一、用复合PCR直接分型临床样品中BVDV（论文文献综述）
马振乾[1]（2019）在《猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价》文中研究指明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、败血性的高度接触性传染病,为国家法定的一类动物疫病和OIE通报性疫病之一,严重影响养猪业健康发展。近年来发现,母猪感染后呈现繁殖障碍、流产和产死胎和弱胎,有些早产仔猪呈持续性感染和先天性震颤。目前,国内应用猪瘟疫苗控制猪瘟虽然取得了很大成效,但是免疫猪群依然时常存有猪瘟的发生与流行。造成免疫猪群发生猪瘟的原因比较复杂,其中免疫程序不尽合理、疫苗质量存在问题,尤其是对免疫猪群免疫效果缺乏监测与追踪是导致猪瘟时常发生的主要原因。因此,及时跟踪与监测猪瘟免疫猪群的抗体水平,确定猪群的猪瘟疫苗免疫效果及猪瘟病毒的感染情况,发现猪瘟病毒流行毒株的遗传变异趋势,将为有效防控猪瘟的发生与流行提供有效的理论依据。本研究应用免疫学、分子生物学和病毒学等技术手段对我国2015-2017年部分地区猪瘟疫苗免疫猪群的抗体水平、猪瘟病毒的感染情况及猪瘟病毒的遗传变异进行了研究,并对猪瘟基因工程亚单位疫苗的免疫效果进行了监测与分析。同时对国内近年来新发的仔猪非典型瘟病毒感染进行了初步研究,取得了如下主要结果。一、应用ELISA方法对采自国内26个省、直辖市和自治区的2009个不同规模的养猪场共计48731份猪瘟疫苗免疫血清进行了抗体检测,结果发现在2015-2017年期间,各区域样品猪瘟抗体阳性率在68.30%82.94%之间,平均阻断率在55.60%65.60%之间;不同生长阶段猪群的猪瘟抗体监测结果显示,种猪群（后备母猪、公猪和母猪）抗体水平最好,其阳性率在79.92%88.93%之间,平均阻断率在62.48%71.55%之间;保育阶段的猪群抗体水平最差,猪瘟抗体阳性率在48.19%57.41%之间,平均阻断率在41.34%46.84%之间。在2015-2017年间,每年采集的样品猪瘟抗体平均阻断率在50.00%90.00%之间的数量所占比例都最高,在57.14%62.12%之间;采集于不同月份及年份的样品,其猪瘟抗体水平监测结果显示没有明显的变化规律。二、对采集的3069份病料应用RT-PCR方法进行猪瘟病毒核苷酸序列检测,结果表明,2016年猪瘟阳性率最高为16.40%,其次为2015年,猪瘟阳性率为13.30%,2017年猪瘟阳性率最低,为12.80%。比较采自各季度样品的猪瘟病毒检测结果,显示第二季度猪瘟病毒的检出率最高,为14.80%24.40%。对猪群猪瘟病毒及其他三种常见病毒混感进行了检测,结果显示混合感染的比例为0.98%9.24%,其中,与猪繁殖障碍与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）混感比例最高,在6.70%9.24%之间,与猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）混合感染比例最低,在0.98%1.20%之间。三、应用RT-PCR技术,对采自山东和河南的18株猪瘟流行毒株进行分子生物学分析,结果发现这18株毒株与国内外参考毒株E2核苷酸同源性在79.7%99.0%之间,与标准毒株Shimen株E2核苷酸同源性在81.0%94.7%之间,其中SD11株与疫苗毒株E2核苷酸同源性最低为79.9%,SD05株与疫苗毒株E2核苷酸同源性最高为99.2%。18株毒株E2基因推导的氨基酸与参考毒株氨基酸序列同源性在50.2%98.5%之间,与标准毒株Shimen株氨基酸序列同源性在52.1%86.9%之间,与疫苗毒株C株氨基酸序列同源性在52.1%97.7%之间,其中SD10株与疫苗毒株氨基酸序列同源性最低,HN02株与疫苗毒株氨基酸序列同源性最高。病毒序列与进化树分析发现,分离的18株流行毒株主要属于1.1亚群和2.1亚群,但以2.1亚群为主,且2.1b为优势流行毒株,占到72.22%,这表明我国猪瘟流行毒株存在遗传变异多样性。四、应用分子生物学等技术方法对河南省规模化猪场近年发生的临床上以新生仔猪震颤为主要特征的疫病进行了研究,结果从发病猪群检测出非典型瘟病毒的基因序列。扩增与测定的病毒基因序列与GenBank中的现有非典型瘟病毒进行比对分析,发现该非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus,APPV）毒株（Xuchang2018）与国外APPV分离株同源性在89.5%94.2%之间,其中与美国USA2013株同源性最高为94.2%;而与国内江西分离的七个APPV毒株的同源性最高,在90.2%97.6%之间;与国内广东三个分离株的同源性相对较低,在85.4%86.3%之间。苏木素伊红染色显示,发病猪小脑白质中有大量的空泡变性,小脑中的髓磷脂含量减少,感染动物的脑部血管周围的局部神经胶质细胞有显着的减少。本研究确定出河南省猪群存在APPV感染,该结果为本地区本病的防控打下了基础。五、对猪瘟基因工程亚单位疫苗与传统猪瘟弱毒活疫苗进行对比试验,确定了基因工程亚单位疫苗抗体维持时间。选择400头仔猪,随机分为试验组（猪瘟亚单位疫苗）与对照组（细胞苗）,每组200头仔猪,分别在免疫后0天、30天、60天、90天、125天,即30日龄、60日龄、90日龄、120日龄和155日龄进行采样,每组每次随机采血10份;试验组仔猪在30日龄颈部肌肉注射1头份猪瘟基因工程亚单位疫苗,对照组仔猪分别在30日龄和60日龄颈部肌肉注射各1头份高效猪瘟弱毒活疫苗。结果发现,试验组猪瘟抗体水平在免疫后90天达到最高,阻断率达到88.23%,随后开始下降,但155日龄仍处于较高水平,维持时间较长,并且受猪繁殖障碍与呼吸道综合征影响较小。
周军[2]（2018）在《BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒的研制及应用》文中研究说明牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染的重要病原,给全球养牛业造成了巨大的损失。PCR检测技术是目前检测BVDV的主流手段。尽管目前已建立的BVDV PCR检测方法很多,但未见适用于临床现场检测BVDV的PCR检测方法及试剂盒,制约了BVDV的快速诊断和检疫。本研究的目的是基于恒温隔绝式荧光RT-PCR（Insulated isothermal RT-PCR,ii RT-PCR）技术,研制检测BVDV1型的试剂盒,并应用试剂盒进行BVDV1型现场诊断及流行病学调查。并取得了以下成果:1.BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒研制及应用为了研制能现场检测BVDV1型的荧光RT-PCR检测试剂盒,对GenBank中下载的54条BVDV1型、43条BVDV2型、11条BVDV3型5’UTR序列进行分析后,设计了特异性检测BVDV1型的引物:BVDV1 iiF:5’-AAGCC-TCGAGATGCCACG-3’,BVDV1 iiR:5’-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3’;探针:BVDV1 iiPb:5’-FAM-CCCACAGCACATC-TTAA-MGB-3’。通过体系优化,建立了BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法。该方法稳定性好、特异性好,对BVDV1型参考毒株、BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c、BVDV1d均能检出,对无关病原未检出;检测下限为52.7 copies·μL-1,灵敏度高。与SNT1905-2007推荐的RT-PCR方法和两种文献报道的荧光定量RT-PCR方法同时对60份腹泻粪便样本和60份血清样本进行BVDV1型的检测,结果表明本方法均优于其他三种方法。将该方法优化的反应体系试剂进行定量分装、冻干处理后与阳性质粒模板、回溶Buffer共同组装成为50μL体系检测试剂盒,可满足一个50μL体系或两个25μL体系的使用,减少了加样的环节,节约了反应时间,减少了操作过程中的污染,并具有可常温保存和运输的优势。配合PetNAD核酸提取试剂盒和POCKIT?手持式核酸分析仪,实现了BVDV1型的现场诊断,从核酸提取到出检测结果仅需1 h。采用本实验研制的BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒对阿坝藏族羌族自治州若尔盖县热尔乡和红原县安曲镇两个牧场爆发以腹泻为特征的疾病进行现场检测诊断,均检出有BVDV1型的感染;对来自于我国9个省/市区的29份商品化牛冻精样本和20162017年来自4个品牌的20份胎牛血清样本进行检测,其BVDV1型的检出率分别为34.48%和75%,表明四川省市场流通的商品化牛冻精和胎牛血清中BVDV1型的携带率较高。2.川西北草原牦牛BVDV的病原流行病学调查川西北草原是我国牦牛养殖的主要区域之一,犊牛腹泻是该区域的常见病和多发病。为了调查川西北草原牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群中BVDV1型的流行情况,采集了20152017年川西北草原25个牧场的448份牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群3个牧场的627份血清样本,采用研制的BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒进行BVDV1型病原流行病学调查,及BVDV1型与牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）的混合感染情况调查。调查结果显示:20152017年牦牛腹泻样本中BVDV1型平均检出率为29.01%;2015年、2016年、2017年的BVDV1型检出率分别为27.47%、30%、29.11%。对检出的130份BVDV1型阳性样本进行BRV、BCoV的混合感染情况的调查,结果显示BVDV1型与BRV、BCoV的混合感染率分别90%、75.38%。本实验结果表明川西北草原BVDV1型、BRV、BCoV的混感染情况严重,为川西北草原牦牛腹泻病的防控提供了科学依据。
邓宇[3]（2012）在《我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究》文中提出1.猪源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5’-UTR与NproPCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5’-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5TCIDso·0.2mL-1。 SD08035’-UTR、 Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与己知BVDV-1各亚型之问同源性较低,单独成一分支。以上结果推断,成功分离鉴定一株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。2.猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株全长基因序列的测定及生物信息学分析采用RT-PCR方法分10个片段扩增SD0803株全基因序列；病毒5’-末端与3’-末端序列采用RACE方法扩增,扩增得到的各片段克隆测序。结果,将测序得到的个片段序列采用Seqman软件拼接后,得到了SD0803分离株全长序列,其长度为1227Int,包括5’-UTR （388nt）3’-UTR （186nt）以及一个编码3898个氨基酸的大ORF,不含外源基因序列。成功获得BVDV SD0803株全基因序列,丰富了猪源BVDV流行病学研究资源。