一、Cloning and Sequencing of S Gene of Novel Variant of Infectious Bronchitis Virus ZJ971 Isolates in China（论文文献综述）
董志华[1]（2019）在《四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究》文中研究表明鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病,广西养禽业由该病造成的经济损失非常大。鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）基因组十分容易发生变异,不同国家或地区IBV流行株的基因组存在很大的差异。为了进一步阐明广西IBV分子致病变异机制和致病机理,有效控制该病,促进广西养禽业健康发展,非常有必要对广西IBV流行株进行全基因组测序分析和致病性研究。因此,本研究对四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列进行测定,并对获取的全基因组序列进行生物信息学分析,最后对该四株IBV变异株进行SPF鸡和樱桃谷肉鸭的动物回归试验,对其进行致病性研究,旨在为本地区IB防控提供依据。第一,采用高通量测序技术对IBV变异株GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株进行全基因组序列测定,分别对四株样品进行RNA提取、反转录、文库构建、测序和数据分析。研究结果显示:（1）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株全基因组核苷酸序列长度分别为27477 bp、27751 bp、27674 bp和27663 bp;（2）四株IBV基因组结构均符合经典的结构:5’-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。第二,对获得的四株IBV全基因组序列进行生物信息学分析,包括全基因组序列碱基插入和缺失分析、相似性分析、系统发育分析、重组分析、S1蛋白裂解位点分析、糖基化位点分析和RNA茎环结构预测。结果显示:（1）四株代表性IBV变异株主要在基因组核苷酸2928～3428位、20490～20930位、21330～21550位、24180～24740位和27370～27440位存在明显的碱基插入和缺失现象;GX-N160421株在高度保守的N基因505～507bp处连续缺失3个碱基（aa:S）,为本地区首次发现的N基因连续缺失毒株。（2）GX-NN130048株与GX-YL9、YX1010和DY07株相似度较高,均在95.0%以上;GX-NN160421株与CKCHHB2016和GX-NN09032株相似度较高,均在96.4%以上;GX-QZ170728、GX-QZ171023株和YX10株相似度较高,分别为95.2%和95.3%。（3）GX-NN130048、GX-QZ170728和GX-QZ171023株主要与YX10和DY07株位于较近的发育分支树上;GX-NN160421株主要与GX-NN09032和CK株位于较近的发育分支树上。GX-NN130048和GX-QZ170728株S1基因均属于4/91-type,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1基因分别属于New-type和CK/CH/LSC/991-type。（4）GX-NN130048和GX-QZ170728株是来源于疫苗株4/91和LX4型野毒株的重组株,GX-NN130048株重组片段断点为1～20444和26981～27477,GX-QZ170728株重组片段断点为1～19046和26821～27674。（5）S1基因型为4/91-type的GX-NN130048和GX-QZ170728株的S1蛋白裂解位点为RRSRR,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1蛋白裂解位点分别为HRRKR和RRFRR。（6）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和 GX-QZ171023株S1基因N-糖基化位点分别为18、10、17和16个,N基因均为1个。（7）以基因组5’端前导序列为模板预测出3个RNA茎环结构,主要与4/91、M41、CQ04-1、SAIBK和SC021202株存在突变位点;以基因组ORF1b融合区为模板预测出2个茎环结构,主要与BJ和California株存在突变位点;其中茎环结构I是主要的核苷酸突变位点。本部分研究结果表明本地区IBV变异株主要由点突变和基因重组引起,基因组5’端前导序列和ORF1b融合区茎环结构可能对于基因重组具有重要作用,IB的防控面临更严峻的挑战。第三,为进一步了解四株代表性IBV变异株的致病性,本课题进行了G X-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株对SPF鸡以及鸭源GX-QZ170728株对樱桃谷肉鸭的致病性试验。将SPF鸡随机分为4组攻毒组和对照组,樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组。7日龄所有攻毒组的动物分别点眼滴鼻1×106 EID50的病毒液,对照组采用等量PBS替代。攻毒后每日观察各组临床症状,及时剖检死亡鸡,记录发病率和死亡率。采集0、1、7、11、14和21 dpi血清进行IBV特异抗体的检测;采集1、3、5、7、11、14和21 dpi气管、肺脏和肾脏制作组织切片及观察病理学变化,并使用荧光定量PCR检测气管、肾脏和肛拭子的病毒载量。结果表明:（1）攻毒24 h以后,攻毒鸡出现精神沉郁、羽毛松乱、体重下降、喘气、气管啰音和饮水量增加等临床症状;剖检鸡出现气管粘液和出血、肾肿大苍白和花斑肾等病变。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭无异常变化。（2）四株IBV攻毒鸡发病率为53.33%～100%,死亡率为2.22%～28.89%,GX-QZ171023组发病率和死亡率最高。鸭源GX-QZ170728株攻毒的樱桃谷肉鸭死亡率为0%。（3）0～21 dpi时攻毒组鸡的抗体水平逐渐升高,21 dpi时抗体滴度均大于试剂盒阳性判定值;整个试验期间对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭抗体水平一直较低且无变化。（4）组织病理学观察显示:四株病毒均导致气管黏膜结构混乱、上皮细胞变性坏死和大量炎细胞浸润,肺脏上皮细胞变性坏死、大量炎细胞浸润、局部肺淤血和肺房受压萎缩。GX-QZ171023组肾小管大量坏死、个别肾小球细胞坏死、萎缩,GX-NN130048组肾脏有少量淋巴细胞浸润,其余两组攻毒鸡肾脏无异常变化;对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭病理切片无异常变化。（5）荧光定量PCR检测结果显示:1～21 dpi时4组攻毒组鸡气管、肾脏和肛拭子均可检测到IBV;GX-NN130048组和GX-NN160421组气管病毒载量明显高于肾脏病毒载量;GX-QZ170728组和GX-QZ171023组肾脏病毒载量明显高于气管病毒载量。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭均未检测到IBV。本部分研究结果表明,四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本研究结果表明,广西IBV仍然不断变异,IBV变异株主要由点突变和基因重组引起;四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728分离株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本课题丰富了 IBV以及冠状病毒的全基因组生物信息库,为致病性研究提供依据,对广西乃至全国IB的防控具有重要的参考价值。
