一、肝癌病人血浆和癌组织中血栓调节蛋白的检测(论文文献综述)
陈秦俊杰[1](2021)在《环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究》文中研究表明研究背景和目的肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是发病率仅次于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的一种高度恶性的肝脏恶性肿瘤,其特点是发病隐匿,侵袭性高,患者就诊时往往已处于疾病的中晚期阶段,此时绝大多数患者已经失去手术治疗的机会,故ICC患者整体预后极差。近几十年来,ICC的发病率在全球范围内逐渐升高,其常见的主要危险因素包括:肝内胆管结石、原发性硬化性胆管炎、肝血吸虫病、肝硬化、胆管囊肿、Caroli病、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、肥胖和吸烟等。ICC目前仍缺乏有效的治疗手段,手术切除是最有效的治疗方法,但由于ICC患者接受手术治疗的比例较低加之术后高复发率,导致ICC患者5年总体生存率低于10%。环状RNA(CircRNAs)是生物体内一类含量丰富、多样且保守的新型非编码RNA分子,它们是由前体m RNA通过直接的反向拼接或由外显子跳跃环化产生。目前绝大多数circRNAs被认为可以充当分子海绵,即通过吸附细胞内的mi RNAs来实现对下游基因的调控。另外,还有少部分circRNAs可以与RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)相互作用,从而改变下游基因的转录水平。甚至有极少一部分circRNAs可以作为蛋白质翻译的模板产生小分子多肽和蛋白。越来越多的研究表明circRNA分子在人类疾病中起着重要的调控作用,人们已经发现异常表达的circRNA分子与多种癌症的进展和预后都有着密切的关系。然而,目前鲜有研究详细地报道circRNA分子在ICC疾病的发生、发展过程中的作用和机制。鉴于此,本研究基于基因芯片测序技术寻找在ICC中发生显着性上调的circRNA分子,并通过一系列分子生物学实验技术探索circRNA分子在ICC发生、发展中的作用。方法1.病人的临床资料和组织样本本研究回归性收集了从2016年3月至2017年8月在上海东方肝胆外科医院接受肝脏切除手术的67例ICC患者的临床病理资料,同时也获取这67例患者术中的新鲜冰冻癌组织及其对应的邻近正常肝脏组织。2.寻找ICC中显着性高表达的环状RNA分子随机选取上述标本中的7对组织按照Arraystar公司的Human circRNA Array(v2版本)指南对癌与癌旁组织之间的circRNAs进行差异表达分析,并最终筛选出在ICC肿瘤中显着性高表达的目标分子,即circACTN4。3.探索circACTN4的表达水平与ICC患者预后的关系通过受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)确定剩余60个ICC患者中circACTN4表达量的最佳临界值,并把这些患者分为circACTN4高和低表达两组。生存曲线分析采用Kaplan-Meier(KM)法和对数秩(log-rank)检验。Cox风险比例回归模型用于探索影响患者预后的危险因素。4.功能实验验证circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验以及内皮小管形成实验来测定circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。通过向雄性BALB/c裸鼠(4-6周龄)皮下注射FRH0201细胞建立皮下成瘤模型,还通过向6周大的雄性BALB/c裸鼠的鼠尾静脉注射FRH0201细胞建立小鼠的肝内胆管癌肺转移模型,借此判断circACTN4在体内对胆管癌细胞增殖和转移能力的影响。5.CircACTN4过表达后进行测序寻找ICC中发生显着性变化的基因通过过表达质粒实现RBE细胞中circACTN4的高表达,然后通过过表达基因测序获得癌细胞中发生显着性差异表达的基因谱,随后通过GO和KEGG分析进一步缩小范围,寻找目标基因。最后通过q RT-PCR,Western blot实验以及Ch IRP(Chromatin isolation by RNA purification)实验等进一步探索上述显着性变化的目标基因与circACTN4的关系。6.CircACTN4与RBP互作在circACTN4的下拉实验(Pull down)中,我们将肝内胆管癌细胞裂解物与提前合成的生物素标记探针共同孵育,然后通过与链霉亲和素磁珠结合沉淀上述细胞裂解物中的相应蛋白。随后,我们对沉淀下来的蛋白质分别进行液相色谱-质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)/(Mass spectrometer,MS)质谱分析,以及后续的免疫共沉淀实验、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验、RNA的凝胶迁移或电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等并最终筛选出目标RBP分子。7.寻找CircACTN4与RBP共同作用的下游基因通过Ch IP-seq技术寻找目标RBP结合的下游靶基因谱,然后将上述circACTN4过表达测序结果与Ch IP-seq测序的结果取交集获得CircACTN4与RBP共同作用的下游基因。8.CircACTN4充当mi RNA的分子海绵为了寻找能与circACTN4结合的mi RNA分子,我们通过使用Circular RNA interactome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html),Starbase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)和Circbase数据库(http://circbase.org/)进行预测。随后经过RT-PCR,Western blot,RIP和荧光素酶报告基因实验,我们最终确定与circACTN4结合的mi RNA分子。结果1.根据circRNA基因芯片测序的结果,我们共获得202个在ICC癌组织中显着性上调(Fold change≥2.0,P value≤0.05)的circRNA分子。我们选取log2(Fold change)值最大的前7个circRNA分子,接着通过细胞的功能验证以及数据库的比对,最终确定hsa_circ_0050898作为我们的目标RNA分子,因为hsa_circ_0050898来源于其母基因ACTN4,因此我们命名它为circACTN4。2.ICC患者中,circACTN4的高表达是影响ICC患者预后的独立危险因素,KM曲线分析结果显示ICC患者中高表达的circACTN4与更差的总体生存(Overall survival,OS)和更高的术后肿瘤复发率均显着性相关。3.体外功能实验,如平板克隆实验、Transwell实验和小管形成实验的结果表明ICC细胞中circACTN4的高表达能够显着性增强肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭的能力。体内动物实验模型结果也发现敲降circACTN4的表达能够显着性地缩小皮下肿瘤的体积及小鼠肺组织转移癌灶的数目。4.CircACTN4的三次过表达测序结果发现在RBE细胞中共计103个基因出现显着性差异表达,这些基因的GO分析发现在分子功能中参与“转录因子活性、结合(Transcription factor activity,protein binding)”的基因数目和比例较高;另外,KEGG分析发现Hippo通路和Wnt通路相关的部分基因在circACTN4过表达后都出现明显的变化。我们对其中的FZD7基因十分感兴趣,并通过PCR和Western blot实验证实FZD7确实在circACTN4过表达后发生显着性上调。随后的Ch IRP实验证明circACTN4能够富集在FZD7上游启动子区域,说明circACTN4与FZD7的起始转录密切相关。5.下拉实验结果发现19种蛋白能够与circACTN4发生特异性结合,随后的蛋白质互作分析(Protein-protein interaction,PPI)发现YBX1因其高度中心性并且与其他基因直接互作而成为我们关注的焦点。随后的一系列细胞功能及组织样本验证最终确认circACTN4能够与YBX1蛋白互作。6.通过Ch IP-seq实验,我们发现YBX1可结合在上游启动子区域的靶基因数目为631个。随后,我们将Ch IP-seq实验结果和上述过表达测序的103个基因取交集最终只得到FZD7和LRP1。接着,通过Ch IP-q PCR实验再次确认在ICC细胞中,YBX1的下游靶基因是FZD7,因为YBX1可以在FZD7上游启动子区域被富集,且这一区域与circACTN4的结果一致。最终,通过一系列的实验我们证实circACTN4通过招募YBX1共同作用于下游的FZD7基因并促进其转录。7.CircACTN4过表达测序结果已经提示Hippo通路中YAP1基因在ICC中发生显着性上调。因此,我们想探索circACTN4作为分子海绵调控相关mi RNA分子及其相应的下游YAP1基因的可能性。于是我们进一步通过Starbase和Circbase数据库预测得到12个既能与circACTN4又能与YAP1相互作用的候选mi RNA分子。经过TCGA数据库和功能验证实验的筛选,我们最终发现只有mi R-424-5p可以同时和circACTN4以及YAP1发生结合。荧光素酶报告基因和RIP实验结果也证实circACTN4在ICC中可以通过吸附mi R-424-5p上调YAP1基因的表达。结论CircACTN4在ICC中显着性高表达并且与患者术后长期预后差密切相关。体内、外功能实验结果表明circACTN4能够促进癌细胞的增殖、转移和侵袭。机制研究发现circACTN4通过招募YBX1共同启动FZD7的转录,进而促进ICC的进展和恶化,另外,circACTN4还可以充当mi R-424-5p的分子海绵上调YAP1的表达,进而促进肿瘤的发展。我们的结果提示circACTN4可以作为ICC的一个潜在的预后指标和治疗靶点。