采用MEGA4.1、 DNAStar、 I-TASSER Server、 CLC RNA Workbench等生物信息学软件对SD0803全长序列进行分析,结果表明：SD0803株全长序列与BVDV-1参考株在一簇,与ZM-95亲缘关系最近,二者同源性仅为83.2%；该毒株各基因与瘟病毒参考株同源性为42.7%-91.7%；5’-UTR存在三个高变区、两个oligopyrimidine-rich tracts,形成4个（A、B、C、D）功能区的二级结构；3’-UTR的一级结构存在一个高变区与一个相对保守区,在高变区里少了约40nt,二级结构与牛源参考株差异较大,仅形成3个茎-环结构；结构蛋白区含有14个潜在糖基化位点；I-TASSER Server预测SD0803分离RdRp高级结构,该毒株RdRp含有50.9%氨基酸形成（366/719）卷曲结构（coil,c）；8.6%（62/719）氨基酸形成β-片状折叠结构（S）；剩余的的氨基酸（40.5%,291/719）形成螺旋结构（helix, H）;三级结构具有典型的核酸复制酶“手状结构”,与BVDV1S4F结构相似。本研究分析和预测了SD0803株全长序列的进化、结构与功能的关系,为进一步研究其生物学功能及其应用奠定基础。3.猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立根据GenBank中BVDV-1、 BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDVs与CSFV的Nested-PCR检测方法；确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDVs标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性,此结果表明,该方法具有较好特异性；其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量；经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%；牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDVs污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。4.我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒分子流行病学研究采用Nested-PCR方法检测了2007年至2010年问从北京、河南、新疆、山东、江西、浙江、安徽、湖南、广西、江苏和上海等地采集的猪病料,同时采用该方法对我国部分地区采集牛场的牛血清、国产商品胎牛血清、进口商品胎牛血清、猪瘟活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗、MDBK细胞进行了检测。结果显示,猪病料中BVDV总阳性率为11.88%（146／1229）,2007年至2010年感染率呈增长趋势；牛场的牛血清阳性率26.0%（130／500）；国产商品胎牛血清96.4%（53／55）；进口商品胎牛血清100%（10／10）；猪瘟活疫苗52.0%（26／50）；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗未检测出BVDV; MDBK细胞均呈阳性。应用生物信息学软件对不同来源的毒株5’-UTR序列进行遗传进化分析,结果表明,来自牛场的牛血清中,4株为BVDV-1m,2株为BVDV-1b,还有1株属于BVDV-1a;商品胎牛血清中,BVDV-1b （FS2、FS4）, BVDV-1c（FS3）,BVDV-1m（DFBS2/3、FS5）,BVDV-1p（FS6）, BVDV-2a （FS1）,还有一株暂不确定型；猪活疫苗中,2株属于BVDV-1m,2株为BVDV-1o,1株为BVDV-1k,1株为BVDV-1b;在猪源BVDV分离株中,1株（BVDV-1a）,6株（BVDV-1b）,6株（BVDV-1m）,1株（BVDV-1o）还有6株暂不能确定亚型；猪源BVDV毒株与牛血清（牛场）毒株同源性为87.3%-100%,与国产商品血清（除了FSl为BVDV-2外）为77.1%～98.8%,所有猪源BVDV毒株与进口商品血清80.5%～97.5%。猪源BVDV毒株与猪瘟活疫苗源BVDV之间,在病毒最保守区（5’-UTR）均有变异,这两种不同来源毒株之间核苷酸的变异无规律性。5.猪源牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立根据BVDVs与CSFV5’-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDV5’-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线。以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测,结果,该方法检测CSFV、 PRRSV均为阴性；最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20%-0.95%；应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7%。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDV、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测。6.猪源牛病毒性腹泻病毒E2蛋白表达及抗体制备表达去除猪源牛病毒性腹泻病母（BVDV） SD0803株E2基因跨膜疏水区（sE2）的蛋白并制备其抗体,RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2（rsE2）,转化大肠埃希菌BL21（DE3）, IPTG诱导蛋白表达,将纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、 Western-blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1：256000；制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合；该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。
张永涛[4]（2011）在《猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究》文中提出本试验采用基因芯片技术、借助PCR和核酸标记技术,构建了猪瘟病毒和猪2型圆环病毒检测基因芯片。不仅为多种猪传染性疾病在同一张芯片上进行检测奠定基础,而且也为其他动物疫病应用基因芯片方法进行检测提供了理论依据。主要内容分为以下几个部分:1.CSFV-PCV2检测基因芯片目的基因的克隆及鉴定通过对CSFV和PCV2进行病原及分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的CSFV和PCV2基因序列,选择其保守序列并采用Primer Primier5.0软件设计引物。采用PCR或RT-PCR方法扩增目的基因,获得2个目的基因片段;用pMD18-T或pUCm-T克隆载体对目的基因进行克隆并对重组质粒进行PCR或酶切鉴定,然后进行测序。试验结果表明:目的基因被成功克隆。多重序列比对进一步表明:克隆鉴定的目的基因为病原体的高度保守基因,为CSFV-PCV2检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。2.CSFV-PCV2检测基因芯片的构建通过对引物进行标记,使荧光素（Cy3）掺入到PCR产物中,通过对探针进行氨基修饰,使其更好的与经过醛基化的基片更好的结合,探针就能够更好的固定在基片上;通过对重组质粒PCR扩增产物与相应探针杂交温度和杂交时间的优化,筛选出了杂交特异性好的目的基因并确定了适宜的杂交温度和杂交时间,最后通过扫描仪对杂交结果进行扫描获取杂交图像并用计算机软件对杂交结果进行分析,完成CSFV-PCV2检测基因芯片的构建,结果如下:1)目的基因的制备:以目的基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化目的基因,其浓度和纯度均符合芯片制作要求。2)确定了探针最适点样浓度为100ng/μL,筛选出了杂交信号强、杂交特异性好的目的基因,确定了CSFV-PCV2检测基因芯片的杂交温度为48℃,杂交时间为5h。3)确立了点样环境参数:相对湿度55-65%,温度15-30℃。各探针点间距为1.5mm。3.CSFV-PCV2检测基因芯片检测技术研究试验采用以PRV为阴性对照株,对构建的CSFV-PCV2检测基因芯片特异性进行了评价,结果表明:PRV阴性对照和空白对照均没有杂交信号,而CSFV和PCV2杂交信号明显且肉眼可见,基因芯片特异性好;将所提取的重组质粒按10倍梯度稀释至10-8,运用PCR方法和芯片方法分别对不同梯度的重组质粒进行检测并进行对比,以评价芯片检测方法的敏感性,结果表明:芯片检测方法的敏感性均好于PCR方法;通过对现地疑似样品进行检测,以评价基因芯片的应用效果,结果表明:基因芯片应用效果较好,能进一步进行试验研究。
聂兆晶[5]（2011）在《山东省猪感染BVDV调查及BVDV E2基因的序列分析》文中研究说明牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus BVDV）又称牛病毒性腹泻一粘膜病病毒（BVD一MDV）是瘟病毒属主要成员之一,与猪瘟病毒（CSFV）、羊边界病病毒（BDV）同属于黄病毒科,瘟病毒属。由于国内还没有商品化试剂盒能够对猪血清中BVDV抗体进行诊断,所以本实验以IDEXX公司针对牛的BVDV抗体检测试剂盒中包被好的ELISA板为病毒抗原包被板,用兔抗猪瘟病毒（CSFV）高免血清阻断其与CSFV抗原交叉的位点,再以辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG抗体为酶标二抗,确定其最佳反应条件,成功地建立了一种可用于检测猪源BVDV抗体的复合捕获阻断ELISA方法。以该法对采自山东省淄博、临沂、日照、济南、泰安、潍坊、德州、七个地区共26个猪场866份猪血清样品进行BVDV抗体检测,结果显示所检血清中BVDV抗体阳性率达到48%（416/866）。其中母猪和仔猪血清中BVDV抗体阳性率分别为45.3%（101/224）和32.5%（209/642）,猪场阳性率达88%（23/26）。同时以猪瘟正向间接血凝试验对部分血清样品进行CSFV抗体效价测定,发现CSFV抗体效价为1∶641∶256的血清样品其BVDV抗体多为阴性,而BVDV抗体呈阳性者其CSFV抗体效价普遍较低（仅在1∶41∶16之间）,这表明山东省猪群感染BVDV已较普遍,也揭示猪感染BVDV对猪瘟抗体的产生很可能存在抑制作用。通过套式PCR方法,对临床上58份猪瘟疑似病例样品进行BVDV检测,结果有5份呈BVDV阳性,对BVDV阳性样品进行其它临床常见病毒的检测,发现4份CSFV呈阳性,1份PRRSV阳性、CSFV、PCV-2、PRV均呈阴性。我们将这1份BVDV（+）CSFV（—）PRRSV（+）的样品接种到MDBK细胞上,得到一株稳定遗传的1型猪源BVDV,将其命名为JN-1。并通过克隆测序分析比较发现,这株病毒与王新平等分离到的国内第一株猪源BVDVZM-95同源性达到92.6%,而与牛源BVDV同源性则较低。同时对用于疫苗生产中培养细胞用的国产和进口犊牛、胎牛血清进行BVDV的RT-PCR检测,发现阳性率达到82%（14/17）,对RT-PCR检测阳性血清进行病毒分离,得到了1株能稳定遗传的可在MDBK上产生明显病变的2型牛源BVDV,命名为JN-2。并对其进行克隆纯化和蚀斑实验,为下一步的猪体攻毒试验奠定基础。E2囊膜糖蛋白是主要的保护性抗原,在受到病毒的自然感染或疫苗刺激时,宿主能迅速产生针对E2蛋白的中和性抗体,对JN-1和JN-2的E2进行克隆测序分析,发现JN-1、JN-2该区核苷酸、氨基酸保守性较低,蛋白变异率较高,这种变异有可能导致中和逃逸、疫苗免疫失败等现象。