韩绪春[2]（2015）在《鸡传染性支气管炎病毒强弱毒株全基因组序列测定与分析》文中研究说明鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。鸡是IBV最主要的宿主,但不是唯一的宿主。IBV是冠状病毒γ群的代表种,为有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒。由于IBV频繁的变异、重组,导致不断出现新的变异毒株。IBV具有众多的血清型,而血清型、基因型以及致病型之间也没有特定的对应关系。目前,国内使用的多数弱毒疫苗与流行毒株之间的亲缘性较远,这导致它们之间交叉保护作用很弱或没有交叉保护作用。本实验通过测定HQ10毒株及其传代致弱毒株HQ110的全基因组序列,分析可能与致病力改变相关的基因,以及了解HQ10毒株的亲缘进化关系。本实验根据GenBank上已公布的IBV全基因组序列,选取其中5个全基因组序列作为参考序列（GenBank登录号分别为:NC001451.1、KF411041.1、FJ807652、DQ646405、AY338732）,设计 IBV 全基因组扩增引物。利用 RT-PCR和RACE技术对HQ10毒株和传代致弱毒株HQ110进行序列扩增,随后进行片段克隆和序列测定。结果表明,HQ10和HQ110全基因组序列大小都为27762 nt,基因组结构为 5’-Cap-1a-1b-S（S1,S2）-3a,b,c（E）-M-5a,b-N-3’Poly（A）,包含 10 个开放阅读框,符合经典的IBV基因组结构。HQ10和HQ110的3’UTR和5’UTR分别为504 nt和525 nt。Gene 1大小为19889 nt（526～20414位）,包含2个开放阅读框。S基因（20365～23862位）大小为3498 nt,S蛋白裂解位点都为HRRRR,S1（20365～21984）和 S2（21985～23862）基因大小分别为 1620 nt 和 1878 nt,分别编码540和625个氨基酸。Gene 3（23862～24539位）包含3个开放阅读框,3a（173 nt）、3b（192 nt）和 E（333 nt）,分别编码 57、63 和 110 个氨基酸。M基因（24508～25188位）大小为681 nt,编码226个氨基酸。Gene 5（25542～25984位）,包含2个开放阅读框5a（198 nt）和5b（249 nt）,分别编码65和82个氨基酸。N基因（25927～27156位）大小为1230 nt,编码409个氨基酸。HQ10毒株与选取的国内外参考毒株全基因组序列同源性分析表明,HQ10与LX4毒株同源性最高（92.4%）,而与H52和H120同源性最低（86.2%）。从全基因组及各结构基因系统进化树分析表明,HQ10与LX4毒株属于同一进化分支,而与H52、H120和M41等常用疫苗株亲缘关系较远。虽然传代致弱毒株HQ110和HQ10全基因组序列相似度高达99.88%,但是两者之间的致病力却完全不同。通过HQ10和HQ110全基因组序列的比对发现,传代前后两者仅有32个核苷酸变化,导致24个氨基酸位点的改变。Gene1有15个核苷酸序列的改变,引起12个氨基酸位点的改变。S1基因有6个核苷酸位点的改变,引起5个氨基酸位点的改变。S2基因有3个核苷酸序列的改变,引起3个氨基酸位点的改变。E基因有2个核苷酸序列的改变,引起1个氨基酸的改变。5a和N基因各有1个核苷酸位点的改变,各引起一个氨基酸位点的改变。3’UTR区域存在2个核苷酸位点的改变。传代前后两者序列的改变主要集中在Gene 1复制酶基因、S基因及3’UTR区域。
陈玲凤[3]（2014）在《中国部分Massachusetts型鸡传染性支气管炎病毒的生物学特性》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起的一种急性高度接触性病毒性疾病。中国大部分地区使用Mass血清型疫苗进行预防,但Mass型鸡传染性支气管炎病毒在发生呼吸道病鸡场的病鸡中仍有较高的分离率。本研究以32株Mass型IBV分离株为研究对象,首先测定其基因组序列,并对全基因组及其各个基因片段分别进行比较分析,构建遗传进化树,阐明中国IBV分离株与Mass型参考株之间的系统进化关系。然后,选择5株重组毒株进行体外中和试验,分析毒株的抗原性变化。最后,将5株重组毒株进行动物试验,观察毒株的致病性及H120疫苗对毒株的免疫保护效应。本研究对32株IBV分离株的基因组进行克隆、测序及拼接,比较32株IBV分离株与20株Mass型参考毒株的基因组序列,并进行遗传进化分析,结果显示其中25株分离株属于H120样型毒株,2株分离株属于Mass41样毒株,5株分离株属于重组毒株。比较分析基因组的各个基因片段,发现基因的点突变现象存在于所有IBV分离株基因组不同位置,而ck/CH/LHB/111172、 ck/CH/LDL/110931、ck/CH/LHB/130573、ck/CH/LHB/130598和ck/CH/LSD/111219这5株分离株均由H120疫苗株和另一种毒株重组形成。其中ck/CH/LDL/110931由H120疫苗株和Connecticut型病毒重组形成,其重组位点位于S1基因的3’端；ck/CH/LHB/130573由H120疫苗株和tl/CH/LDT3/03株重组形成,其重组位点也位于S1基因的3’端；ck/CH/LHB/130598由H120疫苗株和4/91毒株重组形成,其重组位点位于M基因与基因5之间的间隔序列；ck/CH/LSD/111219由H120疫苗株和DY07株重组形成,有两个重组位点,分别位于ORF1的nsp14和基因3的ORF3b; ck/CH/LHB/111172由H120疫苗株和TW2296/95株重组形成,有两个重组位点,分别位于E基因和基因5的ORF5a。选择重组毒株ck/CH/LHB/111172、ck/CH/LDL/110931、ck/CH/LHB/130598ck/CH/LHB/130573和Pck/CH/LSD/111219株进行体外中和试验。采用固定病毒量—稀释血清法（β法）进行交叉中和试验,以判定各毒株的血清型。结果表明,ck/CH/LHB/130598、ck/CH/LSD/111219及ck/CH/LHB/111172属于Mass血清型,而分离株ck/CH/LDL/110931与H120疫苗株及Connecticut型病毒的血清型均不相同,是一种新的血清型病毒；分离株ck/CH/LHB/130573与H120疫苗株及tl/CH/LDT3/03株的血清型均不相同,是一种新的血清型病毒。选择重组毒株ck/CH/LHB/111172、ck/CH/LDL/110931、ck/CH/LHB/130598ck/CH/LHB/130573和ck/CH/LSD/111219感染SPF鸡群及H120免疫鸡群,通过观察SPF鸡群的临床症状、发病率及死亡率,并定性检测口咽拭子病毒的存在,分析重组毒株的致病性及H120疫苗对重组毒株的免疫保护效果。结果表明,5株重组病毒只引起攻毒组鸡群轻微的临床症状,包括伸颈、甩鼻、羽毛蓬松或两翅下垂等症状,并不引起SPF鸡的死亡。因此,这5株重组毒致病力较弱。根据免疫鸡群的临床症状及口咽拭子病毒检测结果,H120疫苗株对分离株ck/CH/LHB/130598、ck/CH/LSD/111219及ck/CH/LHB/111172具有良好的免疫保护效应,对分离株ck/CH/LDL/110931和ck/CH/LHB/130573不能提供良好的免疫保护作用。