徐维宇[2](2019)在《炎症因子在胆囊癌预后中的作用和基于ceRNA调节网络分析研究非编码RNA在肝内胆管细胞癌发病机制中的作用》文中研究表明目的:在本研究中,我们探究了术前纤维蛋白原与白蛋白比值(fibrinogen-to-albumin ratio,FAR)在胆囊癌(gallbladdercancer,GBC)患者中的预后意义。方法:回顾性分析了 154例于2005年3月至2017年12月在我院接受了手术治疗的GBC患者。采用受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线来明确术前纤维蛋白原与白蛋白比值等生物学标记物的最佳临界值。单因素Kaplan-Meier法以及多因素Cox回归分析被用来进行GBC患者预后相关的分析。结果:ROC曲线显示术前FAR的最佳临界值为0.08。术前FAR与年龄(P=0.045)、黄疸(P<0.001)、肿瘤分化程度(P=0.002)、肿瘤切缘状态(P<0.001)、T分期(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、CA199(P<0.001)以及白蛋白水平(P<0.001)显着相关。多因素分析表明肿瘤切缘状态[风险比(hazard ratio,HR):2.343,95%置信区间(confidenceinterval,CI):1.532-3.581,P<0.001],TNM 分期(P=0.035),术前白蛋白水平(HR=0.595,95%CI:0.385-0.921,P=0.020)和 FAR(HR:2.813,95%CI:1.765-4.484,P<0.001)是GBC患者的独立预后因素。结论:术前FAR升高与GBC患者不良的总生存率(overall survival,OS)显着相关,而术前白蛋白水平升高是GBC患者的保护性预后因素。术前FAR作为一种易获取、高性价比且无创的指标,在临床上可用于预测GBC患者的预后。目的:本研究探讨了联合应用术前血浆纤维蛋白原和CA199水平在胆囊癌(gallbladdercarcinoma,GBC)患者中的预后价值。方法:回顾性分析了154例GBC患者术后的临床病理资料。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线来确定术前血衆纤维蛋白原和CA199水平的最佳截断值。采用单因素和多因素生存分析来明确与GBC预后相关的危险因素。根据通过多因素生存分析计算得到的风险比(Hazard ratio,HR)值的相对值,术前血浆纤维蛋白原和CA199水平同时升高的GBC患者被分配得分为2.1;单独血浆纤维蛋白原水平升高的患者得分为1,单独CA199水平升高的患者得分为1.1,而没有这两者异常的患者得分为0。结果:ROC曲线分析显示,术前血浆纤维蛋白原和CA199的最佳截断值分别为3.47g/L和25.45U/ml〇多因素分析表明,术前血浆纤维蛋白原和CA199 7JC平升高与更差的总体生存率(overall survival,OS)显着相关(HR=1.711,95%置信区间(confidence interval,CI):1.114-2.627,P=0.014和HR=1.842,95%CI:1.111-3.056,P=0.018)。当我们把这两个参数结合起来应用时,ROC曲线下面积从0.735(仅限术前血浆纤维蛋白原)和0.729(仅限术前CA199)增加到0.765。当该组合变量被添加到多因素分析中时,联合应用血浆纤维蛋白原和CA199水平(P<0.001),肿瘤切缘(P<0.001)和TNM分期(P=0.010)是接受手术治疗的GBC患者预后的独立危险因素。结论:与单独应用相比,联合应用血浆纤维蛋白原和CA199水平可以作为术后GBC患者更有效的、独立预后生物标志物。背景:本研究旨在探讨淋巴细胞与单核细胞比率(lymphocyte-to-monocyte ratio,LMR)在胆囊癌(gallbladder cancer,GBC)患者中的预后价值。方法:本研究回顾性分析了2005年至2017年间在我院住院进行手术治疗的154例GBC患者的临床资料。将术前外周血中的淋巴细胞计数除以单核细胞计数,来计算患者术前血液样本的LMR。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定LMR在GBC患者总生存率(overall survival,OS)中的最佳截断值。利用Kaplan-Meier方法来评估OS,并采用对数秩检验比较组间患者OS的差异。进行单因素和多因素Cox回归分析,来得到与GBC患者OS相关的独立的预后指标。结果:ROC曲线表明术前外周血中LMR的最佳截断值为4.76。与LMR>4.76(风险比(hazard ratio,HR):0.399,95%置信区间(confidence interval,Cl):0.265-0.602,P<0.001)的患者相比,必0岁且LMRS4.76的GBC患者OS明显更差;尽管如此,LMR的预后价值在整个研宄队列或60岁以上的患者中均未体现出统计学意义(均P>0.05)。在年龄>60岁的患者中,LMR的最佳截断值为4.21,与LMR>4.21(HR:1.830,95%CI:1.129-2.967,P=0.014)的患者相比,我们观察到在>60岁且LMRS4.21的患者中OS明显较差。多因素Cox回归分析显示,基于年龄分层产生较高和较低的LMR截断值的生物标记物LMR为不同年龄段GBC患者的OS的独立危险因素(HR:0.272,95%CI:0.105-0.704,P=0.007;和HR:0.544,95%CI:0.330-0.895,P=0.017)。结论:术前LMR作为GBC患者术后OS的独立预后指标之一,其最佳截断值具有一定的年龄依赖性。背景:竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作为一种全新的基因表达调控模式,认为长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)和基因可以通过竞争性结合微小RNA(microRNA,miRNA)从而在癌症的发病过程中发挥重要的调节作用。然而,ceRNA在肝内胆管细胞癌中的竞争机制尚不完全清楚。材料和方法:通过检索NCBI GEO数据库获得有关人类肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)的IncRNA、miRNA和mRNA数据集表达数据。对上述数据集进行差异表达分析并取交集以获得ICC差异表达的IncRNA、miRNA和mRNA。通过差异表达的IncRNA和mRNA共表达分析、miRNA靶基因预测分析和ceRNA关系整合的方法构建与ICC相关的ceRNA调节网络(ceRNA regulating network,ceRNET),并对网络中的差异表达mRNA进行功能富集分析。然后根据差异表达RNA的网络节点排名和在各GEO数据集之间的表达趋势是否一致,结合其倍数变化的对数值(logfold change,logFC)及ceRNA关系,以及既往在其他肿瘤中的研究结果,得到我们要验证的与ICC相关的核心调节通路。将此调节通路分别用ICC患者的10对新鲜癌组织和癌旁组织、10例外周血浆标本及10名配对的健康受试者的外周血衆标本和88例ICC患者的石错切片标本进行实时定星聚合酶链式反应、免疫印迹实验和免疫组织化学染色进行验证。结果:构建的ICC相关ceRNET包含340个IncRNA-miRNA-mRNA调控关系,对ceRNET中的44个差异表达mRNA进行GO分析显示它们主要富集在“上皮细胞增殖的负调控”和“活化的T淋巴细胞的增殖的正调控”等生物学过程,KEGG分析显示它们主要富集在“补体和凝血级联”通路。RP11-328K4.1-hsa-miR-27a-3p-PROSl是本研究确定的与ICC相关的ceRNET中的核心调节通路。分子生物学实验结果显示:相对于正常对照,lncRNARPll-328K4.1在ICC患者的癌组织和外周血浆中显着低表达(p<0.05);hsa-miR-27a-3p在ICC患者的癌组织和外周血浆中显着高表达(p<0.05);mRNAPROSl在ICC患者癌组织中显着低表达(p<0.05),然而在外周血浆中无明显降低(p>〇.〇5)。mRNA对应的蛋白在ICC患者的癌组织中虽表达略有降低,但在ICC患者的外周血中表达确稍升高,差异均无统计学意义(p>0.05)。ICC患者的石蜡切片免疫组化染色显示,相较于癌旁组织,PR0S1蛋白在癌组织中染色为阳性。结论:构建ceRNET是研宄ICC发病机制的有效手段,ICC的发生与上皮细胞和活化的T淋巴细胞的增殖的调控有关,补体和凝血级联通路参与了ICC的发病过程。IncRNA RP11-328K4.1的表达上调可通过海绵吸附作用去除致癌性miRNA hsa-miR-27a对mRNA PR0S1表达的抑制,从而发挥IncRNA RP11-328K4.1在ICC中的抑癌基因的角色。核心调节通路中的IncRNA RP11-328K4.1,miRNA hsa-miR-27a-3p和mRNA PR0S1均为ICC相关的ceRNET中的连接度较髙的中枢节点,是今后研究和发现ICC患者诊断、预后和治疗靶点的理想候选生物标记物。
王嘉俊[3](2019)在《长链非编码RNA AB007962、RP11-432I5.2和PGM5-AS1在胃肠癌中的表达情况及PGM5-AS1对细胞迁移的作用及机制的研究》文中研究表明背景和目的:胃癌、结直肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤。据统计,2017年全美范围内胃癌、结肠癌和直肠癌的预计新发病例分别为2.8万例,9.5万例和3.9万例。而在我国,2015年预计胃癌和结直肠癌新发病例分别为67.9万例和37.6万例,预计死亡病例分别为49.8万例和19.1万例,在消化道肿瘤中均高居前列。胃肠癌给家庭带来失去亲人的痛苦,给社会造成极大的经济负担。随着手术技术,器械以及治疗手段的发展,病人的生存时间得到了一定的改善,但是远期预后效果仍不能令人满意。究其原因,主要因为疾病发生隐匿且发展迅速,直到病人合并消化道出血或梗阻时,才被发现并进行治疗。此外,术后的复发和转移同样严重影响病人的生存时间。众所周知,胃肠癌的发生主要由环境因素和遗传因素共同导致的,而在肿瘤发展过程中,大量基因异常表达并参与其中。所以,明确胃肠癌进展过程中的潜在分子机制,探索新颖的且具备更高敏感性特异性的诊断肿瘤和指导预后的分子标志物,并寻找新的肿瘤治疗靶点是目前的首要任务。人类基因组测序计划让我们对人类基因有了全新的认识,大约20000个人类基因中仅有2%左右能够编码蛋白,而剩余超过90%的转录本则被称之为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。在ncRNA中,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在近几年倍受关注,LncRNA是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录而来,长度超过200个核苷酸,并且没有开放阅读框的一种ncRNA。根据lncRNA与编码基因位置关系,lncRNA可以被分为五类,即正义lncRNA(sense-lncRNA),反义lncRNA(antisense-lncRNA),基因间lncRNA(intergenic lncRNA),基因内lncRNA(intronic lncRNA)和双向lncRNA(bidirectional lncRNA)。LncRNA广泛存在于真核生物的细胞核和细胞质中,并在人类病理生理过程中起到重要作用。近几年的研究还发现,lncRNA参与多种肿瘤的发生发展并起到了关键的调控作用。在这些与肿瘤相关的lncRNA中,lncRNA-AB007962(后文均简称AB007962)、lncRNA-PGM5-AS1(后文均简称PGM5-AS1)和lncRNA-RP11-432I5.2(后文均简称RP11-432I5.2)的研究属于空白状态。