叶芬[6]（2011）在《PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立》文中认为近年来,猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势,混合感染的比例大幅度上升,这一现状也增加了临床和实验室诊断的难度。而猪瘟（Classical swine fever,CSF）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）和猪圆环病毒病（Porcine circovirus type 2, PCV 2）是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。所以建立集成的CSF、PRRS、PCV2的多重PCR及基因芯片诊断方法显得十分必要。本研究利用NCBI基因组比对方法挖掘PRRSV、PCV-2、CSFV基因组中的特异性序列,并结合引物及探针设计原则,设计和筛选相关PCR特异性引物及基因芯片的寡核苷酸探针。同时整合已报道的检测探针和引物,利用筛选和整合的引物和探针建立并优化多重PCR体系和基因芯片方法,检测上述三种猪病毒性疾病。主要研究结果如下：1.病毒的增殖与鉴定利用MARC-145、PK-15、ST三种细胞分别增殖出了PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、PCV-2、CSFV,其中PRRSV欧洲型、PRRSV美洲型毒株的增殖结果利用观察其引起MARC-145细胞发生细胞病变进行初步判定, PCV-2、CSFV的增殖结果利用间接免疫荧光进行初步判定,（?）表明这几种病毒均在相应的易感细胞中得到了有效的增殖。2.多重PCR检测体系根据GenBank中已发表的PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、CSFV和PCV-2 4个病毒株基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,设计合成4对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,在此基础上建立和优化了4种病原的多重PCR检测体系,其最低检测限可达10-4-10-5数量级,整个检测时间在4h以内。并分别用多重PCR和单项PCR/ RT-PCR检测60份临床病料,符合率为100%,表明该检测方法可以用于临床病料的检测,具有较大的应用价值,可广泛应用于临床检验。3.基因芯片检测方法根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer左右的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。然后进行引物标记及特异性验证,在此基础上建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核营酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。并分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,结果表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。
刘翠权[7]（2011）在《广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施》文中进行了进一步梳理猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一种多因子疾病,它是由病毒、细菌、支原体、寄生虫、不良的饲养管理条件及易感猪群等综合因素相互作用引起的疾病综合症。为了解该病在广西猪群中的感染状况,主要采用PCR和RT-PCR方法,结合细菌分离鉴定,2007年5月至2009年5月,对广西14个市395个规模猪场的1686份组织样品分别进行了12种病原检测。结果显示：292个规模猪场和1212份样品为PRDC阳性,猪场和组织样品的阳性率分别为73.92%（292/395）和71.89%（1212/1686）。其中,单独或者混合感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪链球菌（SS）、猪伪狂犬病毒（PRV）、支气管败血波氏杆菌（Bb）、猪流感病毒（SIV）、猪附红细胞体（E-suis）、产毒素多杀性巴氏杆菌（T+PM）、副猪嗜血杆菌（HP）、猪细小病毒（PPV）和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）的阳性样品分别为51.36%（866/1686）、36.54%（616/1686）、10.91%（184/1686）、9.19%（155/1686）、6.76%（114/1686）、6.64%（112/1686）、5.81%（98/1686）、5.63%（95/1686）、4.45%（75/1686）、3.91%（66/1686）、0.59%（10/1686）和0（0/1686）。1病原学分析从感染的类型看,在1212份阳性样品中,单独感染的样品351份,占28.96%（351/1212）；混合感染的样品861份,占71.04%（861/1212）。从混合感染的类型看,在861份混合感染阳性样品中,二重混合感染597份、三重混合感染210份、四重混合感染54份,分别占69.34%（597/861）、24.39%（210/861）和6.27%（54/861）。从混合感染的微生物种类看,在861份混合感染阳性样品中,“病毒与病毒”混合感染的样品460份、“病毒与细菌”混合感染的样品401份,分别占53.43%（460/861）和46.57%（401/861）。从感染的优势病原分析,PRRSV和/或PCV2感染的样品1054份,占1212份阳性样品的86.96%。其中,"PRRSV+PCV2（+其它病原）”混合感染的样品428份,占所有861份混合感染样品的49.71%。结果表明：广西规模猪场普遍存在PRDC, PRRSV、PCV2是引起PRDC的主要病原；感染类型复杂多样,混合感染相当普遍,以"PRRSV+PCV2（+其它病原）”混合感染最为常见。2病理组织学观察在病原学调查的基础上,对560个PRDC病例的心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织器官进行石蜡包埋、切片、H.E染色,光学显微镜下观察其病理组织学特征。560个中的500个（占89.3%）,其中,PRRSV单独感染病例166个、PRV单独感染病例22个、PRRSV+PCV2混合感染病例247个、PCV2+PRV混合感染病例38个、PRRSV+E-suis感染病例21个、PRRSV+CSFV+PCV2+HP感染病例6个,其心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织器官的病理组织学变化呈现以下特点：PRRSV单独感染的病例,肺主要表现为间质性肺炎,肾表现为肾小球肾炎,淋巴结表现为急性增生性淋巴结炎,肝脏表现为变质性肝炎,心肌表现为变质性心肌炎,脾表现为脾小体体积缩小、坏死,红髓区内出血,淋巴细胞减少；PRRSV和/或PCV2混合感染其他病毒或继发细菌感染时,病变更加典型,组织细胞发生变性甚至坏死。系统的病理组织学观察为进一步形成PRDC的病理组织学诊断技术规范提供重要参考依据。3防控措施2009年5月开始,对15个试验猪场采取综合防控措施。这些措施主要包括：对必须进入猪场的人员、车辆、物品随时进行消毒,对猪舍地板、墙壁、天花板、空气、用具等定期进行消毒；做好PRRSV、CSFV、PRV、SIV、PCV2等PRDC原发性病原的免疫和监测,对抗体水平不合格的及时进行强化免疫;做好环境虫鼠蚊蝇等生物灾害防范和通风、温度、湿度控制；加强饲养管理,做到全进全出、养殖密度合理、营养均衡；尽可能减少猪群转栏、混群、免疫次数,净化养殖周边环境,减少应激；对病猪及时隔离并投喂敏感药物,防止继发感染；对死猪及其污染的物品及时进行无害化处理和消毒。重点措施是消毒、监测和对病死及带毒猪的隔离、淘汰、无害化处理,主要内容包括：对必须进入猪场的人员、车辆和物品随时进行消毒；对产房、保育猪舍、生产育肥猪舍的地板、墙壁、天花板、用具等分别进行2次/周、1次/周、2次/月的常规消毒,空栏后进猪前进行2次全面消毒；对产房、保育猪舍的空气在空栏后进猪前进行1次密闭熏蒸消毒；对猪舍外环境进行2次/月的消毒；对病猪和带毒猪及时隔离、淘汰,对死猪及其污染的物品及时进行无害化处理和消毒。4防控效果采取综合防控措施后,猪瘟的免疫抗体合格率明显提高,猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染和猪流感的病原学监测的平均阳性率均不同程度地下降。2009年5月至2010年6月,共监测15个规模猪场血清样品16974份、病原学样品1589份。其中,猪瘟免疫抗体的平均合格率由试验前的91.18%提升到试验后的95.90%,病原学样品的平均阳性率由8.55%下降到6.04%；猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体的平均阳性率由86.46%提升到88.11%,病原学样品的平均阳性率由15.80%下降到13.15%；猪圆环病毒2型病原学样品的平均阳性率由26.61%下降到22.28%；猪伪狂犬病gE抗体的平均阳性率由5.53%下降到4.51%,病原学样品的平均阳性率由6.43%下降到5.16%；猪流感感染抗体的平均阳性率由5.51%下降到5.30%,病原学样品的平均阳性率由637%下降到4.97%。生猪的死亡率总体趋于下降。15个猪场的总体平均死亡率由试验实施1～2月的8.28%下降到实施11～12月的7.24%,总体下降了1.04个百分点。种猪的繁殖性能和仔猪的存活率显着提高,仔猪的平均死亡率明显下降。其中,每头长白母猪年平均提供活仔数由20.73头提高到21.57头,提高了0.84头；仔猪的平均死亡率由8.54%下降到6.86%,下降了1.68个百分点。每头杜洛克母猪年平均提供活仔数由18.95头提高到19.23头,提高了0.28头；仔猪的平均死亡率由7.44%下降到6.55%,下降了0.89个百分点。每头大约克母猪年平均提供活仔数由19.97头提高到20.54头,提高了0.57头；仔猪的平均死亡率由7.42%下降到6.39%,下降了1.03个百分点。仔猪的生长性能大幅度提高。其中,长白仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了2.1天和3.3天,30～100kg平均日增重提高了30.1g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.063和0.098。杜洛克仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了2.1天和3.9天,30～100kg平均日增重提高了24.6g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.029和0.089。大约克仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了1.9天和3.6天,30～100kg平均日增重提高了21.5g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.023和0.056。2009年5月至2010年6月,采取上述综合措施后,15个规模猪场的主要疫病防控效果显着,生猪发病减少了,死亡率降低了,猪群的免疫抗体水平、种猪的繁殖性能、仔猪的死亡率和生长性能等各项指标均发生了明显改善,取得了良好的经济效益和社会效益。