杜威威[4]（2014）在《鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备》文中提出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种高度接触性、急性呼吸道传染病。目前该病在全世界传播流行广泛,给养禽业造成严重的经济损失。由于该病毒频繁出现基因的突变和重组现象,导致很多不同基因型和血清型毒株的出现,而且这些毒株间的交叉保护性较低,甚至不存在交叉保护性,因此分析IBV基因组的结构特点有助于对传染性支气管炎进行防控。本研究以IBV SC021202株作为参考毒株设计了20对引物,利用RT-PCR法对IBVHH06株的内部基因组序列进行分段扩增,同时利用RACE Kit试剂盒对基因组的非编码区5’UTR和3’UTR进行扩增,对扩增得到的所有片段进行克隆及序列测定。将测序结果进行拼接,并且利用DNAStar软件和MEGA5.0软件对其全进组及各个基因序列进行生物信息学分析。结果显示IBV HH06株全基因组由27663个核苷酸组成,具有典型IBV基因序列特征。对不同毒株的全基因组及各个基因的序列大小进行比较,发现各毒株间3a、3b、5a、5b和N基因长度最保守,序列大小一致；5’UTR、3b、E和M基因进化相对较保守,序列大小差异较小；基因的缺失和插入主要发生在1a、1b、S基因和3’UTR区域。同源性分析比对结果显示,HH06株与其它毒株全基因组的核苷酸同源性在86%-96%之间,其中与SC021202株同源性最高,而与BJ株同源性最低；各个基因同源性比较中5’-UTR、ORF1b、E、M、5a、5b和N基因同源性相对较高可达80%-99%。全基因组及各个基因序列的系统进化树分析显示,在所有系统进化树中HH06株始终与SC021202株具有较近的亲缘关系,而与Mass型毒株亲缘关系较远。各毒株的不同基因进化树进化分支情况也有所差异,这与不同基因在进化过程中的保守性和变异情况有关。根据S1基因对不同毒株进行分型,结果显示HH06株属于HN08型。同时对不同毒株的S基因裂解位点进行比对分析,不同血清型的毒株其裂解位点不尽相同并且裂解位点的氨基酸位置也有所差异,分析这可能是由于基因的突变、缺失和插入造成的,该病毒的裂解位点是536-540位的RRFRR。此外,重组和压力选择分析表明HH06株可发生重组和正向压力选择现象。对传染性支气管炎病毒（IBV）HH06株M蛋白的抗原性和亲疏水性进行分析,去除跨膜区后的M膜内区基因成功亚克隆于pET-30a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET30a-M转化E. coli Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达获得20ku重组M蛋白。Western-blot检测表明,重组蛋白能够与IBV参考阳性血清反应。以纯化重组M蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,其ELISA效价达到1:218; Western-blot结果证实,其具有良好的反应性和特异性。间接免疫荧光试验表明,抗M蛋白多克隆抗体可以检测到PVAX-M1转染BHK-21细胞所表达的M蛋白,且与IBV HH06毒株具有很好的特异性反应。病毒感染抑制试验表明,多抗血清对IBV Beaudette株的抑制率可达到25.9%。上述研究结果为IBV检测及M蛋白功能的深入研究奠定了基础。
李孟[5]（2013）在《广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究》文中提出鸡传染性支气管炎（infectiousbronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（avianinfectious bronchitis virus,IBV）引发的一种鸡的传染性疾病。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏,可引起相应组织的上皮细胞病变和损伤,而且更重要的是容易因此而引起细菌及其它病原的继发感染,引起更大的损失,是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性,以及IBVRNA聚合酶有着特殊的校对机制和间歇性的复制过程,使得IBV基因组极易发生碱基的缺失、插入、点突变及不同来源的病毒基因之间发生重组。这样的结果是IB病毒的血清型、基因型和致病性等生物学特性极易发生变异,造成IB临床表现复杂及血清型众多,而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,从而给本病的免疫防控带来很大的困难。虽然我们在实际生产中使用IB疫苗对鸡群进行多次免疫,但是该病在广西仍不断发生并对养禽场造成了不小的损失。为了全面了解IB在广西家禽中的感染和流行情况,探明IBV主要流行株的类型及其地域分布;从基因水平上寻找IBV的传播、流行和危害的分子机制;同时建立泛素介导的IBV DNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据,彻底解决目前因疫苗所用毒株血清型与本地的存在差异而造成免疫效果不佳的难题,开展了本课题的研究。主要研究内容及结果如下:1、1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究本研究对课题组1985-2012年间从广西主要养殖地区分离到的60株IBV,应用RT-PCR方法扩增其纤突蛋白（S1）、膜蛋白（M）、核蛋白（N）和3’UTR基因并进行了序列的测定、分析和比较,同时还构建它们的系统进化树,分析了 60株广西IBV分离毒株之间及与参考毒株之间的关系。结果表明,与我国常用IBV疫苗毒株及国外IBV毒株相比,广西大部分IBV分离毒株在这些结构基因的核苷酸及推导氨基酸序列存在广泛的基因突变、缺失或插入现象,广西IBV分离株具有多个基因进化群而且与常用疫苗株亲缘关系较远,这可能是造成广西IBV分离毒株基因组发生变异以及常用疫苗效果不佳的主要原因之一。从S1、N和M基因的进化关系上分析的结果显示广西IBV基因的遗传变异正处在一个不断演化的过程当中,其特征是同一时间段内分离到的病毒之间的核苷酸有较高的同源性,不同地域毒株之间无差异或存在的差异性较小;3’UTR基因研究结果表明大部分毒株之间亲缘较近,少部分毒株与参考株相比较存在不同程度的基因缺失。从进化树的分群关系我们发现,GX-NN1和GX-NN2存在明显的野毒株与疫苗株重组现象、GX-NN09093则可能是由疫苗株H120通过点突变演化而来。同时,对57株分离病毒和3株参考毒株进行了血清分型研究的结果显示,广西存在有7种不同血清型而且大部分的分离毒株血清型与疫苗株血清型不同,不同时期流行的优势血清型也不同,这也可能是导致目前所用疫苗免疫不佳的另外一个原因。此外,课题还对基因分型与血清分型之间的关系进行了探讨。