本研究通过检测AB007962、PGM5-AS1和RP11-432I5.2在胃肠癌中的表达情况,探索他们与胃肠癌诊断、临床病理特征和预后的关系,明确他们在临床中的价值和意义。同时我们还试图研究PGM5-AS1对结直肠癌细胞增殖、周期、凋亡和迁移能力的影响,并探索PGM5-AS1的作用机制,为治疗提供依据和靶点。方法:1、检测AB007962在胃癌组织中的相对表达水平(1)实时定量PCR技术检测AB007962在胃癌组织及其配对非癌组织中的表达水平。(2)Wilcoxon符号秩检验对胃癌组织及其配对非癌组织中AB007962的表达水平进行比较。2、分析AB007962在胃癌组织中的相对表达量与临床病理特征和预后之间的相关性(1)应用非参数检验(Manner-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验)分析AB007962在胃癌组织中的相对表达量与临床病理特征之间的关系。(2)应用Spearman相关分析统计AB007962的相对表达量与肿瘤最大径之间的相关性。(3)应用Kaplan-Meier统计总生存率和无病生存率,并绘制生存曲线。应用Log-rank检验评估胃癌病人是否存在生存差异,应用Cox比例风险模型进行单因素分析和多因素分析,明确AB007962能否作为胃癌独立预后因素。3、检测PGM5-AS1和RP11-432I5.2在结直肠癌组织中的相对表达水平(1)实时定量PCR技术检测PGM5-AS1和RP11-432I5.2在结直肠癌组织及配对非癌组织中的表达水平。(2)Wilcoxon符号秩检验对结直肠癌组织及其配对非癌组织中PGM5-AS1和RP11-432I5.2的表达水平分别进行比较。4、构建ROC曲线,根据曲线下面积(AUC)评估PGM5-AS1和RP11-432I5.2作为结直肠癌诊断标志物的能力。5、分析PGM5-AS1和RP11-432I5.2在结直肠癌组织中的相对表达量与临床病理特征和预后之间的相关性。(1)应用非参数检验(Manner-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验)分析PGM5-AS1和RP11-432I5.2在结直肠癌组织中的相对表达量与临床病理特征之间的关系。(2)应用Kaplan-Meier统计总生存率和无病生存率,并绘制生存曲线。Log-rank检验用来评估结直肠癌病人是否存在生存差异。6、PGM5-AS1对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。(1)应用CCK-8实验分别检测PGM5-AS1过表达细胞系和阴性对照(Negative control,NC)细胞系的细胞增殖能力,分析过表达PGM5-AS1对细胞增殖能力的影响。(2)应用Transwell实验分别检测PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系的迁移能力,分析过表达PGM5-AS1对细胞迁移能力的影响。7、PGM5-AS1对结直肠癌细胞凋亡和周期的影响。(1)应用流式细胞术和PI染色法检测PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系之间的凋亡变化,分析过表达PGM5-AS1对细胞凋亡能力的影响。(2)应用流式细胞术和Annexin V-APC/PI染色法检测PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系之间的周期变化,分析过表达PGM5-AS1对细胞周期的影响。8、PGM5-AS1对上皮间质转化(EMT)的影响应用Western Blot检测分别检测PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系中EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin和Snail的相应表达情况,分析PGM5-AS1对EMT过程的影响。结果:1、AB007962在胃癌组织中的表达应用实时定量PCR技术检测发现,相比于配对癌旁非癌组织,AB007962在胃癌病人组织中表达明显降低(P<0.01)。2、AB007962的相对表达量与胃癌病人的临床病理特征和预后关系(1)非参数检验发现AB007962的相对表达量与病人年龄、性别、肿瘤最大径、侵润深度、周围淋巴结转移等因素无显着统计学相关(P>0.05)。但AB007962的相对表达量与肿瘤最大径之间存在一定的趋势(P=0.078)。Spearman双变量相关分析发现AB007962相对表达量与肿瘤最大径存在负相关(P=0.023)。(2)AB007962的相对表达量与胃癌病人的总生存时间和无病生存时间之间无统计学差异(P>0.05)。亚组分析发现,AB007962的相对表达量与Lauren分型为肠型的病人总生存时间和无病生存时间存在显着统计学相关(P<0.05),即AB007962相对表达量越高,病人预后越好。(3)应用单因素和多因素分析发现,AB007962是Lauren分型为肠型的胃癌病人的独立预后因素。3、RP11-432I5.2和PGM5-AS1在结直肠癌组织中的表达(1)RP11-432I5.2在77例结直肠癌病人组织中表达显着降低(P<0.01),77例癌组织中有56例(72.7%)表达降低,21例(27.3%)在癌组织中表达升高。癌组织中RP11-432I5.2的2-△CT值为0.57±1.63,非癌组织中的RP11-432I5.2的2-△CT为1.62±3.38。AUC为0.702(P<0.001),敏感度为63.6%,特异度为72.7%,RP11-432I5.2有可能作为结直肠癌诊断标志物。(2)应用实时定量PCR技术检测发现,相比于配对癌旁非癌组织,PGM5-AS1在103例结直肠癌病人组织中表达显着降低(P<0.01)。其中,95例(92.24%)在癌组织中表达降低,8例(7.76%)PGM5-AS1在癌组织中表达升高。结直肠癌组织中PGM5-AS1的2-△CT值为0.10±0.32,癌旁非癌组织中的PGM5-AS1的2-△CT为3.72±14.25。构建ROC曲线分析发现AUC为0.859(P<0.001),敏感度为87.4%,特异度为72.8%,PGM5-AS1在结直肠癌中具有较高的诊断效能,可能作为结直肠癌潜在的诊断标志物。4、PGM5-AS1和RP11-432I5.2的相对表达量与结直肠癌病人的临床病理特征和预后的关系(1)PGM5-AS1和RP11-432I5.2的相对表达量与病人年龄、性别、肿瘤最大径、浸润深度、周围淋巴结转移等因素均无统计学相关(P>0.05)。(2)PGM5-AS1和RP11-432I5.2的相对表达量与病人预后无统计学相关(P>0.05)。5、PGM5-AS1对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响(1)通过CCK8实验结果并未发现PGM5-AS1对结直肠癌细胞的增殖能力有影响(P>0.05)。(2)通过Transwell小室实验结果发现PGM5-AS1能够抑制细胞的迁移能力,PGM5-AS1稳定过表达细胞系的迁移能力较NC细胞系弱(P<0.05)。6、PGM5-AS1对结直肠癌细胞凋亡和周期的影响(1)流式细胞术检测细胞凋亡,未发现PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系的凋亡率之间存在统计学差异(P>0.05)。(2)流式细胞术检测细胞周期,未发现PGM5-AS1稳定过表达细胞系和NC细胞系的各周期的比例存在统计学差异(P>0.05)。7、PGM5-AS1对上皮间质转化(EMT)的影响Western Blot实验结果表明,PGM5-AS1稳定过表达细胞系中E-cadherin蛋白表达较NC细胞系中明显增加,N-cadherin和Snail蛋白表达比NC细胞系中明显减低,PGM5-AS1能够抑制EMT的过程。结论:1、AB007962在胃癌组织中的表达水平低于癌旁非癌组织,AB007962的相对表达量与肿瘤最大径呈负相关。AB007962是Lauren分型为肠型的胃癌病人的独立预后因素。2、RP11-432I5.2在结直肠癌组织中的表达水平显着低于癌旁非癌组织,并有可能作为结直肠癌的诊断标志物。3、PGM5-AS1在结直肠癌组织中的表达水平显着低于癌旁非癌组织,PGM5-AS1能够作为结直肠癌诊断标志物。PGM5-AS1能够显着抑制细胞的迁移能力,PGM5-AS1通过下调Snail、N-cadherin并上调E-cadherin蛋白表达水平抑制EMT的进展。
陈辉[4](2017)在《原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究》文中研究表明目的蛋白质组学技术筛选肝癌病人组织体外培养分泌蛋白,寻找肝癌诊断潜在的候选标志物,通过GO和IPA分析,初步探讨其在肝癌发生发展的分子机制,并结合病人临床资料,验证差异蛋白在肝癌诊断、复发预测及预后评估中的作用。方法1.无血清培养肝癌组织、癌旁组织以及远癌组织,对不同培养时间的组织进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、TUNEL(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)细胞凋亡及免疫蛋白印迹(Western Blot,WB)检测优化获得分泌蛋白的最佳时间。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS)技术分析肝癌组织体外无血清培养分泌蛋白,筛选差异表达分泌蛋白,初步了解肝癌组织分泌蛋白质组学的特征。3.对筛选到的差异表达分泌蛋白进行GO(Gene Ontology)和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析。GO分析包括亚细胞定位(Cell component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)及生物过程(Biological Process,BP)分类,IPA分析差异表达蛋白的生物通路和蛋白质相互作用网络。4.收集49例HCC病人术前血清及23例配对健康人血清,平行反应监视(Parallel reaction monitoring,PRM)分析差异分泌蛋白CA2、KRT19在HCC病人和健康人中的血清浓度。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)比较CA 2、KRT 19单独及联合诊断肝癌的能力。另收集82例肝癌病人术后血清标本,ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,)检测差异表达蛋白CA 2在肝癌病人中的血清浓度,Logistic回归分析HCC病人血清CA 2浓度与临床病理特征的关系和术后复发转移的关系,生存曲线分析HCC病人血清CA2浓度与肝癌复发以及生存率之间的关系。结果1.