李安[8]（2010）在《猪瘟病毒强毒株与疫苗C株鉴别方法的建立及疫苗病毒定量检测的研究》文中进行了进一步梳理猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性传染病。近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化,在临床表现上趋于非典型化,主要表现为隐性带毒和慢性感染,成为影响养猪业发展的一大隐患。疫苗接种是预防控制猪瘟的重要手段,中国猪瘟兔化弱毒（Hog cholera lapinized virus, HCLV）疫苗是国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗,对猪瘟的控制起到了重要作用。疫苗效价的高低是疫苗质量合格与否的关键指标,如何快速、准确测定疫苗病毒效价是猪瘟疫苗生产中亟待解决的主要难题之一。此外,猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难和必要,亟待建立一种可以准确诊断猪瘟野毒感染与疫苗接种的敏感、特异、重复性好的检测方法。为解决以上问题,本课题分三部分进行研究:1.成功建立了一种能够区分猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）诊断方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计一对通用引物,扩增片段为609 bp,并在该对引物扩增区域内设计针对弱毒的特异引物,扩增片段为237 bp。临床应用该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与其它猪源病毒发生非特异反应。应用本研究建立的RT-nPCR方法可以对猪瘟强毒做出快速准确诊断,可将野毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来,可用于免疫猪群的猪瘟净化检测,并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。2.成功建立了一种能够区分猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对猪瘟强毒与疫苗弱毒的特异性上游引物,预计Tm值分别为84.5±0.5℃和89.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰,并且具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点。本实验建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对猪瘟强毒感染做出快速准确诊断,可将强毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来,可用于免疫猪群的猪瘟净化检测,并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。3.成功建立了一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5’端非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其它猪源病毒发生非特异性反应。应用本方法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在106～102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感、特异、重复性好等优点,可望取代传统的兔体反应热法用于猪瘟疫苗生产过程中的猪瘟病毒效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新技术。
张兴娟[9]（2010）在《同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立》文中认为猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（HCV或CSFV）引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列入OIE名录,我国将其列为一类传染病。其基因组为单股正链RNA,大小约为12.3 kb,含有1个大的开放阅读框（ORF）,两侧为高度保守的5′和3′非编码区（UTR）。牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和CSFV同为黄病毒科瘟病毒属成员,根据BVDV基因组的差异,我们将其分为两个基因型,即基因型1（BVDV-1）和基因型2（BVDV-2）。同属的成员还包括:绵羊边界病病毒（BDV）和长颈鹿瘟病毒（Pestivirus of Giraffe）。由于BVDV不仅可以感染牛还可以感染猪,引起与猪瘟相似的临床症状和病理变化,同时BVDV与CSFV存在血清学交叉反应,因此很容易被误诊为猪瘟。此外,猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）在我国的大规模应用,使猪瘟野毒感染、疫苗接种的区分变得非常困难和必要。因此,亟待建立一种可以准确区分猪瘟野毒感染、疫苗接种以及BVDV感染的快速、高效、敏感而特异的检测方法。本研究旨在建立一种能同时区分CSFV野毒、HCLV和BVDV-1的敏感、特异、重复性好的三重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。根据CSFV NS5B区域分别设计了针对CSFV野毒、HCLV的引物和TaqMan水解探针,依据BVDV 5′-UTR设计了一对针对BVDV-1的引物和TaqMan水解探针,在优化反应条件的基础上,建立了同时区分CSFV、HCLV和BVDV-1的三重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSFV野毒株、HCLV以及BVDV-1完全区分开来,而不与其它猪源病毒发生非特异反应,在107-101拷贝/μL范围内,对CSFV、HCLV和BVDV标准品模板的检测具有良好的线性关系,最低检测限分别为4.5 TCID50（CSFV野毒）、7.8个拷贝（HCLV）或3.2 TCID50（BVDV-1）。用本方法与实验室建立的RT-nPCR、鉴别猪瘟野毒和弱毒的荧光定量RT-PCR和检测BVDV-1的RT-PCR方法分别对176份临床样品72份HCLV疫苗进行检测,符合率均达到了97.0%以上。本方法可以同时定量检测和区分三种病毒,用于现地疑似猪瘟病料、商品化牛血清的检测,同时还可以对猪瘟疫苗的质量进行监控。
孟雨,吴发兴,朱紫祥,张志,张燕霞,刘爽,李晓成,王晶钰[10]（2010）在《牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用》文中指出根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV218bp片段的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV标准毒株OregonC24V中扩增出了218bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID50。不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。表明,建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。
二、用复合PCR直接分型临床样品中BVDV（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用复合PCR直接分型临床样品中BVDV（论文提纲范文）
（1）猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟(CSFV)流行情况概述 |
| 1.1.1 国外猪瘟流行情况 |
| 1.1.2 国内猪瘟流行情况 |
| 1.2 CSFV特征与变异 |
| 1.2.1 CSFV生物学特性 |
| 1.2.2 CSFV基因组结构及功能 |
| 1.2.3 我国CSFV遗传变异多样性 |
| 1.3 猪非典型瘟病毒 |
| 1.3.1 CT类型 |
| 1.3.2 APPV流行情况 |
| 1.3.3 临床症状及病理变化 |
| 1.3.4 防治措施 |
| 1.4 猪瘟疫苗研究进展 |
| 1.4.1 核酸疫苗 |
| 1.4.2 基因缺失疫苗 |
| 1.4.3 活载体疫苗 |
| 1.4.4 基因工程亚单位技术 |
| 1.5 CSFV实验室检测方法研究进展 |
| 1.5.1 血清学检测 |
| 1.5.2 分子生物学检测 |
| 1.6 猪瘟防控技术与策略展望 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 第2章 2015-2017 年国内猪场猪瘟抗体监测与初步分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 调查猪场数量及区域分布 |
| 2.2.2 调查猪场不同规模数量 |
| 2.2.3 国内调查猪场各区域样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.4 调查猪场不同生产阶段样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.5 调查猪场样品猪瘟抗体平均阻断率各水平比例结果 |
| 2.2.6 调查猪场不同月份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.7 调查猪场不同年份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 调查猪场不同区域样品猪瘟抗体监测分析 |
| 2.3.2 调查猪场不同生产阶段样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3.3 调查猪场不同月份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3.4 调查猪场不同年份样品猪瘟抗体水平及各水平比例监测结果分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 国内猪瘟病毒感染调查与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 2015 -2017 年猪瘟病毒感染率 |
| 3.2.3 猪瘟病毒感染季度阳性率 |
| 3.2.4 猪瘟病毒与常见病毒性疾病混感比例 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 猪瘟病毒感染情况 |
| 3.3.2 猪瘟病毒与其他病毒混合感染情况 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 山东和河南两地流行的猪瘟病毒E2基因遗传变异分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病料来源 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 病料核酸纯化 |
| 4.1.5 E2 基因RT-PCR扩增 |
| 4.1.6 E2 基因序列分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 E2 基因RT-PCR结果 |
| 4.2.2 E2 基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析 |
| 4.2.3 E2 基因遗传进化关系分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 猪瘟野毒E2 基因遗传变异分析 |
| 4.3.2 18 株流行毒株E2 基因遗传变异分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 非典型瘟病毒初步鉴定分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 临床症状及剖检症状 |
| 5.2.2 组织病理切片结果 |
| 5.2.3 RT-PCR结果 |
| 5.2.4 序列结果分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 猪瘟基因工程亚单位疫苗与猪瘟弱毒活疫苗的免疫效果评价 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 猪瘟抗体结果 |
| 6.2.2 猪繁殖与呼吸综合征抗体结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 猪瘟抗体变化 |
| 6.3.2 猪繁殖与呼吸综合征对猪瘟抗体的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及攻读学位期间发表的学术成果 |
| 致谢 |
（2）BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒的研制及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒PCR检测技术研究进展 |
