：脂质体论文; 荧光蛋白论文; 荧光素酶报告基因论文; 细胞增殖论文; 细胞转染论文;