对肝癌组织进行体外无血清培养并提取分泌蛋白,对不同培养时间的组织进行HE染色,细胞凋亡检测,结果发现肝癌组织培养24小时是提取分泌蛋白的最好时间点。Western Blot检测发现提取的分泌蛋白无胞内蛋白污染。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术分析肝癌组织体外无血清培养的分泌蛋白质组学差异,共鉴定出2388种分泌蛋白,这些蛋白符合分泌蛋白的蛋白组学特征。癌组织与远癌组织比较发现36个差异分泌蛋白,其中表达上调14个,表达下调22个;癌旁组织与远癌组织比较发现90个差异分泌蛋白,其中表达上调27个,表达下调63个;两组有24个共同的差异表达蛋白,其中有11个表达上调,13个表达下调。3.对差异分泌蛋白进行GO和IPA分析。癌组织与远癌组织(C/F组)的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程、与生长发育相关的进程、肿瘤微环境改变等;癌旁组织与远癌组织(P/F组)的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程,特别是含硫化合物的代谢,以及酶抑制等。IPA分析发现C/F组的差异分泌蛋白主要以胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)为中心的调控网络,P/F组的差异分泌蛋白主要以磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝氨酸激酶(Phosphatidylinosit ol 3 kinase/Serine/threonine kinase,PI3K/AKT)为中心的调控网络,两组共同的差异表达蛋白主要以核转录因子κB(Transcription factor nuclear factor-κB,NF-κB)为中心的调控网络。4.PRM分析差异分泌蛋白碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2,CA2)、细胞角蛋白19(Keratin,type I cytoskeletal 19,KRT19)在HCC病人和健康人中的血清浓度,结果表明CA2和KRT19肝癌病人的血清中的表达量显着高于其在正常人血清中的含量。ROC分析CA2和KRT19诊断肝癌的曲线下面积分别是0.715和0.728,CA2与KRT19联合诊断肝癌的AUC为0.817(P=0.000),敏感性为67.3%,特异性为87%。ELISA法检测差异表达蛋白CA2在肝癌术后病人中的血清浓度,CA2在肝癌复发病人血清中的浓度显着高于未复发病人(P<0.05)。Logistic回归发现CA2表达与肿瘤数目(P=0.026)和BCLC分期(P=0.042)显着相关,CA2为影响HCC根治性切除术后复发/转移的独立危险因素(P<0.05)。生存曲线分析发现CA2低浓度的肝癌病人的无复发生存率显着高于CA2高浓度的肝癌病人(P<0.05)。结论1.体外培养肝癌组织并提取分泌蛋白的方法可靠。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术可以筛选出一系列原发性肝癌组织相关差异分泌蛋白,这些差异蛋白有望成为肝癌诊断潜在的候选标志物。3.含硫氨基酸代谢紊乱与肝癌的早期发生关系密切,乙醇代谢紊乱在肝癌发生、发展中起着重要作用。CA2、KRT19可能通过ERK、AKT/PI3K、NF-k B蛋白-蛋白相互作用网络通路促进肝癌的发生发展。4.CA2和KRT19有望成为肝癌诊断的候选标志物;CA2还可用于肝癌病人术后复发转移的预测及无复发生存率的评估。
董炤,刘秀珍,刘从彬,彭代银[5](2010)在《血栓调节蛋白的临床研究进展》文中研究说明血栓调节蛋白(thrombomodu lin,TM)是1981年首次由Esmon等确认并提出的一种存在于细胞膜表面的跨膜糖蛋白。近年研究表明,TM普遍存在于血管内皮细胞表面,通过与凝血酶结合和激活蛋白C系统发挥抗凝作用。正常生理状态下,TM分布于细胞质膜表面。当血管内皮细胞受到损伤后,常常引起TM的分泌异常和释放入血。目前在医学研究中已把TM当成内皮细胞损伤的标志物,用于临床上疾病的诊断和鉴别。本文就近年来TM在临床疾病中的研究进展进行综述,为TM作为内皮细胞损伤标志物的深入研究进一步提供理论依据。
张吉才[6](2007)在《乙型肝炎病毒相关肝癌p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化及机制》文中认为第一部分HBV相关肝癌p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化目的抑癌基因甲基化、p16INK4A等基因表达失活和HBV感染均为肝癌形成过程中的常见现象,但他们之间的相互关系并不清楚。本文旨在探讨:(1)肝癌p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化情况;(2)p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化形成是否与HBV感染有关。方法采用ELISA法检测HBV感染标志物;用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取组织DNA,用血液微量DNA提取试剂提取术前外周血液中DNA,经重亚硫酸钠转换,将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶,再经纯化,甲基化特异性聚合酶链反应。用甲基化特异性PCR检测抑癌基因甲基化产物;用实时定量PCR检测HBV-DNA和抑癌基因表达水平;用SPSS12.0软件进行统计分析。结果共检测了44例肝癌组织DNA中p14ARF、p15INK4B、p16INK4A和RB的甲基化情况,上述四个基因的甲基化产物检测频率分别为:15/44(34.1%), 25/44(56.8%), 31/44(70.5%)和12/44(27.3%)。不同年龄、性别、肿瘤分化程度和临床分期的肝癌患者各个甲基化率没有明显差异。上述基因甲基化以不同频率见于肝硬化组织中,分别为17.1%,28.9%,36.6%和7.3%。从癌旁组织中也检测到5例甲基化阳性产物,其中p16INK4A4例,p15INK4B阳性1例,它们均见于HBV标志物阳性的组织中;p16INK4A阳性4例中有1例见于HBsAg+、HBeAg+,3例见于HBsAg+、HBeAg-的组织中;未检测到p14ARF和RB基因甲基化产物。肝硬化患者血液中也检测到p16INK4A、p15INK4B和p14ARF甲基化产物,阳性率分别为23.9%、17.4%和6.5%;肝炎患者血液中仅有p16INK4A、p15INK4B甲基化产物,阳性率分别为5.5%和5%。正常对照组中未检测到上述基因甲基化产物。HBV感染相关肝癌基因甲基化率高于非HBV相关肝癌,除p14ARF和RB外,HBV感染相关肝癌组和非HBV感染相关的肝癌组p15INK4B和p16INK4A甲基化频率存在显着差异(p<0.05),而在HBV感染肝癌组内,不同感染状态之间三者甲基化率没有明显差异。经相关分析发现:(1) p14ARF、p15INK4B、p16INK4A甲基化与HBV感染明显相关,特别是HBsAg;(2) p15INK4B甲基化与p16INK4A甲基化有一定关系;(3)在上述因素中,HBV感染,p16INK4A甲基化可能是肝癌形成中重要的因素之一。HBV相关肝硬化患者血液及肝癌患者肝硬化组织和癌组织中p14ARF、p15INK4B和p16INK4A的甲基化率高于非HBV相关的相应样本和基因的甲基化率。HBV-DNA阳性的样本中基因甲基化阳性率,如癌组织中p15INK4B、p16INK4A,肝硬化组织和肝硬化患者血液中的p16INK4A,明显高于HBV-DNA阴性的标本;相关分析显示:HBV-DNA与基因甲基化明显相关(p=0.047 for p14ARF,0.03 for p15INK4B,0.002 for p16INK4A);HBV感染与p14ARF、p15INK4B和p16INK4A的甲基化相关(p分别为0.048,0.035和0.02),HBV感染标志物中HBsAg、HBV-DNA与上述基因甲基化密切相关(p<0.05)。结论上述结果提示:HBV感染可导致抑癌基因p15INK4B、p16INK4A启动子异常甲基化,进而导致相应基因表达失活,细胞周期调节失控,肝细胞无限增殖,恶性转化,最后形成肝癌。HBV的这种作用可能是其致肝癌的作用机制之一。第二部分HBV诱导基因甲基化的机制目的肿瘤发生CpG岛超甲基化的确切机制尚不清楚,可能与多种因素有关,包括DNMT(DNA methyltransferase,DNMT)水平,致癌物接触、基因修复缺陷等,其中DNMT是调节甲基化的主要因素。在第一部分发现HBV有促进抑癌基因甲基化作用,但其机制不明。推测:HBV感染可能也通过增强DNMT1、2、3A和3B的表达,而使p14ARF,RB和INK4家族中某些成员发生异常甲基化。为此,我们分析了肝癌细胞系(HepG3B、Hep G2)、HBV相关肝癌和非HBV相关肝癌患者的癌组织、癌旁组织和肝硬化相关组织中上述四种DNMT的mRNA表达情况。方法提取上述组织RNA后,逆转录为cDNA,用实时定量PCR检测DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、GAPDH和H4表达水平mRNA,将DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B表达水平与GAPDH和H4进行比较。结果肝癌患者硬化组织和癌组织中四种DNMT mRNA水平高于相应非癌组织;在肝硬化组织中DNMT升高呈现选择性,部分病例DNMT1和/或2升高,部分DNMT3A和/或DNMT3B,病例中呈现四种DNMT的随机组合。与非癌组织比较,11/35 (31.4%)肝硬化组织、24/44 (54.5%)癌组织中DNMT1升高,其平均水平也明显高于于非癌组织(p=0.009 for cancerous tissue, p=0.02 for cirrhotic tissue)。肝硬化组织和癌组织中DNMT2平均水平,与非癌组织相比没有显着差异(p=0.12 for cancerous and p=0.35 for cirrhotic tissues), 8/44(18.2%)癌组织和4/35 (11.4%)肝硬化组织中DNMT2升高。DNMT3A的情况与DNMT1相似,30/44 (68.2%)癌组织和14/35(40%)肝硬化组织中DNMT3A升高,癌组织和肝硬化组织中DNMT3A的平均水平也明显高于相应非癌组织(p=0.005 for cancerous and 0.01 for non-cancerous tissues)。17/44(38.6%)癌组织和9/35(25.8%)硬化组织中DNMT3BmRNA表达水平升高,其平均水平也明显高于相应非癌组织(p=0.03 for cancerous and 0.036 for cirrhotic tissues)。从非癌组织-肝硬化组织-癌组织,不仅DNMTs水平逐步升高,升高的DNMT的种类也呈现逐步增多趋势,从1-2种到2-3甚至4种。