| 1 文献报道的BVDVPCR方法 |
| 2 BVDV5'UTR的结构特征 |
| 3 小结与展望 |
| 第二章 基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术BVDV1型检测试剂盒的研制及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒(菌)株与临床样本 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物、探针的设计与合成 |
| 1.5 核酸的提取 |
| 1.6 BVDV1型阳性标准品的制备 |
| 1.7 iiRT-PCR反应体系的优化 |
| 1.8 iiRT-PCR特异性评价 |
| 1.9 iiRT-PCR灵敏性测定 |
| 1.10 iiRT-PCR稳定性评价 |
| 1.11 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒的研制 |
| 1.12 与现有BVDVPCR方法的比较 |
| 1.13 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒的现场应用 |
| 1.14 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒对商品化胎牛血清样本检测 |
| 1.15 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒对商品化冻精样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 iiRT-PCR优化的反应体系 |
| 2.2 iiRT-PCR特异性评价 |
| 2.3 iiRT-PCR灵敏性检测 |
| 2.4 iiRT-PCR稳定性评价 |
| 2.5 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒的研制 |
| 2.6 与现有检测BVDV的方法的比较 |
| 2.7 BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒的现场检测结果 |
| 2.8 商品化胎牛血清样本检测结果 |
| 2.9 商品化牛冻精样本检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 川西北草原牦牛BVDV1型的病原流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 核酸的提取 |
| 1.5 BVDV1 iiRT-PCR试剂盒基于荧光定量PCR仪的使用方法 |
| 1.6 川西北草原牦牛BVDV1型病原流行病学调查 |
| 2 结果 |
| 2.1 牦牛腹泻粪便样本病原流行病学调查结果 |
| 2.2 麦洼牦牛核心种群BVDV1型病原流行病学调查结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（3）我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究（论文提纲范文）
| 本文创新性工作 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩略词汇 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒研究 |
| 1. 病原学 |
| 2. BVDV流行病学 |
| 2.1 传染源 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 易感动物 |
| 2.4 流行特点 |
| 2.5 国外BVDV流行状况 |
| 2.6 国内BVDV流行状况 |
| 3. BVD临床表现及致病机理 |
| 3.1 病毒性腹泻 |
| 3.2 急性BVD |
| 3.3 黏膜病(MD) |
| 3.4 繁殖障碍 |
| 3.5 持续性感染(PI)与免疫耐受 |
| 3.6 血小板减少症与出血综合症 |
| 3.7 免疫抑制 |
| 4. BVDV检测方法 |
| 4.1 病毒分离鉴定 |
| 4.2 电镜观察 |
| 4.3 微量血清中和试验 |
| 4.4 酶联免疫吸附试验 |
| 4.6 免疫荧光技术与免疫过氧化物酶技术 |
| 4.7 分子生物学检测技术 |
| 4.7.1 反转录-多聚链式反应(RT-PCR) |
| 4.7.2 荧光定量PCR技术(FIuorescent Quantitative PCR,FQ-PCR) |
| 4.7.3 核酸杂交(NAH)技术 |
| 5. BVDV分子生物学特征 |
| 5.1 BVDV基因组结构 |
| 5.1.1 5'-UTR |
| 5.1.2 3'-UTR |
| 5.1.3 开放阅读框架(ORF) |
| 5.2 BVDV的结构蛋白 |
| 5.2.1 衣壳蛋白C |
| 5.2.2 囊膜蛋白gp48 |
| 5.2.3 囊膜蛋白gp25 |
| 5.2.4 囊膜蛋白gp53 |
| 5.3 BVDV的非结构蛋白 |
| 5.3.1 Npro(P20)蛋白 |
| 5.3.2 P7 |
| 5.3.3 NS2-3 (P125、NS2与NS3 |
| 5.3.4 NS4A(P10)与NS4B(P30) |
| 5.3.5 NS5A (P58) |
| 5.3.6 NS5B (P75) |
| 6. 猪源牛病毒性腹泻病毒(pig BVDV)研究进展 |
| 6.1 猪源BVDV流行病学 |
| 6.2 猪源BVDV致病性 |
| 6.3 猪源BVDV诊断 |
| 6.4 结语 |
| 7. 研究目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 猪源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病料来源与处理 |
| 1.2 细胞、标准毒株和主要试剂 |
| 1.3 样品BVDV 5'-UTR检测 |
| 1.4 病毒分离 |
| 1.5 病毒鉴定 |
| 1.5.1 进化关系分析 |
| 1.5.2 抗原性检测(直接免疫荧光法) |
| 1.5.3 病毒的电镜观察 |
| 1.5.4 病毒TCID_(50)测定 |
| 2. 结果 |
| 2.1 样品RT-PCR检测 |
| 2.2 生物型鉴定 |
| 2.3 抗原性检测(直接免疫荧光法) |
| 2.4 电镜观察 |
| 2.5 TCID50测定结果 |
| 2.6 进化关系分析 |
| 3. 讨论 |
| Abstract |
| 第三章 猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株全长基因序列的测定及生物信息学分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞株等主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 BVDVs参考毒株全基因序列 |
| 1.5 生物信息学软件 |
| 2. 方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.2 病毒浓缩 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 引物设计及合成 |
| 2.5 反转录cDNA合成 |
| 2.6 全基因RT-PCR扩增 |
| 2.6.1 RT-PCR反应体系 |
| 2.6.2 RT-PCR反应条件 |
| 2.7 PCR产物的纯化 |
| 2.8 DNA片段与克隆载体的连接 |
| 2.9 连接产物的转化 |
| 2.10 重组质粒的抽提及测序 |
| 2.11 病毒5’-RACE扩增 |
| 2.11.1 提取的病毒RNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.11.2 第一链cDNA合成 |
| 2.11.3 5'-RACE PCR快速扩增 |
| 2.11.4 套式PCR扩增产物回收 |
| 2.11.5 DNA片段与克隆载体的连接 |
| 2.11.6 连接产物的转化 |
| 2.11.7 重组质粒的抽提及测序 |
| 2.12 病毒3’-RACE扩增 |
| 2.12.1 病毒RNA提取及RNA浓度测定 |
| 2.12.2 全基因组RNA 3'末端加Poly(A)“尾”标记 |
| 2.12.3 病毒3'-RACE cDNA合成 |
| 2.12.4 病毒3'-RACE PCR快速扩增 |
| 2.12.5 Touchdown PCR扩增产物回收 |
| 2.12.6 DNA片段与克隆载体的迩接 |
| 2.12.7 连接产物的转化 |
| 2.12.8 重组质粒的抽提及测序 |
| 2.13 全基因序列拼接 |
| 2.14 SD0803与瘟病毒参考株同源性分析 |
| 2.15 SD0803分离株全基因核苷酸序列进化关系分析 |
| 2.16 非编码区一级、二级结构分析 |
| 2.17 结构蛋白(E0、E1、E2)糖基化位点分析 |
| 2.18 SD0803株RdRp蛋白质高级结构预测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒基因RT-PCR扩增 |
| 3.2 |
| 3.2.2 病毒5'-RACE与3'-RACE PCR扩增结果 |
| 3.3 SD0803全基因序列拼接结果 |
| 3.4 SD0803分离株各基因与瘟病毒参考株核苷酸序列分析 |
| 3.5 SD0803株与其他瘟病毒参考株进化关系分析 |
| 3.5.1 5'-UTR进化关系分析 |
| 3.5.2 Npro进化关系分析 |
| 3.5.3 全基因序列进化关系分析 |
| 3.6 SD0803株非编码区RNA一级结构与二级结构分析 |
| 3.6.1 SD0803株5'-UTR RNA一级结构特征分析 |
| 3.6.2 SD0803株5'-UTR RNA二级结构分析 |
| 3.6.3 3'-UTR RNA一级结构与二级结构分析 |
| 3.7 结构蛋白序列及糖基化位点分析 |
| 3.8 I-TASSER对SD0803株RdRp蛋白质二级结构预测 |
| 3.9 I-TASSER对SD0803株RdRp三级结构的预测 |
| 3.10 SD0803株RdRp功能的预测 |
| 3.10.1 EC的预测 |
| 3.10.2 结合位点(Binding Site)的预测 |
| 4. 讨论 |
| Abstract |
| 第四章 猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病毒株、细胞株 |
| 1.2 样品来源 |
| 1.3 主要试剂(盒) |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 引物设计合成 |
| 1.7 病毒增殖、浓缩 |
| 1.8 病毒RNA提取与cDNA合成 |
| 1.9 PCR扩增及鉴定 |
| 1.9.1 第一轮PCR(RT-PCR) |
| 1.9.2 Nested-PCR |
| 1.9.3 PCR产物纯化 |
| 1.10 纯化PCR产物连接与转化 |
| 1.11 重组质粒的抽提 |
| 1.12 重组质粒的鉴定 |
| 1.13 Nested-PCR特异性试验 |
| 1.14 Nested-PCR敏感性试验 |
| 1.15 Nested-PCR重复性试验 |
| 1.16 Nested-PCR临床应用检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 Nested-PCR扩增及鉴定 |
| 2.2 Nested-PCR特异性试验结果 |
| 2.3 Nested-PCR敏感性试验 |
| 2.4 Nested-PCR重复性试验 |
| 2.5 Nested-PCR初步应用检测结果 |
| 3. 讨论 |
| Abstract |
| 第五章 我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒分子流行病学研究 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 主要试剂(盒) |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 RT-PCR及套式PCR检测方法 |