2、鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析根据前面研究的结果,本研究选取不同时期广西IBV代表分离毒株GX-C和GX-NN09032.进行全基因组序列的测定。以GenBank公布的IBV全基因组序列作为参考进行引物设计和合成。在序列5’端和3’端RACE中使用商品化试剂盒,得到了两个分离毒株序列的5’端和3’端全长序列。测序结果表明GX-C基因组全长为27 701 bp,GX-NN09032基因组全长为27684bp。通过对这两个毒株全基因组的基因注释及各部分的同源性分析、全基因组序列与参考毒株的系统发育树构建、各个结构蛋白基因系统发育树构建等生物信息学分析,结果表明GX-C和GX-NN09032全基因组在核苷酸序列水平上分别与H120和GX-YL5的亲缘关系最近;各结构蛋白基因系统发育分析结果显示,两个分离毒株与参考株之间存在着不同程度的基因重组现象;进一步的分析还发现,GX-NN09032在S和3’ UTR基因分别存在明显基因重组和缺失现象。3、泛素介导鸡IBV主要抗原基因免疫应答的研究本研究应用基因重组技术,以pVAX1为载体将鸡的泛素（ubiquitin,Ub）基因与广西主要流行毒株GX-YL5的S1、N基因通过引入一段编码（G4S）3多肽的碱基linker进行连接,然后分别插入其多克隆位点,构建四个重组质粒pVAX1-N、pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1。经RT-PCR及间接免疫荧光技术确定目的基因及其蛋白在Vero细胞中的转录及表达情况。在动物免疫保护试验中,利用酶联免疫吸附试验、qPCR及流式细胞技术对不同试验组鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用攻毒试验进一步确定其免疫保护效果。RT-PCR检测的结果表明,转染了构建的重组表达质粒的Vero细胞中均能扩增出特异的N基因片段,表明四个质粒在细胞内分别转录出了目的基因的mRNA;间接免疫荧光检测结果表明,转染了四个质粒的Vero细胞均显示出特异性的绿色荧光,表明构建的重组表达质粒的均能在Vero细胞中表达出目的蛋白而且具有免疫原性;动物免疫试验结果表明,构建的重组表达质粒和商品疫苗H120免疫组各个日龄的免疫指标都高于空质粒对照组,其中泛素介导的重组表达质粒免疫组的外周血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量、抗IBV特异性抗体水平以及免疫器官中IL-12和IFN-γmRNA的表达量,均有显着提高（P<0.05）,而以pVAX1-Ub-linker-N-S1免疫组最为明显。攻毒试验的结果表明不同免疫组的免疫保护率存在差异,细胞免疫应答水平高的免疫组保护率较高。结论:本研究的结果表明广西地区的IBV基因正在进行不断的演化和变异,加之已有的IB血清分型的结果我们可确定广西IB疫苗候选株。不同时期分离毒株的全基因组测序及分析发现IB毒株的进化与该时期毒株流行因素有关。通过对泛素与IBV抗原基因融合表达质粒的构建及其免疫应答的研究,建立了泛素介导的IBVDNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据。
张小荣[6]（2012）在《2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制》文中认为禽传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ-冠状病毒,由该病毒感染引起的疾病称为禽传染性支气管炎（avian infectious bronchitis,IB）,是一种对鸡危害非常严重的急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病,可导致鸡的增重和饲料报酬降低,也能引起蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降等,因此具有重要的经济意义,免疫预防是目前控制该病的最为有效的手段。IBV的重要特点之一就是血清型众多,不同血清型之间交叉保护性较低甚至完全不能保护,因此在生产中必须选用与流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保护效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征,而且由于病毒基因组的突变和毒株间的重组使得新的血清型不断出现,使免疫预防日益复杂化。本研究的目的旨在通过系统的流行病学监测了解近年来不同基因型IBV在我国的流行状况,通过生物信息学分析阐明不同IBV基因型间遗传演化的规律和发展趋势,并针对流行的优势基因型毒株研制新型疫苗。1、2009-2011年间国内IBV流行病学监测与流行株的遗传进化分析2009-2011年间,共从国内主要养鸡省份分离到IBV流行毒株54株,其中肉鸡源毒株52株,蛋鸡源毒株2株。在肉鸡源毒株中我们发现存在较高比例的IBV与H9亚型AIV的混合感染（25/52）,发生混合感染的鸡群往往发病更为严重,且混合感染样品对接种的鸡胚表现出更强的致病性,该结果提示这两种病毒之间可能存在一定程度的致病协同作用。对所有分离毒株S1基因进行克隆和基因测序,共发现4种不同的S1基因长度,分别为1611bp、1617bp、1620bp和1626bp,说明S1基因中碱基的插入和缺失是一种非常普遍的现象。将54个分离株S1基因序列和近年来在国内及周边国家和地区流行的13个基因型共57个参考毒株的S1基因序列用Mega4.1软件进行遗传进化分析,结果显示54个分离株可以分为QX型（42株）、HN-08型（5株）、LSC/991型（2株）、TW-I型（2株）、Mass型（1株）、793/B型（1株）和CHⅢ型（1株）等7个基因型。在所有分离株中,QX型分离株数量最多,占总数的77.8%（42/54）。从进化树中还可以看出,QX型分离株又可以进一步细分为两个不同的基因亚群-Cluster Ⅰ（21株）和Cluster Ⅱ（21株）,经典的QX型参考毒株QXIBV和LX4株均属于Cluster Ⅰ亚群,而Cluster Ⅱ亚群中的毒株均在2010年才开始出现。为了更加系统地描述同期内国内不同基因型IBV的分布情况,我们将已经在GenBank发表全长S1基因序列的所有同时期分离株共296株合并进行遗传进化分析,结果显示,350个同时期分离株可分为19个基因型,其中11个基因型均能根据现有文献报道找到同源的参考毒株,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（219株）、HN-08型（26株）、LSC/99I型（22株）、LDT3/03型（12株）、TW-I型（12株）、CH Ⅲ型（11株）、Mass型（10株）、LDL/971型（3株）、CH VI型（3株）、TW-Ⅱ型（2株）和793/B型（1株）,此外还有8个基因型未能归入已被正式命名的已知基因型,因此暂定名为未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。从分型结果可以看出,我国流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征,大多数在周边国家和地区广泛流行的基因型在我国并未发现。为阐明国内不同基因型毒株之间的遗传演化关系,根据遗传进化和基因分型的结果,从不同基因型中选择代表性毒株,用RDP3.31软件对S1基因进行重组分析。