不同年龄、性别、分化程度和分级肝癌中DNMTs表达水平没有显着差异(p=0.23 for DNMT1, p=0.45 for DNMT2, p=0.32 for DNMT3A andp=0.36 for DNMT3B),但在男性患者、低分化和高分期的肝癌患者DNMTs有增高趋势。所有甲基化病例癌组织至少有一种DNMTs表达增加,58 %( 18/31)有两种表达升高,42 %(13/31)有三种DNMT表达升高。不同病例之间升高的DNMT有所不同,主要是DNMT1,3A和3B.相关分析显示:DNMT1, 3A and 3B与p16INK4A甲基化显着相关(p=0.0013, 0.025 and 0.041);DNMT1, 3A与p15INK4B甲基相关(p=0.005和0.04);DNMT1与p14甲基化相关(p=0.034);但未发现某种DNMT与RB甲基化密切相关(p>0.05)。根据HBV感染状态,将所有组织样品分成两组。一组:在血液或组织中可检测到至少一种HBV感染的标志物,另一组血液或组织中未检测到HBV或HCV感染标志物。HBV感染相关癌组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织(p= 0.001 for DNMT1, 0.006 for DNMT3A and 0.02 for DNMT3B); HBV感染相关硬化组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平也明显高于非HBV感染相关硬化组织(p=0.007 for DNMT1, 0.008 for DNMT3A and 0.045 for DNMT3B);即使在非癌组织,HBV感染相关组织中DNMT1、3A mRNA水平明显高于非HBV感染相关组织(p=0.01 for DNMT1,for 0.04 DNMT3A)。DNMT2在所有组织中(p>0.05), DNMT3B在HBV相关非癌组织无明显差异(p=0.76)。在HBV相关组织进行进一步分组分析,不论是HBsAg+,HBeAg+组、还是HBsAg+, HBeAg-组或其他标志物阳性组,均未发现四种DNMTsmRNA表达水平之间存在显着差异(p=0.48)。与非HBV感染相关肝癌细胞系(HepG2)相比,HBV相关肝癌细胞系(Hep3B)中DNMT1, 2,3A和3B水平高2.0,1.2,3和1.8倍。HBV感染与DNMTs表达相关分析结果显示:HBV感染与DNMT表达(p=0.009 for DNMT1,0.006 for DNMT3A, 0.03 for DNMT3B。HBV感染有关指标中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA与DNMT1表达密切相关(p分别为0.008,0.032和0.006);HBsAg、HBV-DNA与DNMT3A(p=0.025和0.003)和3B相关(p=0.029和0.008);HBsAg、HBeAg、HBV-DNA与DNMT2无明显相关(p分别为0.45,0.82,0.098)。结论HBV感染相关癌组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织。DNMT的表达在肝癌患者的硬化组织中DNMT1、3A和3B mRNA也明显高于非HBV感染相关组织;即使在HBV感染相关的非癌组织中DNMT1和DNMT3A表达水平也高于非HBV相关的。这些说明:HBV感染可能刺激DNMT表达,进而促进抑癌基因甲基化。第三部分血清或血浆p16INK4A甲基化检测在肝癌诊断中的作用目的探讨p16INK4A启动子异常甲基化在肝癌分子诊断中的应用价值。方法用血液微量DNA提取试剂提取术前外周血液中DNA。经重亚硫酸钠转换,将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶,再经纯化,甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)后,检测p16INK4A启动子甲基化产物,并将其敏感度、特异度等指标与甲胎蛋白(AFP)进行比较。结果70.5%(31/44)的肝癌组织DNA存在p16INK4A启动子异常甲基化,其中有29例血浆DNA中也同时检出p16INK4A启动子异常甲基化产物,检出率为90.5%(29/31),13例癌组织中未检出p16INK4A甲基化的患者其血浆DNA中亦未检测到p16INK4A甲基化产物。肝炎、肝硬化患者血液中也检测到p16INK4A甲基化产物,阳性率分别为5.5%和23.9%、正常对照组中未检测到上述基因甲基化产物。与AFP相比,p16INK4A甲基化的检测在灵敏度、特异性和准确性上略高于AFP。结论血浆p16INK4A启动子甲基化的检测可能作为一种潜在的独立的非侵入性的肝癌分子诊断标志物。第四部分基因甲基化、HBV感染与肝病患者血浆同型半胱氨酸之间的关系目的检测肝脏疾病血浆t-Hcy水平,探讨基因甲基化、HBV感染与肝病患者血浆同型半胱氨酸之间的关系。方法血浆Hcy测定用化学发光法,试剂为美国ABBOTT公司产品,按说明书操作。用SPSS12.0比较组间差异。结果从HBV携带者、慢性肝病、肝硬化到肝癌,血浆Hcy水平不断增加,以肝硬化和肝癌最为明显,分别为(8.84±2.74),(11.83±3.39),(14.46±3.51),(16.78±4. 40)μmol /L,除HBV携带者、慢性肝病外其他各组血浆t-Hcy水平均高于健康对照组(p=0.008肝硬化,p=0.000肝癌);根据HBV感染状态分组分析结果显示:HBV感染相关的肝硬化、肝癌患者血t-Hcy水平明显高于相应非HBV感染患者(p=0.023肝硬化,p=0.003肝癌);根据抑癌基因甲基化状态分组结果显示:抑癌基因甲基化阳性的肝硬化、肝癌患者t-Hcy水平也明显高于甲基化阴性的相应患者(p=0.004肝硬化,p=0.000肝癌)。结论从HBV携带者、慢性肝病、肝硬化到肝癌,随着疾病严重程度的加剧,血中hcy水平呈逐步升高趋势;并且hcy水平升高与抑癌基因异常甲基化和HBV感染有一定关系。说明HBV感染和基因异常甲基化可能引起血浆t-Hcy升高,hcy在慢性肝脏疾病的发病机制中起一定作用,血中hcy的检测可以作为反映肝脏功能和疾病进展趋势的一项辅助指标。
高维强[7](2004)在《血管性血友病因子裂解酶单克隆抗体的制备及该酶与血栓和肿瘤发病的关系》文中提出血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp/ADAMTS13)是新近发现的一种血浆金属蛋白酶,它主要水解大分子量的血管性血友病因子(vWF)多聚体成小分子的肽段。vWF是人体内止血与血栓形成中的主要糖蛋白之一,vWF多聚体的大小与其功能密切相关,它的分子量越大,则与胶原和血小板的结合能力越强。因此,vWF-cp可以通过对vWF多聚体大小的调控来调节vWF多聚体与内皮下胶原和血小板的粘附能力,从而影响血栓的形成。vWF-cp活性的缺乏导致血浆中超大分子量的vWF多聚体(UL-vWF)出现并在微血管内聚积,引发血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。此外,动脉血栓性疾病、恶性肿瘤以及肝脏疾病等均伴有vWF含量的增高,但其原因尚不清楚,而且在上述疾病中多伴有vWF-cp活性水平的下降。本研究克隆和表达了vWF-cp的金属蛋白酶域,以此为抗原制备了该酶的单克隆抗体,为vWF-cp抗原水平的检测及其结构与功能的研究奠定了基础;同时,还了解了vWF-cp在血栓性疾病与肿瘤患者中表达的改变,探索了该酶在上述疾病发病中的作用和临床意义。 一 vWF-cp的表达及其单克隆抗体的制备 血浆中vWF-cp蛋白的氨基端为金属蛋白酶域,该结构域内含有一段与蛇毒金属蛋白酶活性中心一致的氨基酸序列,其中的三个组氨酸与Zn2+构成该酶的活性区,可能是直接降解vWF多聚体的部位。所以,该结构域对vWF-cp降解其底物极为重要。 我们根据GenBank中vWF-cp cDNA序列设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)从含vWF-cp cDNA质粒中扩增出该酶的活性域,克隆至pUC18载体后行序列分析,并将其重组于带有6×His Tag的融合蛋白表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌DE3/plySs中诱导表达。重组蛋白经Ni-NTA柱纯化后,采用蛋白印迹(Western blot)鉴定。结果显示,PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域基因片段,测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒pET28a(+)-vWF-cp/MD经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的28%。Western blot结果显示,重组蛋白能够特异地与抗His Tag的单抗Penta-His反应。将纯化的重组蛋白免疫Bal b/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得三株稳定分泌抗vWF-cp活性域单抗的细胞株,两次单克隆后,收集细胞接种于小鼠腹腔产生腹水。对其中两株单抗SZ-112和SZ-113的进一步鉴定结果显示,它们均属血管性血友病因子裂解醉单克隆抗体的制备及该醉与血栓和肿右发病的关系中文摘要IgG:亚类,腹水中的含量约为4m创d,效价达1 x 10-5,而且识别v认T一金属蛋白酶域不同的表位。从触滋em blot证实这两株单抗能够识别还原及非还原条件下的重组蛋白。免疫沉淀和W七引哈m blot结果显示,两株单抗能够识别正常人血小板裂解液中200 KDa的蛋白;进一步用流式细胞术鉴定单抗,发现它们能够与经穿膜处理的血小板结合,但不与经穿膜处理的白细胞、红细胞以及未经穿膜处理的血小板结合。上述结果表明,我们应用重组蛋白制备出一组针对v场T却活性域的单抗,其中两株单抗的抗原识别位点不同,为我们利用单抗研究vWF一金属蛋白酶域的功能以及建立检测血浆vWF一cP抗原水平的方法奠定了基础。 另外,利用所制备的单抗结合免疫组化分析了各种正常组织中vWF一p蛋白的表达情况,证实了vWF一p仅在细胞胞质中表达,而在细胞膜表面和细胞核中不存在。在甲状腺、肺、肾脏、小肠、前列腺内vWF一cP主要局限在各组织的上皮细胞中,而在正常肝、脾、胸腺的组织细胞中有表达,脑组织中未见表达。 同时,我们采用PCR一SOE(PCR一重叠延伸技术)结合酶切的方法构建了含有vWF一cP cDNA全长4284bP的真核表达质粒peDNA3.1一v认T.cp,经PCR扩增、酶切鉴定及测序分析,均证实了克隆的vWF一cP cDNA序列的正确性.通过脂质体介导将PcDNA3 .1一vWF一cP质粒转染CHO细胞,Westem blot分析转染后的CHO细胞培养上清和细胞裂解液中vWF一cP的表达情况,发现均存在该酶的表达。这将有助于我们建立该酶稳定表达细胞株,制备重组人vWF仰用于丁即的治疗。二血栓性疾病患者v、vF一水平的改变及v、vF一基因C1423T多态性的研究 vWF是介导血小板与内皮下组织粘附并进而形成血栓的主要分子,其中大分子量的多聚体作用更强。因此,vWF一cP活性的降低可能会促使血管内富血小板血栓的形成。近来己明确,存在先天性的vWI、cP基因缺陷或在血浆中产生针对该酶的自身抗体,导致血浆中出现uL*wF是TTp致病的原因之一。一些vWF一印的基因突变和多态性在家族性了即患者中被确定,C1423T多态性是目前报道的唯一可能与vWF却活性有关的多态性。该多态性使v认T一蛋白中475位脯氨酸被丝氨酸取代 (P475s)。在发现C 1423T多态性的家系中,携带T等位基因的两个成员均为1423C汀杂合子,其血浆vWF一p活性显着降低。体外定点诱变也证实它影响vWF却的活性。 本研究中我们分别检测了52例急性脑梗死(赶S)、22例急性心肌梗死(AMI)患者和47例年龄与之相匹配的健康对照血浆vWF抗原水平(vWF:Ag)、血型、vWF血管性血友病因子裂解醉单克隆抗体的制备及该醉与血栓和肿亩发病的关系中文摘要胶原结合活