| 1.5 目的DNA片段的回收 |
| 1.6 目的片段与克隆载体的连接 |
| 1.7 连接产物的转化 |
| 1.8 重组质粒的抽提及测序 |
| 1.9 检测结果与临床数据分析 |
| 1.10 序列比对与进化关系分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR及套式PCR扩增结果 |
| 2.2 套式PCR检测样品统计结果 |
| 2.3 牛场牛血清5'-UTR序列分析 |
| 2.4 商品胎牛血清5'-UTR序列分析 |
| 2.5 猪瘟活疫苗5'-UTR序列分析 |
| 2.6 猪源BVDV 5'-UTR序列遗传进化分析 |
| 2.7 猪源BVDV与牛血清源BVDV分析 |
| 2.8 猪源BVDV毒株与猪瘟疫苗源毒株遗传进化分析 |
| 2.9 CSFV、PRRSV与PCV2在BVDV混合感染情况 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 RT-PCR与套式PCR检测 |
| 3.2 猪群中BVDV的感染 |
| 3.3 BVDV污染生物制品问题 |
| 3.4 牛血清BVDV遗传进化分析 |
| 3.5 猪源BVDV的进化分析 |
| 3.6 猪源BVDV与牛血清、猪瘟疫苗进化分析 |
| Abstract |
| 第六章 猪源牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 引物及探针设计合成 |
| 1.4 标准阳性标准品模板制备 |
| 1.4.1 猪源BVDV 5'-UTR扩增 |
| 1.4.2 含目的基因重组质粒的构建及浓度测定 |
| 1.5 标准曲线的建立 |
| 1.6 特异性试验 |
| 1.7 敏感性试验 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.9 临床应用 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 含猪源BVDV 5'-UTR重组质粒的构建及浓度测定 |
| 2.2 FQ-PCR反应体系的优化 |
| 2.3 标准曲线的建立 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 敏感性试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 临床应用 |
| 3. 讨论 |
| Abstract |
| 第七章 猪源牛病毒性腹泻病毒E2蛋白表达及抗体制备 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 毒株、细胞、实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计及合成 |
| 1.4 E2基因PCR扩增 |
| 1.5 sE2基因PCR扩增 |
| 1.6 重组表达载体pGEX-4T-1-sE2的构建 |
| 1.7 SD0803 sE2基因诱导表达及表达产物纯化 |
| 1.8 抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备及纯化 |
| 1.9 多克隆抗体的鉴定 |
| 1.9.1 间接ELISA抗体效价的测定 |
| 1.9.2 Western-blot抗体特异性检测 |
| 1.9.3 BVDV检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 SD0803 E2及sE2基因扩增 |
| 2.2 重组质粒rsE2的构建 |
| 2.3 SD0803 rsE2基因诱导表达及重组蛋白的鉴定 |
| 2.4 抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.5 抗体特异性鉴定 |
| 2.5.1 Western-blot分析 |
| 2.5.2 BVDV抗原检测 |
| 3. 讨论 |
| Abstract |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 基因芯片技术及其在病原微生物研究中的应用 |
| 1.1 基因芯片的概念 |
| 1.2 基因芯片的分类 |
| 1.3 基因芯片的技术流程 |
| 1.3.1 基因芯片载体的选择 |
| 1.3.2 基因芯片的制备方法 |
| 1.3.3 基因芯片待检样品的制备方法及标记 |
| 1.3.4 基因芯片的杂交 |
| 1.3.5 基因芯片杂交信号的检测和分析 |
| 1.4 基因芯片技术在病原微生物研究中的应用 |
| 1.5 存在的问题与发展前景 |
| 2 猪瘟病毒分子生物学及诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪瘟病毒分子生物学研究进展 |
| 2.1.1 猪瘟病毒的病原特性 |
| 2.1.2 猪瘟病毒基因组结构与功能 |
| 2.2 猪瘟病毒诊断方法研究进展 |
| 2.2.1 实验室诊断 |
| 3 猪圆环病毒分子生物学及诊断方法研究进展 |
| 3.1 猪圆环病毒分子生物学研究进展 |
| 3.1.1 病毒的基因组特征 |
| 3.1.2 病毒的结构蛋白特征 |
| 3.2 猪圆环病毒诊断方法研究进展 |
| 3.2.1 病毒分离 |
| 3.2.2 免疫学诊断方法 |
| 3.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 3.2.4 核酸杂交（ISH） |
| 3.2.5 DNA 芯片 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 CSFV-PCV2 检测基因芯片目的基因的克隆与鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞和载体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 试验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒核酸的提取 |
| 1.2.2 病毒核酸浓度的测定 |
| 1.2.3 引物的设计和标记 |
| 1.2.4 目的基因的 RT-PCR 及 PCR 扩增 |
| 1.2.5 目的基因的凝胶回收 |
| 1.2.6 目的基因的连接重组 |
| 1.2.7 目的基因的转化 |
| 1.2.8 目的基因重组质粒的鉴定 |
| 1.2.9 目的基因的序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒核酸的提取及浓度的测定 |
| 2.2 目的基因引物设计结果 |
| 2.3 目的基因 PCR 扩增结果 |
| 2.4 目的基因的凝胶回收 |
| 2.5 目的基因克隆结果 |
| 2.6 目的基因重组质粒 PCR 鉴定 |
| 2.7 目的基因序列测定结果 |
| 2.7.1 CSFV 核苷酸序列比较结果 |
| 2.7.2 PCV2 核苷酸序列比较结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 目的基因的选择 |
| 3.2.2 目的基因引物设计 |
| 3.2.3 目的基因的 PCR 扩增、克隆和鉴定 |
| 3.2.4 目的基因的多重序列对位排列分析和 BLASTN 分析 |
| 试验二 CSFV-PCV2 检测基因芯片的构建 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 目的基因重组质粒 |
| 1.1.2 主要的试剂和材料 |
| 1.1.3 试验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR 引物的标记和探针的合成及修饰 |
| 1.2.2 基因芯片目的基因的制备及纯化 |
| 1.2.3 探针的稀释、固定与基因芯片的制备 |
| 1.2.4 基因芯片的杂交检测步骤 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因的制备及纯化 |
| 2.2 基因芯片杂交结果的分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 基因芯片的制作 |
| 3.2.2 目的基因的标记和探针的修饰 |
| 3.2.3 基因芯片杂交结果判定 |
| 试验三 CSFV-PCV2 检测基因芯片的检测技术研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CSFV-PCV2 检测基因芯片 |
| 1.2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片的特异性试验 |
| 1.2.3 CSFV-PCV2 检测基因芯片的敏感性试验 |
| 1.2.4 应用基因芯片对采集的临床样品进行检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-PCV2 检测基因芯片的特异性试验结果 |
| 2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片的敏感性试验结果 |
| 2.3 CSFV-PCV2 检测基因芯片对临床样品的检测结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 基因芯片检测技术特点 |
| 3.2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片检测技术的敏感性、特异性研究 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 附录一：主要培养基和溶液的配制 |
| 附录二：彩图 |
| 附录三：测序图 |
（5）山东省猪感染BVDV调查及BVDV E2基因的序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 BVDV 生物学特性 |
| 1.1.1 BVDV 形态和理化学特性 |
| 1.1.2 病毒的生物多样性 |
| 1.1.3 BVDV 的基因组结构 |
| 1.1.4 BVDV 蛋白结构的研究 |
| 1.1.5 BVDV 的分型 |
| 1.2 猪感染BVDV 的历史回顾 |
| 1.3 BVDV 对猪的致病性研究 |
| 1.3.1 经胎盘感染和繁殖障碍 |
| 1.3.2 持续感染与免疫耐受 |
| 1.3.3 猪感染BVDV 对CSFV 的影响 |
| 1.3.4 猪感染BVDV 的临床症状及病理变化 |
| 1.4 猪感染BVDV 的传染来源 |
| 1.4.1 来自牛群中的污染 |
| 1.4.2 来自污染有BVDV 的疫苗 |
| 1.5 猪感染BVDV 和猪瘟的鉴别诊断 |
| 1.5.1 血清学诊断方法 |
| 1.5.2 分子生物学诊断方法 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病血清学调查 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 ELISA 所用材料及溶液 |
| 2.1.1.2 酶标二抗稀释液 |
| 2.1.1.3 底物稀释液 |
| 2.1.1.4 底物浓缩液 |
| 2.1.1.5 底物溶液 |
| 2.1.1.6 终止液 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 复合捕获阻断ELISA 的建立 |
| 2.1.2.1.1 酶标反应板均一性的测定 |
| 2.1.2.1.2 猪抗BVDV 阳性血清的制备及其效价测定 |
| 2.1.2.1.3 酶标二抗工作浓度的确定 |
| 2.1.2.1.4 阻断时间的确定 |
| 2.1.2.1.5 被检血清最佳稀释度的确定 |
| 2.1.2.1.6 被检血清反应时间的确定 |
| 2.1.2.1.7 酶标二抗反应时间的确定 |
| 2.1.2.1.8 底物反应时间的确定 |
| 2.1.2.1.9 阴阳性临界值的确定 |
| 2.1.2.2 猪血清BVDV 抗体和CSFV 抗体的检测 |
| 2.1.2.2.1 血清样品BVDV 抗体检测 |