结果显示当前国内流行的毒株中存在广泛的重组现象,不同基因型间的重组事件不仅导致同一基因型内部发生分化,出现了不同基因亚群,而且经过多次的同源重组后可能会导致新的基因型毒株的出现。综合不同基因型间发生的系列重组事件,可以推断：QX型、LSC/991型、793/B型、LDL/971型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株,除此以外的新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次或多次的同源重组而产生的变异株。2、Mass型H120活疫苗对当前流行的主要基因型代表毒株的免疫保护效力试验根据遗传进化分析的结果,从当前主要流行的三个IBV基因型中挑选出4个代表毒株：AH/2009/1（QX型Cluster Ⅰ亚群）、JS/2010/12（QX型Cluster Ⅱ亚群）、JS/2009/5（LSC/99I型）和JS/2010/6（HN08型）,分别用Mass型IBV活疫苗（H120株）进行免疫保护效力试验,以评价现有疫苗对流行毒株的免疫保护状况。结果显示H120疫苗株对不同基因型的IBV毒株免疫保护效力存在较大差异,对同属于Mass基因型的M41强毒株能够提供完全保护，且能显着降低攻毒后气管和肾脏的排毒率；对于QX型毒株AH/2009/1和JS/2010/12,基本达到临床保护标准,但试验鸡气管和肾脏带毒的比例远远高于M41攻毒组,说明局部免疫保护效果不是非常理想；对于HN08型的JS/2010/6株和LSC/991型的JS/2009/5株保护效果均不理想,攻毒后鸡群表现出较为严重的临床症状和相当高的气管和肾脏排毒率。该结果提示我们,现有疫苗已经不能对当前流行的主要基因型毒株提供良好的免疫保护,急需研究开发与流行毒株基因型一致的新疫苗用于该病的防控。3、以马立克病毒为载体研制QX型IBV基因工程疫苗本研究以MDV CV1988/Rispens疫苗毒株为载体,以其IRS-US间隔区作为插入位点,选择网状内皮组织增生症病毒（REV）基因组长末端重复序列（LTR）作为启动子,构建含QX型IBV分离株CK/CH/JS/06Ⅱ S1基因及报告基因EGFP的转移载体pUP-LTR-EGFP-S1-DOWN。将MDV基因组DNA与转移载体共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组获得重组病毒,通过多轮荧光筛选和纯化,最终获得的重组病毒命名为rMDV-EGFP-S1。进一步通过Cre重组酶介导的重组反应敲除EGFP报告基因,获得仅带有LTR启动子和S1基因的重组病毒,命名为rMDV-S1。通过PCR和间接免疫荧光试验（IFA）对重组病毒进行鉴定,结果表明S1基因完全按照预定方式正确插入到MDV基因组中并能够表达S1蛋白。将重组病毒在CEF上进行连续30代传代培养,经PCR和IFA试验鉴定,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒rMDV-S1。对QX型IBV强毒株CK/CH/JS/06Ⅱ的免疫攻毒保护效力试验结果显示,重组病毒按5×103PFU/羽的剂量免疫1日龄SPF鸡,免疫后4w攻毒,免疫组试验鸡发病率和死亡率分别为30%和5%,对照组则分别为100%和30%,经χ2检验差异显着（p<0.05）。排毒检测结果显示,免疫组气管排毒率在攻毒后部分时间点与对照组相比差异显着,攻毒后14d扑杀时肾脏排毒率差异极显着（p<0.01）。免疫组试验鸡攻毒后的增重未受明显影响,与对照组相比差异显着（p<0.05）。病理组织学检查结果显示与对照组相比免疫组试验鸡肾脏的病变程度相对较轻。所有结果均表明重组病毒对QX型强毒株的攻击能够提供良好的免疫保护。重组病毒对MDV强毒株RB1B的免疫攻毒保护试验结果显示,与亲本病毒CV1988/Rispens相比,对MDV本身的免疫保护效率未受明显影响,说明该重组病毒可以作为二联疫苗同时用于IB和MD两种疾病的免疫预防。
赵芳芳[7]（2011）在《禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析》文中研究指明鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病。现在已经在全球流行蔓延,给世界家禽养殖业带来极大的经济损失。由于禽传染性支气管炎病毒（IBV）频繁的基因点突变和重组,目前已经出现了许多不同的血清型和基因型毒株,并且它们之间缺乏交叉保护性或交叉保护性低,所以分析某地区流行的IBV的基因组结构特点,有助于IB的防控。先前研究证实,近年来四川IBV分离株基因型主要是LX4即QX-like型。从S1基因进化树分析推出Sczy3分离株属于QX型,但是Sczy3基因组的其他基因片段还未被测序。本研究应用RT-PCR方法对Sczy3分离株基因组全序列进行测定,结果表明Sczy3分离株具有典型的禽状病毒基因序列特征5’Cap-1a-1b-S-3a-3b-（E）-M-5a-5b-N-3’Poly A。Sczy3分离株基因组长27695bp,含有10个开放阅读框（ORF）。Gene 1 （复制转录酶）含有两个开放阅读框ORF1a和ORF1b,分别由11856和7959个核苷酸组成,编码3951个和2652个氨基酸；Gene2（纤突蛋白基因,S）含有一个开放阅读框由3498个核苷酸组成,编码1165个氨基酸,其中S1基因编码540个氨基酸。Gene3（辅助蛋白基因）包括三个开放阅读框ORF 3a、ORF 3b和ORF3c（E）,分别编码57、62和108个氨基酸；Gene 4（膜蛋白基因,M）一个开放阅读框,由678个核苷酸组成,编码225个氨基酸；Gene 5（辅助蛋白基因）含三个开放阅读框ORF 5a和ORF 5b,分别编码65和82个氨基酸；Gene 6（核衣壳蛋白基因,N）由1230个核苷酸组成,编码409个氨基酸。部分相邻基因间有重叠现象。Gene 1和Gene 2重叠110 nt, Gene 2和Gene 3重叠32 nt, Gene 3和Gene 4重叠114 nt, Gene 5和Gene 6重叠159 nt。核酸序列同源性比较表明Sczy3与参考毒株基因组序列同源性在86.1%-94.1%之间,与QX-like IBV有核苷酸同源性最高,与Mass型IBV核苷酸同源性最低。S蛋白裂解位点分析表明H-R-R-R-R不是中国分离毒株特有的裂解位点。系统进化树分析显示,与LX4型IBV亲缘关系较近,与Mass型Conn型IBV毒株亲缘关系很远。重组分析推测,Sczy3是一株嵌合IBV毒株,假定亲本毒株是LX4和H120。综上所述,本实验课题为深入研究IBV在中国的演变特征,以及IBV的反向遗传学提供参考依据,同时也丰富了冠状病毒IBV的生物信息数据库。