冷怀明[8](2002)在《《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中进行了进一步梳理
陈小波[9](2021)在《miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究》文中提出[背景与目的]1999年Maniotis[1]]第一次在高侵袭性的黑色素瘤中发现了一种新的管道样结构,被称为血管生成拟态(vasculogenic mimiory VM)。构成血管生成拟态的管壁如:层粘连蛋白、肝素硫酸盐蛋白多糖、Ⅳ胶原蛋白等是富含PAS染色阳性的细胞外基质,其血管内皮细胞特异标记免疫组化染色(FVlllRag、Ules、cD31、CD34、KDR等)阴性。这些通道与肿瘤血管相连,为肿瘤组织提供血供。血管生成拟态与内皮依赖血管最显着区别是,内皮细胞围成的血管CD31染色阳性而PAS染色阴性,而血管生成拟态管壁呈PAS阳性而CD31染色阴性。miRNAs与血管生成拟态在恶性肿瘤的转移中起着重要作用,相关研究发现miRNAs可以通过调节血管生成拟态的形成而引起恶性肿瘤侵袭性、转移能力的改变。但血管生成拟态和miRNAs之间的具体关系以及调控信号通路尚未明确。我们研究团队前期研究发现:肺癌患者血液中miR-9-5P较肺良性肿瘤患者显着上调、miR-9-5P在肺癌癌组织中较癌旁正常肺组织中显着上调。相关研究报道miR-9-5P可以调节恶性肿瘤血管生成拟态的形成,但在肺癌研究中的相关报道很少。本研究拟测定NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态的形成情况,通过体内、体外实验,探究上调、下调miR-9-5P对NSCLC增殖、迁移、侵袭等和血管生成拟态形成的影响,初步探究miR-9-5P的靶基因及相关通路,探讨miR-9-5P在NSCLC中扮演的角色及其作用机制,希望为肺癌诊断、靶向药物设计提供实验依据。[方法]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义收集60例手术治疗的NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织,应用qPCR检测NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织中miR-9-5P的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系;应用免疫组化、CD31/PAS双重染色方法检测NSCLC癌组织中血管生成拟态的形成情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响以A549、NCI-H1299为实验细胞株,通过质粒转染的方法分别上调及下调miR-9-5P,并筛选出相应的稳定转染细胞株,qPCR验证miR-9-5P转染效率;CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕试验、Transwell侵袭试验、细胞凋亡检测实验、三维细胞培养实验检测miR-9-5P对NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭、凋亡及管道形成能力的影响。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制研究应用TargetScan、PicTar和miRanda基因预测软件筛选miR-9-5P的靶基因,再用双荧光素酶报告基因实验进行验证;Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中E-cadherin的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中E-cadherin的表达,验证miR-9-5P与E-cadherin的相关性。Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,验证miR-9-5P对NSCLC中血管生成拟态相关蛋白的影响。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤和移植瘤中血管生成拟态形成的影响研究以稳定上调、下调miR-9-5P的A549、NCI-H1299为实验细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较上调、下调miR-9-5P对NSCLC细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响;应用免疫组化、CD31/PAS双染检测不同miR-9-5P水平移植瘤中血管生成拟态的形成情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中血管生成拟态形成能力的影响;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达情况;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中EMT关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的影响,进一步验证miR-9-5P对NSCLC和血管生成拟态形成的影响。[结果]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义NSCLC患者的癌组织中miR-9-5P较癌旁正常肺组织明显上调;miR-9-5P上调明显组与miR-9-5P上调不明显组相比:鳞癌比率更高、Ⅲ期比率更高,但差异无统计学意义(P>0.05),低分化癌比率更高(P<0.05)。NSCLC患者的癌组织中有血管生成拟态形成,低分化肿瘤较中高分化肿瘤更容易形成血管生成拟态(P<0.01);Ⅲ期肿瘤较Ⅰ+Ⅱ期肿瘤更容易形成血管生成拟态(P<0.0 1)。血管生成拟态阳性组癌组织中miR-9-5P较血管生成拟态阴性组明显上调。miR-9-5P和血管生成拟态是NSCLC病理差分化的一个指标,两者成正相关。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响与对照组相比,上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的增殖能力,而且随着培养时间延长,差异越明显。上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力和管道形成能力;下调miR-9-5P后结果与上述结果相反。但上调、下调miR-9-5P后A549和H1299细胞均未出现明显的细胞凋亡现象。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制生物信息预测E-cadherin是miR-9-5P的潜在靶基因之一,双荧光素酶报告基因实验验证miR-9-5P可直接靶向作用于E-cadherin。Western Blot检测NSCLC肺癌组织中血管生成拟态相关蛋白发现:miR-9-5P上调明显组癌组织中E-cadherin的表达高于上调不明显组、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达低于上调不明显组。Western blot检测A549、H1299细胞株发现:上调miR-9-5P的细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显下降,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现上升,下调miR-9-5P细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显上升,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现下降。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤模和移植瘤中血管生成拟态形成的影响裸鼠移植瘤实验发现:与对照组相比,上调、下调miR-9-5P组裸鼠体重增长、成瘤能力无差异;下调miR-9-5P组移植瘤生长速度慢、肿瘤体积小,质量轻;上调miR-9-5P组与对照组相比未见差异。裸鼠移植瘤组织免疫组化、CD31/PAS双染发现:移植瘤肿瘤中有血管生成拟态形成。但因例数少(每组6例),各组间无差异。免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤组织中EMT发生的关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白发现:上调miR-9-5P组EMT发生的关键蛋白E-cadherin表达降低;血管生成拟态相关蛋白MMP2、MMP9和VE-cadherin表达升高,下调miR-9-5P组结果与上述结果相反。[结论]1.miR-9-5P、血管生成拟态形成与NSCLC肿瘤分化程度、病理分期等呈负相关,两者之间呈正相关,miR-9-5P上调、血管生成拟态形成可能是临床预后不良的一个指标。2.抑制miR-9-5P能抑制NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭和管道形成能力,并且能减慢裸鼠移植瘤生长,提示miR-9-5P有可能作为肺癌治疗的一个潜在靶点。3.miR-9-5P降低NSCLC EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达,增加血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,EMT通路可能是miR-9-5P调节NSCLC生长和血管生成拟态形成的信号通路之一。