| 2.1.2.2.2 血清样品CSFV 抗体检测 |
| 2.2 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病病毒病原学调查 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 病料与细胞 |
| 2.2.1.2 RT-PCR 主要试剂 |
| 2.2.1.3 RT-PCR 所用主要仪器 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 检测BVDV 引物设计与合成 |
| 2.2.2.2 RNA 的提取 |
| 2.2.2.3 BVDV 目的片段的扩增 |
| 2.2.2.4 BVDV 阳性样品中其它病毒的检测 |
| 2.2.2.4.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2.4.2 BVDV 阳性样品中CSFV 的检测 |
| 2.2.2.5 电泳 |
| 2.3 猪源BVDV 与牛源BVDV 的分离鉴定及2 型BVDV 的克隆纯化 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.1.1 病毒及细胞 |
| 2.3.1.2 试剂及耗材 |
| 2.3.1.3 细胞培养所用溶液 |
| 2.3.1.4 引物 |
| 2.3.1.5 实验仪器 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 细胞培养 |
| 2.3.2.2 处理病料和血清 |
| 2.3.2.3 细胞接毒 |
| 2.3.2.4 收获病毒 |
| 2.3.2.5 RT-PCR 检测细胞液中BVDV 的方法 |
| 2.3.2.6 电泳 |
| 2.3.2.7 通用引物扩增片段的克隆测序分析 |
| 2.3.2.8 病毒在MDBK 细胞上的克隆 |
| 2.4 JN-1 和JN-2 株BVDV E2 基因的克隆测序 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.1.1 病毒 |
| 2.4.1.2 试剂 |
| 2.4.2 方法 |
| 2.4.2.1 细胞组织RNA 的提取 |
| 2.4.2.2 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.4.2.3 制胶 |
| 2.4.2.4 电泳 |
| 2.4.2.6 目的基因的连接: |
| 2.4.2.7 转化 DH5α 菌株 |
| 2.4.2.8 PCR 方法鉴定阳性转化子测序分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病血清学调查 |
| 3.1.1 酶标反应板均一性的测定结果 |
| 3.1.2 猪抗BVDV 阳性血清的制备及其效价测定 |
| 3.1.3 酶标二抗工作浓度的确定 |
| 3.1.4 阻断时间的确定 |
| 3.1.5 被检血清最佳稀释度的确定 |
| 3.1.6 待检血清反应时间的确定 |
| 3.1.7 酶标二抗反应时间的确定 |
| 3.1.8 底物反应时间的确定 |
| 3.1.9 阴阳性临界值的确定 |
| 3.1.10 阻断试验 |
| 3.1.11 特异性交叉反应试验 |
| 3.1.12 重复性试验 |
| 3.1.12.1 板内检测样品的重复性试验 |
| 3.1.12.2 板间检测样品的重复性试验 |
| 3.1.13 复合捕获阻断ELISA 的基本程序 |
| 3.1.14 血清样品中BVDV 的检测结果 |
| 3.1.15 血样的CSFV 抗体效价测定 |
| 3.2 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病病毒病原学调查 |
| 3.2.1 套式PCR 方法检测疑似猪瘟病料的结果 |
| 3.2.2 BVDV 阳性样品中CSFV 的检测结果 |
| 3.2.3 BVDV 阳性样品中PRRSV 的检测结果 |
| 3.3 猪源BVDV 与牛源BVDV 的分离鉴定及2 型BVDV 的克隆纯化 |
| 3.3.1 猪源BVDV 接种MDBK 细胞 |
| 3.3.2 牛源BVDV 接种MDBK 细胞 |
| 3.3.3 接毒细胞液中BVDV 的检测结果 |
| 3.3.3.1 BVDV 通用引物检测结果 |
| 3.3.3.2 BVDV 1 型引物扩增结果 |
| 3.3.3.3 BVDV 2 型引物扩增结果 |
| 3.3.4 5′-UTR 测序与分析 |
| 3.3.5 纯化前后TCID50 测定结果 |
| 3.4 JN-1 和JN-2 株BVDV E2 基因的克隆测序 |
| 3.4.1 E2 基因的克隆测序分析 |
| 3.4.1.1 JN-1 和JN-2 的E2 基因的扩增结果 |
| 3.4.1.2 扩增基因与BVDV 代表毒株之间的同源性 |
| 3.4.1.3 JN-1、JN-2 的E2 基因进化树分析 |
| 3.4.1.4 JN-1 株与JN-2 株E2 蛋白的抗原性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病病毒血清学调查 |
| 4.2 猪感染牛病毒性腹泻－黏膜病病毒病原学调查 |
| 4.3 猪源BVDV 与牛源BVDV 的分离鉴定及2 型BVDV 的克隆纯化 |
| 4.4 JN-1 和JN-2 株BVDV E2 基因的克隆测序 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（6）PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 基因芯片技术及其在猪重大病毒性疾病研究中的应用 |
| 1.1.1 基因芯片及其原理 |
| 1.1.2 基因芯片的类型 |
| 1.1.3 基因芯片的应用 |
| 1.1.4 基因芯片猪重大病毒性疾病研究中的的应用 |
| 1.1.5 存在的问题及应用前景 |
| 1.2 PRRSV分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.2.1 PRRSV的分子生物学特性 |
| 1.2.2 PRRS的诊断 |
| 1.2.3 结语 |
| 1.3 CSFV分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.3.1 CSFV的分子生物学特性 |
| 1.3.2 CSFV的诊断 |
| 1.3.3 结语 |
| 1.4 猪圆环病毒分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.4.1 PCV的分子生物学特性 |
| 1.4.2 PCV-2的诊断 |
| 1.4.3 结语 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的和意义 |
| 2.2 研究的范围和内容 |
| 第三章 PRRSV、CSFV、PCV-2的增殖与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PRRSV欧洲型毒株、美洲型毒株的增殖 |
| 3.2.2 CSFV毒株的增殖 |
| 3.2.3 PCV-2毒株的增殖 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PRRSV毒株的增殖结果 |
| 3.3.2 CSFV毒株的增殖结果 |
| 3.3.3 PCV-2毒株的增殖结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 病毒增殖 |
| 3.4.3 间接免疫荧光 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV、CSFV、PCV-2多重PCR检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 试剂的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 RNA的提取及检测 |
| 4.2.2 反转录 |
| 4.2.3 细胞毒基因组DNA的提取及检测 |
| 4.2.4 PCR反应 |
| 4.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RNA检测结 |
| 4.3.2 DNA检测结果 |
| 4.3.3 PCR产物的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于RNA的提取 |
| 4.4.2 关于PCR |
| 4.4.3 关于RT-PCR |
| 4.4.4 关于多重PCR |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PRRSV、CSFV、PCV-2基因芯片检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 试剂的配制 |
| 5.1.5 芯片引物与探针 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 PRRSV、CSFV、PCV-2DNA、RNA的提取及检测 |
| 5.2.2 多重PCR体系 |
| 5.2.3 PRRSV、CSFV、PCV-2基因芯片的点制 |
| 5.2.4 基因芯片的杂交与洗片 |
| 5.2.5 基因芯片的扫描与数据分析 |
| 5.2.6 基因芯片的杂交温度的确定 |
| 5.2.7 基因芯片的特异性试验 |
| 5.2.8 基因芯片的灵敏度试验 |
| 5.2.9 猪重大病毒性疾病基因芯片的重复性试验 |
| 5.2.10 基因芯片的临床样品检测 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 基因芯片的杂交温度的确定 |
| 5.3.2 基因芯片的特异性试验结果 |
| 5.3.3 基因芯片的灵敏度试验结果 |
| 5.3.4 基因芯片的重复性试验结果 |
| 5.3.5 基因芯片的临床样品结果 |
| 5.4 |
| 5.4.1 基因芯片载体的选择 |
| 5.4.2 芯片设计 |
| 5.4.3 关于探针和靶标的定义 |
| 5.4.4 关于探针的选择 |
| 5.4.5 关于标记方法 |
| 5.4.6 芯片检测的临床应用 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词一览表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
（7）广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪呼吸道疾病综合征概述 |
| 2 PRDC的主要病原 |
| 2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 |
| 2.2 猪瘟病毒 |
| 2.3 猪圆环病毒 |
| 2.4 猪伪狂犬病毒 |
| 2.5 猪流感病毒 |
| 2.6 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 |
| 2.7 猪细小病毒 |
| 2.8 猪链球菌 |
| 2.9 产毒素多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌 |
| 2.10 副猪嗜血杆菌 |
| 2.11 猪附红细胞体 |
| 3 研究的目的意义 |
| 第二章 PRDC的病原学检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 被检材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 细菌分离鉴定培养基 |
| 1.5 PCR检测引物 |
| 1.6 PRDC病原学检测技术路线 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品和流行病学资料的收集及临床初步诊断 |
| 2.2 病原学检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品和流行病学资料的收集及临床初步诊断 |