宋翥远[8]（2010）在《传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列测定与分析》文中提出本实验室在1996-2008年间从浙江、安徽、四川等四个省市大型养殖场疑似传染性支气管炎（IB）的病死鸡中,采集了腺胃、肾脏、扁桃体、输卵管等病料,从这些病料共分离到32株传染性支气管炎病毒（IBV）。本研究在此基础上,对其中的一个肾病变型毒株JH06111进行全基因组测序及分析,并对其中有代表性的其他12株分离扩增S基因,进行基因序列分析研究。为研究IBV变异株的基因组及其变异特征,本实验通过基因扩增拼接的方法获得了肾病变型毒株JH06111的全基因组序列。序列分析表明,JH06111全长基因组大小为27,524bp,具有典型的IBV病毒基因编码特征5’-1a-1b-S（S1, S2）-3a, b, c（E）-M-5a, b-N-Poly（A）-3’,编码6个不同基因。通过与其他参考毒株的全长基因组比较分析,发现该IBV毒株基因组不仅在nsp2～nsp4、S～3b、基因组间区域（IG）到5a三个高核苷酸替代区域存在变异,而且在nsp3、E、M等区域也有大量核苷酸插入的现象,其中E、M基因的5′端各有10个氨基酸的插入,这个插入特性在IBV中是没有报道过的。同源性分析表明JH06111与肾型毒株SC021202同源性最高为89.9%,同肾型毒株TW2575／98同源性最低为85.5%。在JH06111的6个基因中,除了基因6与SC021202毒株的基因有99.3%的同源外,其他基因与选择的参考株都存在不同程度的变异。全基因组系统进化树分析表明,JH06111与LX4毒株亲缘关系最近,与疫苗株H52亲缘关系较远。此外,JH06111整个基因组广泛分布着重组位点"CT（T/G）AACAA"。综上所述,JH06111是一个具有独特变异特征的IBV新的变异株。
王霆[9]（2010）在《禽传染性支气管炎病毒H120株全基因组序列测定分析》文中进行了进一步梳理禽传染性支气管炎（IB）呈世界广泛流行,是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（IBV）很容易发生变异,导致新的变异株不断出现,且不同毒株之间交叉保护力弱,使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发,造成了严重的经济损失。禽传染性支气管炎病毒疫苗株H120是一株应用较早并具有代表性的IBV疫苗,至今仍在广泛的使用。本研究对IBVH120株的全基因组进行了序列测定和分析,对从分子水平研究IBV的基因组结构、变异和IBV的反向遗传学研究奠定基础。根据GenBank上公布的IBV基因组序列,经多重比较后设计18对引物,用RT-PCR方法对IBV疫苗株H120的全基因组进行分段扩增、克隆和序列测定。测定结果表明,H120基因组全长27631bp,包含有10个开放阅读框（ORF）。Gene 1包括2个开放阅读框,ORFla包括11802 nt（529-12330位）和ORFlb包括7959 nt（12405-20363位）,分别编码3934和2653个氨基酸。Gene 2,包括3549个碱基（20254-23799位）,含有一个开放阅读框（3 489nt）编码1163个氨基酸。S1基因包括1596个碱基（20314-21909位）,S2基因有1890个碱基（21910-23799位）,分别编码539和630个氨基酸。Gene 3为23771-24479位（709nt）,包括3个开放阅读框：3a（174nt）,3b（195nt）,3c（330nt）,分别编码5764和109个氨基酸。S基因和Gene 3有32个碱基重叠。Gene 4 （M基因）为24366-25128位（763nt）,只有一个开放阅读框（678nt）编码225个氨基酸。Gene 5（25471-25930位）包括2个开放阅读框：5a（198nt）和5b（249nt）分别编码65和82个氨基酸。Gene 6（N基因）为25772-27102位,含有一个开放阅读框（1230nt）,编码409个氨基酸。H120全基因组序列与GenBank上公布的其他15株IBV基因组序列的同源率在84.6-99.8%之间,与ZJ971的同源率最高99.8%。整个基因组中5’-UTR为最保守的区域,其同源率在91.5-99.6%之间,3’-UTR最不保守,同源率在49.9-99.6%之间。系统进化分析结果表明H120株与ArkDPI谱系的亲缘关系较近。本研究对H120全基因组序列进行了测定和分析,丰富了IBV的全基因序列生物信息数据库,为进一步对从分子水平研究IBV的强弱毒株的基因组功能、流行进化等具有重要意义。
时莉[10]（2009）在《四省区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理本研究从浙江、安徽两地大型养殖场或养殖产发病或濒死鸡9份病料（气管、腺胃、肾脏、盲肠扁桃体、输卵管）在9-11日龄SPF鸡胚盲传2-8代,共分离9株病原。死亡鸡胚表现出生长发育障碍,弥漫性出血,未死亡鸡胚呈现典型的卷曲胚,尿囊液不凝集鸡的外周血红细胞,病原经RT-PCR鉴定为传染性支气管炎病毒。采用RT-PCR方法扩增了我国山东、安徽、浙江、四川四个省区的32株IBV地方分离株的M基因和其中10株的N基因,并对其进行了克隆、序列测定及同源性分析,构建了系统进化树,阐明了本研究IBV分离株与疫苗株、国内外参考毒株之间的遗传演化关系,探讨了地方分离株的来源。对IBV分离株M基因序列比对结果发现,32个毒株中25个毒株M基因ORF由678bp组成,而Australia“T”由669bp组成;ZJ981、IBV-J由672bp组成;JH051、IBV-W由681bp组成;JH06111、JH06011、JD071201由711bp组成。以H52、H120两个疫苗株M基因ORF 225位氨基酸长度为参考,其他毒株与两疫苗株M基因5’端长度差异情况为:Australia“T”在5’端缺失3个氨基酸,ZJ981、IBV-J在M基因5’端缺失2个氨基酸,JH051、IBV-W在M基因5’端有一个氨基酸的插入,JH06111、JH06011、JD071201在M基因5’端11位氨基酸处有10个正向重复序列的插入。IBV M基因除5’端前20位氨基酸有较大变异外,其他多处区域存在点突变,表明IBV M基因存在不同程度的变异。10株IBV分离株N基因的ORF均由1230bp组成,编码序列长度为409个氨基酸组成的多肽,10株IBV分离株存在散在的点突变,没有碱基的缺失和插入,M、N基因同源性及系统发育进化树分析表明:大多数毒株M、N基因进化关系一致,而IBV-J、JH06111、ZJ981、IBV-W株M、N两基因进化关系出现了差异,推测JH06111为一基因重组株,JH06011、JD071201、IBV-W、JH051有一致的变异方向,而IBV-N、IBV-X、IBV-J、Z1971、ZJ981有一致的变异方向,SD07012 N基因与所有测序毒株的氨基酸同源性小于90%,是一较大变异株。
二、Cloning and Sequencing of S Gene of Novel Variant of Infectious Bronchitis Virus ZJ971 Isolates in China（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and Sequencing of S Gene of Novel Variant of Infectious Bronchitis Virus ZJ971 Isolates in China（论文提纲范文）
（1）四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学的研究概论 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎病毒的分类和形态 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒的理化和生物特性 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎发病机理和流行病学 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理变化 |