赵鑫[10](2021)在《基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究》文中认为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤之一,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)的感染是HCC的主要病因。目前HCC占我国所有新发癌症病例的第五位,所有癌症致死性疾病的第二位,严重危害着人类健康。HCC的早期诊断、综合及个体化治疗、治疗后监测复发及远处转移,是提高肝癌诊断率及治愈率的重要手段。MiRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用,与细胞生长、代谢、凋亡、肿瘤发生、肿瘤细胞侵袭性以及肿瘤治疗等方面存在密切关系。迄今为止,许多研究证实了miRNA在多种恶性肿瘤中的异常表达,如乳腺癌、脑癌、大肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌等。在肝癌中,miRNA可作为诊断标记物miRNA辅助临床肝癌诊治,同时也通过多种细胞信号通路影响肝癌发生发展。自噬(Autophagy)作为细胞的一种自我保护机制,与肿瘤发生息息相关。由于自噬与细胞代谢、蛋白质和细胞器周转、细胞生存等密切相关,所以自噬在肿瘤中的作用呈现动态及多样性变化,具有高度的复杂性。MiRNA如何调节自噬过程至今尚未明确,持续发现的调节自噬新的miRNA提示我们,miRNA作为重要分子可通过靶向调控自噬相关基因的表达,影响自噬的过程,调节疾病进展,因此值得进一步探索异常表达的miRNA调控自噬与疾病进展的关系。本研究通过公共数据库筛选与肝癌自噬相关的miRNA,并分析它们的临床意义;在肝癌细胞系,通过缺氧诱导自噬,收集各组细胞进行miRNA和mRNA测序,根据转录组测序数据分析不同肝癌细胞中自噬相关miRNA及其可能作用机制;并初步确定参与肝癌自噬的关键miRNA及其靶基因;稳定过表达/抑制miRNA后检测自噬活性,观察自噬现象,检测miRNA下游信号通路基因变化,为miRNA在HCC诊断、治疗及随访提供理论及实验基础。第一部分:基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值目的:筛选潜在的HCC诊断生物标志物,初步确定具有诊断潜力的miRNA。方法:根据癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas database,T CGA)数据库,通过随机森林算法初步确定最具诊断价值的差异表达的miRNA。建立分类模型以区分患有肝细胞癌的患者和正常个体,然后在差异表达的miRNA和mRNA之间构建调控网络。使用GSE63046数据集来验证鉴定出的差异表达miRNA的表达,同时进行差异表达miRNA的诊断和预后分析。结果:1.总共发现14个差异表达的miRNA(均上调)和2,982个差异表达的mRNA(1,989个上调和993下调),其中hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p被认为可能是肝细胞癌诊断生物标志物;2.这五个miRNA靶向的mRNA包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST,FOXO1。“胆汁酸的生物合成和胆固醇代谢”通路是这些靶标mRNA最富集的信号通路;3.初步确定的五个miRNA的验证与GSE63046数据集验证结果一致;4.Hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-10b-3p可能对肝细胞癌患者预后具有重要的价值。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物。2.5个miRNA靶向的mRNA(包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST和FOXO1)差异表达水平可能与肝细胞癌的发生有关。第二部分:MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究目的:肝癌差异表达miRNA的临床体外验证。方法:留取7例肝细胞癌肝癌组织及癌旁2cm癌旁组织,应用RT-q PCR方法定量分析肝癌差异表达miRNA(hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p、hsa-miR-182-5p)组织水平。结果:7名HCC患者中5个差异表达的miRNA的表达水平全部上调,并且hsa-miR-224-5p上调最为显着,与第一部分的生物信息学分析结果一致。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物2.肝组织样本miRNA水平与公共数据集研究结果一致。第三部分:基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究目的:探索肝癌自噬相关新分子,进一步阐明其在调控自噬影响肝癌中进展的作用机制。方法:本部分首先建立缺氧诱导的细胞自噬模型,通过电子显微镜观察自噬泡的数量。Western Blot和Transwell实验分析自噬相关蛋白表达水平和细胞侵袭力。转录组测序分析对照组和低氧组肝癌细胞差异表达的mRNA和miRNA。建立miRNA-mRNA相互作用网络和miRNA靶向的基因的功能富集分析探索缺氧诱导肝癌自噬的潜在机制。结果:1.我们发现缺氧可能通过诱导自噬促进肝癌细胞的侵袭;2.与正常对照组相比,诱导HCCLM3自噬组和SMMC-7721自噬组中共鉴定出407个共享mRNA和57个共享miRNA。此外,278个mRNA属于癌症自噬特异性mRNA,24个miRNA被鉴定为癌自噬特异性miRNA。小结:1.基于miRNA-mRNA相互作用网络获得了19种高度表达的miRNA。2.Hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的潜在分子标记物。结论:1.Hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p可能是肝细胞癌诊断标志物。2.临床组织样本证实上述miRNA可能是临床肝癌诊断标记物。3.细胞水平探索发现,hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的重要分子。4.筛选肝癌及肝癌自噬相关miRNA有助于了解肝癌自噬的潜在分子机制,同时为临床诊断、监测预后提供新的治疗靶点。
二、肝癌病人血浆和癌组织中血栓调节蛋白的检测(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌病人血浆和癌组织中血栓调节蛋白的检测(论文提纲范文)
(1)环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略词表 |
前言 |
材料和方法 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
实验结果 |
一、CircACTN4在ICC组织中显着性高表达 |
二、CircACTN4 的表达与临床预后的关系 |
三、CircACTN4 对胆管癌细胞表型的影响 |
四、CircACTN4 调控FZD7 的表达 |
五、CircACTN4与YBX1 相互作用 |
六、CircACTN4 招募YBX1 共同激活FZD7 的转录 |
七、CircACTN4 充当miR-424-5p的分子海绵 |
八、CircACTN4 参与Wnt和 Hippo信号通路的调节 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
文献综述 环状RNA分子的研究进展及其与疾病的联系 |
参考文献 |
在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
致谢 |
(2)炎症因子在胆囊癌预后中的作用和基于ceRNA调节网络分析研究非编码RNA在肝内胆管细胞癌发病机制中的作用(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
第一部分: 炎症因子在胆囊癌预后中的作用 |
第一章 术前纤维蛋白原与白蛋白比值在胆囊癌患者中的预后意义 |
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
研究方法 |
研究结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二章 联合应用术前血浆纤维蛋白原和CA199在胆囊癌患者中的预后价值 |
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
研究方法 |
研究结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三章 术前淋巴细胞与单核细胞比率对胆囊癌患者的预后意义 |
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
研究方法 |
研究结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分: 基于ceRNA调节网络分析研究非编码RNA在肝内胆管细胞癌发病机制中的作用 |
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
研究方法 |
研究结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
文中附表 |
综述一 中性粒细胞与淋巴细胞比值在经动脉化疗栓塞治疗的不可切除的肝细胞癌患者中的预后作用 |
参考文献 |
综述二 竞争性内源性RNA在肝细胞癌中的作用 |
参考文献 |
博士期间发表论文情况 |
致谢 |
(3)长链非编码RNA AB007962、RP11-432I5.2和PGM5-AS1在胃肠癌中的表达情况及PGM5-AS1对细胞迁移的作用及机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略语 |
第一部分 :AB007962 在胃癌组织中异常低表达的临床和预后意义研究 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 临床组织样本收集 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 主要引物 |
2.2 方法 |
2.2.1 细胞培养 |
2.2.2 胃癌组织及细胞系的总RNA提取 |
2.2.3 反转录 |
2.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR) |
2.2.5 数据分析 |
3 实验结果 |
3.1 AB007962 在胃癌组织及胃癌细胞系中的表达水平 |
3.2 AB007962 的相对表达量与胃癌病人临床病理特征的关系 |