| 3.2 病原学检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRDC致病性特征 |
| 4.2 引发PRDC的主要病原分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 PRDC病例病理组织学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病理组织材料的采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 病理组织切片制作 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺脏 |
| 2.2 脾脏 |
| 2.3 肝脏 |
| 2.4 肾脏 |
| 2.5 淋巴结 |
| 2.6 心肌 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 PRDC的防控措施 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验时间和地点 |
| 1.2 被检材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 综合防控技术方案 |
| 2.2 PRDC主要原发性病原的控制净化技术要点 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）猪瘟病毒强毒株与疫苗C株鉴别方法的建立及疫苗病毒定量检测的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 猪瘟概况 |
| 1.2 猪瘟研究进展 |
| 1.2.1 猪瘟病毒 |
| 1.2.2 猪瘟病毒基因组结构 |
| 1.2.3 猪瘟病毒编码蛋白 |
| 1.2.4 猪瘟病毒的遗传分型 |
| 1.2.5 猪瘟的诊断方法 |
| 1.2.6 猪瘟疫苗 |
| 1.2.7 强毒与弱毒疫苗的鉴别诊断 |
| 1.2.8 结语 |
| 1.3 实时荧光定量PCR 研究进展 |
| 1.3.1 实时荧光定量PCR 的原理 |
| 1.3.2 实时荧光定量PCR 的分类 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR 的定量方法 |
| 1.3.4 实时荧光定量PCR 的应用 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 引物设计及合成 |
| 2.1.4 病毒 |
| 2.1.5 待检病料 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 实验仪器 |
| 2.1.8 病毒基因组总RNA 的提取 |
| 2.1.9 反转录cDNA 的合成 |
| 2.1.10 套式PCR 扩增反应 |
| 2.1.11 特异性实验 |
| 2.1.12 敏感性实验 |
| 2.1.13 重复性实验 |
| 2.1.14 临床应用 |
| 2.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 引物设计及合成 |
| 2.2.4 病毒 |
| 2.2.5 待检病料 |
| 2.2.6 实验仪器 |
| 2.2.7 病毒RNA 的提取和反转录cDNA 的合成 |
| 2.2.8 常规PCR 扩增反应 |
| 2.2.9 荧光定量PCR 扩增反应 |
| 2.2.10 复合荧光定量PCR 反应 |
| 2.2.11 特异性实验 |
| 2.2.12 敏感性实验 |
| 2.2.13 重复性实验 |
| 2.2.14 与RT-nPCR 的比较 |
| 2.3 SYBR GREENΙ实时荧光定量 RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究 |
| 2.3.1 菌株与质粒 |
| 2.3.2 试剂 |
| 2.3.3 引物设计及合成 |
| 2.3.4 疫苗 |
| 2.3.5 病毒 |
| 2.3.6 实验用兔 |
| 2.3.7 标准品的制备 |
| 2.3.8 实验仪器 |
| 2.3.9 病毒RNA 的提取和反转录cDNA 的合成 |
| 2.3.10 常规PCR 反应 |
| 2.3.11 荧光定量PCR |
| 2.3.12 特异性实验 |
| 2.3.13 敏感性实验 |
| 2.3.14 重复性实验 |
| 2.3.15 标准品的制备 |
| 2.3.16 疫苗样品检测 |
| 2.3.17 荧光定量PCR 检测 |
| 2.3.18 兔体定型热反应法检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立 |
| 3.1.1 RT-nPCR 检测方法的建立 |
| 3.1.2 重组质粒的PCR 鉴定及双酶切鉴定 |
| 3.1.3 复合RT-nPCR 的特异性 |
| 3.1.4 复合RT-nPCR 的敏感性 |
| 3.1.5 复合RT-nPCR 的重复性 |
| 3.1.6 临床应用 |
| 3.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究 |
| 3.2.1 荧光定量PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 特异性实验 |
| 3.2.3 敏感性实验 |
| 3.2.4 重复性实验 |
| 3.2.5 与RT-nPCR 的比较 |
| 3.3 SYBR GREEN Ι实时荧光定量RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究 |
| 3.3.1 常规PCR 扩增产物电泳结果 |
| 3.3.2 荧光定量PCR 扩增结果 |
| 3.3.3 特异性实验 |
| 3.3.4 敏感性实验 |
| 3.3.5 重复性实验 |
| 3.3.6 标准曲线的建立 |
| 3.3.7 疫苗样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立 |
| 4.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究 |
| 4.3 SYBR GREEN Ι实时荧光定量RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 论文发表情况 |
（9）同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 第一章 引 言 |
| 1.1 瘟病毒概述 |
| 1.1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述 |
| 1.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗概述 |
| 1.1.3 BVDV 概述 |
| 1.1.4 瘟病毒基因组结构及其功能 |
| 1.1.5 瘟病毒基因组编码的蛋白及其功能 |
| 1.1.6 猪瘟病毒的遗传分型 |
| 1.1.7 BVDV 的遗传分型 |
| 1.2 瘟病毒的诊断方法和研究现状 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 血清学诊断 |
| 1.2.3 免疫学诊断 |
| 1.2.4 分子生物学诊断技术 |
| 1.2.5 鉴别检测技术 |
| 1.3 荧光定量 PCR |
| 1.3.1 荧光定量PCR 原理 |
| 1.3.2 荧光定量PCR 的定量形式 |
| 1.3.3 荧光定量PCR 的分类 |
| 1.3.4 多重荧光定量 PCR 及其在病毒研究上的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 第二章 同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1 型的三重荧光定量 RT-PCR 方法的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 引物和探针 |
| 2.1.4 病毒RNA 的提取和反转录 |
| 2.1.5 三重荧光定量RT-PCR 阳性标准品的制备 |
| 2.1.6 三重荧光定量RT-PCR 反应条件的优化 |
| 2.1.7 特异性试验 |
| 2.1.8 敏感性试验 |
| 2.1.9 重复性试验 |
| 2.1.10 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率试验 |
| 2.1.11 病毒分离的验证 |
| 2.1.12 三重荧光定量 RT-PCR 对现地样品的检测和种系发生分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 三重荧光定量RT-PCR 标准曲线的建立 |
| 2.2.2 三重荧光定量RT-PCR 的特异性 |
| 2.2.3 三重荧光定量RT-PCR 的敏感性 |
| 2.2.4 三重荧光定量RT-PCR 的重复性 |
| 2.2.5 病毒分离的验证结果 |
| 2.2.6 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率 |
| 2.2.7 种系发生分析 |
| 2.3 讨论 第三章 总结 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株与细胞 |
| 1.2 样品来源 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 病毒的增殖 |
| 1.6 病料的处理 |
| 1.7 病毒液、病料中病原RNA模板的制备 |
| 1.8 RT-PCR扩增及鉴定 |
| 1.9 RT-PCR的特异性试验 |
| 1.10 RT-PCR的敏感性试验 |
| 1.11 RT-PCR的重复性试验 |
| 1.12 RT-PCR的应用性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增及鉴定 |
| 2.2 RT-PCR特异性试验 |
| 2.3 RT-PCR敏感性试验 |
| 2.4 RT-PCR重复性试验 |
| 2.5 RT-PCR的应用性检测 |
| 3 讨论 |
四、用复合PCR直接分型临床样品中BVDV（论文参考文献）
- [1]猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价[D]. 马振乾. 吉林大学, 2019(02)
- [2]BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒的研制及应用[D]. 周军. 西南民族大学, 2018(05)
- [3]我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究[D]. 邓宇. 四川农业大学, 2012(07)
- [4]猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究[D]. 张永涛. 河南农业大学, 2011(06)
- [5]山东省猪感染BVDV调查及BVDV E2基因的序列分析[D]. 聂兆晶. 山东农业大学, 2011(08)
- [6]PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立[D]. 叶芬. 西南大学, 2011(10)
- [7]广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施[D]. 刘翠权. 南京农业大学, 2011(06)
- [8]猪瘟病毒强毒株与疫苗C株鉴别方法的建立及疫苗病毒定量检测的研究[D]. 李安. 山东农业大学, 2010(06)
- [9]同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 张兴娟. 扬州大学, 2010(02)
- [10]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 孟雨,吴发兴,朱紫祥,张志,张燕霞,刘爽,李晓成,王晶钰. 中国兽医科学, 2010(01)
标签：elisa试剂盒论文; 基因分型论文; 引物设计论文; 基因合成论文; 抗原抗体论文;