| 1.2.2 鸡传染性支气管炎的国外流行情况 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎的国内流行情况 |
| 1.2.4 IBV变异株的研究进展 |
| 1.3 鸡传染性支气管炎病毒的致病性研究 |
| 1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒对呼吸器官的致病性 |
| 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒对生殖器官的致病性 |
| 1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒对泌尿器官的致病性 |
| 1.3.4 鸡传染性支气管炎病毒对其他组织器官的致病性 |
| 1.4 鸡传染性支气管炎病毒基因组 |
| 1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构 |
| 1.4.2 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.3 鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.4 鸡传染性支气管炎病毒非编码区与生物学功能 |
| 1.5 鸡传染性支气管炎病毒全基因组生物信息学研究现状 |
| 1.5.1 鸡传染性支气管炎病毒全基因组测定分析的研究进展 |
| 1.5.2 生物信息学分析的理论基础 |
| 1.5.3 糖基化位点与蛋白裂解位点的理论基础 |
| 1.5.4 基因重组研究与RNA茎环结构研究 |
| 1.5.5 蛋白质立体结构研究与分子遗传变异研究 |
| 1.6 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV分离株背景 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的选择及合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2.3 病毒RNA的抽提及cDNA的合成 |
| 2.2.4 S1、E、M和N结构基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.5 高通量测序IBV全基因组序列 |
| 2.2.6 一代测序与高通量测序的对比分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的纯化 |
| 2.3.2 IBV S1、E、M和N结构基因序列 |
| 2.3.3 IBV全基因组序列 |
| 2.3.4 一代测序与高通量测序的对比 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 四株广西代表性IBV变异株的生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物信息学分析数据 |
| 3.1.2 生物信息学分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析 |
| 3.2.2 全基因组序列相似性分析 |
| 3.2.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组序列的重组分析 |
| 3.2.5 S1蛋白裂解位点分析 |
| 3.2.6 糖基化位点分析 |
| 3.2.7 RNA茎环结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析结果 |
| 3.3.2 全基因组序列相似性分析结果 |
| 3.3.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析结果 |
| 3.3.4 全基因组序列的重组分析结果 |
| 3.3.5 S1蛋白裂解分析结果 |
| 3.3.6 糖基化位点分析结果 |
| 3.3.7 RNA茎环结构预测结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 四株代表性IBV变异株的致病性试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验用SPF鸡胚、SPF鸡及樱桃谷肉鸭 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 4.2.2 SPF鸡及樱桃谷肉鸭分组与攻毒 |
| 4.2.3 病料的采集与处理 |
| 4.2.4 试验动物外周血血清抗体水平的检测 |
| 4.2.5 试验动物组织切片的制作与观察 |
| 4.2.6 试验动物组织器官病毒载量检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定结果 |
| 4.3.2 临床症状与剖检症状 |
| 4.3.3 试验动物外周血血清抗体水平检测结果 |
| 4.3.4 试验动物组织病理变化结果 |
| 4.3.5 试验动物组织器官病毒载量检测结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目 |
（2）鸡传染性支气管炎病毒强弱毒株全基因组序列测定与分析（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 IBV概述 |
| 1.2 IBV分子生物学特性 |
| 1.2.1 生物学分类地位 |
| 1.2.2 形态结构特征 |
| 1.2.3 理化特性和生物学特性 |
| 1.3 IBV基因组结构及编码蛋白 |
| 1.3.1 基因组结构 |
| 1.3.2 结构蛋白 |
| 1.3.3 非结构蛋白 |
| 1.4 IBV的复制机制 |
| 1.5 SMARTer~(TM) RACE概述 |
| 1.5.1 3'RACE |
| 1.5.2 5'RACE |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV毒株 |
| 2.1.2 SPF鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖与保存 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 IBV基因组分段引物的设计 |
| 2.2.4 反转录反应 |
| 2.2.5 PCR反应 |
| 2.2.6 RACE反应 |
| 2.2.7 PCR产物胶回收和纯化 |
| 2.2.8 PCR产物克隆 |
| 2.2.9 阳性重组质粒测序及全基因组序列拼接 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 基因组分段RT-PCR结果 |
| 3.2 RACE结果 |
| 3.3 全基因组序列测定结果 |
| 3.4 HQ10毒株部分序列碱基插入与缺失情况 |
| 3.5 HQ10毒株序列同源性分析 |
| 3.6 HQ10毒株系统进化树分析 |
| 3.7 强弱毒株全基因组序列对比分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 HQ10全基因组序列 |
| 4.2 强弱毒株全基因组序列对比 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.pGEM~(?)-T Easy载体的EcoR Ⅰ单酶切位点分析 |