3.3 AB007962 的相对表达水平与胃癌病人预后的关系 |
3.3.1 AB007962 的相对表达水平与全组病人的生存分析 |
3.3.2 病人亚组之间的生存分析 |
3.3.3 AB007962 可能作为肠型胃癌病人的独立预后因素 |
4 讨论 |
5 结论 |
第二部分 :LncRNA-RP11-432I5.2 在结直肠癌中异常表达的诊断和预后意义的研究 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 临床样本收集 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 肠癌细胞系 |
2.1.5 主要引物 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 结直肠癌细胞培养 |
2.2.2 结直肠癌组织及细胞系的总 RNA 提取 |
2.2.3 反转录 |
2.2.4 Real-time PCR |
2.2.5 绘制受试者工作特征曲线 |
2.2.6 数据分析 |
3 实验结果 |
3.1 RP11-432I5.2 在结直肠癌组织和细胞系中低表达 |
3.2 RP11-432I5.2 对结直肠癌的诊断意义 |
3.3 RP11-432I5.2 的相对表达水平与结直肠癌病人临床病理特征的关系 |
3.4 RP11-432I5.2 与结直肠癌病人预后的关系 |
4 讨论 |
第三部分 :LncRNA-PGM5-AS1 在结直肠癌中表达情况及其对细胞迁移作用的研究 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 临床样本收集 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 肠癌细胞系 |
2.1.5 主要引物 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 结直肠癌细胞培养 |
2.2.2 结直肠癌组织及细胞系的总RNA提取 |
2.2.3 反转录 |
2.2.4 Real-time PCR |
2.2.5 绘制受试者工作特征曲线 |
2.2.6 细胞转染及稳定表达细胞系构建 |
2.2.7 细胞增殖能力检测(CCK-8 实验) |
2.2.8 细胞周期检测 |
2.2.9 细胞凋亡检测 |
2.2.10 细胞迁移能力检测 |
2.2.11 全蛋白提取 |
2.2.12 BCA法蛋白定量 |
2.2.13 Western blot实验 |
2.2.14 数据分析 |
3 实验结果 |
3.1 PGM5-AS1 在结直肠癌组织和细胞系中低表达情况 |
3.2 PGM5-AS1 对结直肠癌的诊断意义 |
3.3 PGM5-AS1 的相对表达水平与结直肠癌病人临床病理特征的关系 |
3.4 构建PGM5-AS1 过表达的稳定转染细胞系 |
3.5 PGM5-AS1 对细胞增殖能力的影响 |
3.6 PGM5-AS1 对细胞周期的影响 |
3.6 PGM5-AS1 对细胞凋亡的影响 |
3.7 PGM5-AS1 对细胞迁移能力的影响 |
3.8 PGM5-AS1 对结直肠癌细胞上皮间质转化的影响 |
4 讨论 |
5 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
在学期间科研成绩 |
致谢 |
个人简介 |
(4)原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究(论文提纲范文)
附录 英文缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
参考文献 |
第1部分 肝癌组织的体外无血清培养体系的构建 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第2部分 肝癌组织分泌蛋白的定量蛋白质组学研究 |
第一章 蛋白质组学方法筛选肝癌特异标志物 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二章 差异蛋白的生物信息学分析 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第3部分 肝癌预警蛋白的验证及临床意义分析 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
结论 |
综述 蛋白质组学在肝细胞肝癌研究领域的应用 |
参考文献 |
致谢 |
(5)血栓调节蛋白的临床研究进展(论文提纲范文)
1 TM与儿科疾病 |
1.1 TM与小儿过敏性紫癜 |
1.2 TM与小儿急性白血病 |
1.3 TM与川崎病 |
2 TM与肿瘤疾病 |
2.1 TM与子宫内膜癌 |
2.2 TM与肝癌 |
2.3 TM与乳腺癌 |
2.4 TM与结肠直肠癌 |
2.5 TM与肺癌 |
3 TM与心脑血管疾病 |
3.1 TM与原发性高血压 |
3.2 TM与冠心病 |
4 TM与血液系统疾病 |
4.1 TM与弥散性血管内凝血 |
4.2 TM与出血性疾病 |
5 TM与糖尿病 |
6 展望 |
(6)乙型肝炎病毒相关肝癌p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化及机制(论文提纲范文)
英文缩略词 |
中文摘要 |
可能的创新点 |
ABSTRACT |
第一部分 乙型肝炎病毒相关肝癌P16~(INK4A)/RB 途径相关基因异常甲基化 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 参考文献 |
第二部分 HBV 诱导抑癌基因甲基化的机制 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 参考文献 |
第三部分 血浆P16~(INK4A)启动子异常甲基化检测对肝癌分子诊断中的价值初探 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 参考文献 |
第四部分 基因甲基化、HBV 感染与肝病患者血浆同型半胱氨酸之间的关系 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 参考文献 |
综述 |
1 甲基化形成机制及生理作用 |
2 基因甲基化和肿瘤 |
3 HBV 感染与抑癌基因异常甲基化 |
4 甲基化检测方法 |
5 甲基化检测的临床价值 |
6 展望 |
7 参考文献 |
致谢 |
附录 |
(7)血管性血友病因子裂解酶单克隆抗体的制备及该酶与血栓和肿瘤发病的关系(论文提纲范文)
引言 |
第一部分 血管性血友病因子裂解酶的表达及其单克隆抗体的制备 |
第一章 血管性血友病因子裂解酶活性域的克隆和表达 |
第二章 血管性血友病因子裂解酶活性域单克隆抗体的制备和鉴定 |
第三章 血管性血友病因子裂解酶真核表达载体的构建及表达 |
第二部分 血管性血友病因子裂解酶与血栓性疾病关系的初步研究 |
第三部分 血管性血友病因子裂解酶与肿瘤 |
第一章 肿瘤患者血清血管性血友病因子裂解酶、可溶性尿激酶受体和胸腺素al水平的比较研究 |
第二章 肝癌组织血管性血友病因子裂解酶表达的改变及机制 |
结论 |
综述 |
发表文章、参与课题及获奖 |
致谢 |
(9)miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究(论文提纲范文)
缩略词表(以字母顺序排列) |
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
第一部分: 人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二部分: miR-9-5P对NSCLC细胞系生物学功能的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第三部分: miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第四部分: miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤和移植瘤中血管生成拟态形成的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
全文总结 |
综述 miRNAS调节血管生成拟态在肺癌转移中的研究进展 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(10)基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩写 |
引言 |
第一部分 基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第三部分 基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
结论 |
综述 MicroRNA与肝细胞癌的相关研究及进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
四、肝癌病人血浆和癌组织中血栓调节蛋白的检测(论文参考文献)
- [1]环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究[D]. 陈秦俊杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]炎症因子在胆囊癌预后中的作用和基于ceRNA调节网络分析研究非编码RNA在肝内胆管细胞癌发病机制中的作用[D]. 徐维宇. 北京协和医学院, 2019(02)
- [3]长链非编码RNA AB007962、RP11-432I5.2和PGM5-AS1在胃肠癌中的表达情况及PGM5-AS1对细胞迁移的作用及机制的研究[D]. 王嘉俊. 中国医科大学, 2019(01)
- [4]原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究[D]. 陈辉. 福建医科大学, 2017(04)
- [5]血栓调节蛋白的临床研究进展[J]. 董炤,刘秀珍,刘从彬,彭代银. 安徽医药, 2010(04)
- [6]乙型肝炎病毒相关肝癌p16INK4A/RB途径相关基因异常甲基化及机制[D]. 张吉才. 华中科技大学, 2007(05)
- [7]血管性血友病因子裂解酶单克隆抗体的制备及该酶与血栓和肿瘤发病的关系[D]. 高维强. 苏州大学, 2004(01)
- [8]《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2002(12)
- [9]miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究[D]. 陈小波. 昆明医科大学, 2021
- [10]基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究[D]. 赵鑫. 河北医科大学, 2021(02)