| 2.LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基配置 |
| 3.10×TAE电泳缓冲液配置 |
| 致谢 |
| 基金项目 |
| 论文发表情况 |
（3）中国部分Massachusetts型鸡传染性支气管炎病毒的生物学特性（论文提纲范文）
| 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 摘要 Abstract 英文缩略表 第一章 引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 IB临床症状 |
| 1.1.2 IB流行情况 |
| 1.2 IBV的分子生物学特性 |
| 1.2.1 病原分类学 |
| 1.2.2 基因组结构 |
| 1.2.3 结构蛋白及其生物学功能 |
| 1.3 IBV的变异机制 |
| 1.3.1 基因突变 |
| 1.3.2 基因重组 |
| 1.3.3 环境压力 |
| 1.4 IBV的分型 |
| 1.4.1 IBV的免疫分型 |
| 1.4.2 IBV的血清分型 |
| 1.4.3 IBV的基因分型 |
| 1.4.4 IBV各种分型之间的关系 |
| 1.5 研究目的和意义 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 SPF鸡胚和雏鸡 |
| 2.1.3 受体菌与载体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.3 基因组5’末端扩增 |
| 2.2.4 基因组3’末端扩增 |
| 2.2.5 PCR产物纯化回收 |
| 2.2.6 PCR产物连接 |
| 2.2.7 感受态细胞TG1的制备 |
| 2.2.8 连接产物转化 |
| 2.2.9 重组质粒的提取 |
| 2.2.10 基因片段的序列测定 |
| 2.2.11 全基因组序列拼接与序列比较分析 |
| 2.2.12 中和试验 |
| 2.2.13 免疫保护试验 |
| 2.2.14 血清抗体检测 |
| 2.2.15 口咽拭子样品的处理及其病毒含量的检测 第三章 结果 |
| 3.1 病毒的全基因组扩增 |
| 3.2 全基因组序列的确定及系统进化分析 |
| 3.3 分段基因序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.1 IBV分离株基因1序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.2 IBV分离株S基因序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.3 IBV分离株基因3序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.4 IBV分离株M基因序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.5 IBV分离株基因5序列的确定及同源性分析 |
| 3.3.6 IBV分离株N基因序列的确定及同源性分析 |
| 3.4 结构蛋白基因的系统进化分析 |
| 3.4.1 S基因的系统进化分析 |
| 3.4.2 M基因的系统进化分析 |
| 3.4.3 N基因的系统进化分析 |
| 3.4.4 E基因的系统进化分析 |
| 3.5 中和试验结果 |
| 3.6 动物试验结果 |
| 3.6.1 临床症状 |
| 3.6.2 发病率和死亡率 |
| 3.6.3 血清中IBV抗体检测结果 |
| 3.6.4 口咽拭子病毒检测结果 第四章 讨论 |
| 4.1 基因组的分析 |
| 4.1.1 H120样型毒株的基因组分析 |
| 4.1.2 Mass41样型毒株的基因组分析 |
| 4.1.3 重组毒株的基因组分析 |
| 4.2 重组病毒的血清型分析 |
| 4.3 重组病毒的致病性分析 |
| 4.4 H120疫苗株对5株重组毒株的保护性分析 |
| 4.5 基因型与血清型之间的关系 |
| 4.6 IBV的变异特点分析 第五章 结论 参考文献 致谢 作者简历 |
（4）鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IBV的病原生物学研究 |
| 1.1.1 传染性支气管炎病毒的分类 |
| 1.1.2 传染性支气管炎病毒的形态 |
| 1.1.3 传染性支气管炎病毒的理化及生物特性 |
| 1.1.4 传染性性支气管炎病毒国内外流行情况 |
| 1.2 IBV的基因组结构 |
| 1.2.1 传染性支气管炎病毒结构蛋白生物学功能 |
| 1.2.2 传染性支气管炎病毒非结构蛋白生物学功能 |
| 1.2.3 传染性支气管炎病毒非编码区生物学功能 |
| 1.2.4 IBV的全基因组序列研究进展 |
| 1.3 IB的病理变化 |
| 1.3.1 传染性支气管炎病毒的致病性 |
| 1.3.2 传染性支气管炎病毒的临床症状及病理变化 |
| 1.4 IB的诊断和防治 |
| 1.4.1 传染性支气管炎的诊断 |
| 1.4.2 传染性支气管炎的防治 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及SPF鸡胚 |
| 2.1.2 毒株、菌株及质粒 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖培养 |
| 2.2.2 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.3 HH06株IBV全基因组内部片段的RT-PCR分段扩增 |
| 2.2.4 RACE法获取5’末端和3’末端非编码区片段 |
| 2.2.5 目的基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.6 IBV全基因组序列的生物信息学分析 |
| 2.2.7 IBV M部分基因的亚克隆及重组表达质粒的构建 |
| 2.2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.9 重组M1蛋白的多克隆抗体的制备 |
| 2.2.10 M1蛋白多克隆抗体的生物学功能检测 |
| 2.2.11 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 全基因组RT-PCR分段扩增结果 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 序列测定及拼接 |
| 3.4 全基因组序列的生物信息学分析 |
| 3.4.1 基因组结构分析 |
| 3.4.2 序列同源性分析 |
| 3.4.3 系统进化树分析 |
| 3.4.4 IBV S基因裂解位点分析比较 |
| 3.4.5 重组分析 |
| 3.4.6 压力选折分析 |
| 3.5 重组表达质粒PET30A-M1和PVAX-M1的构建 |
| 3.6 PET-M1蛋白的表达及WESTERN BLOT分析 |
| 3.7 M1蛋白多克隆抗体制备及其鉴定 |
| 3.7.1 M1蛋白多克隆抗体效价检测和Western blot分析 |
| 3.7.2 M1蛋白多克隆抗体IFA检测 |
| 3.7.3 病毒感染抑制实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 全基因组分段扩增 |
| 4.2 生物信息学分析 |
| 4.3 M蛋白表达分析 |
| 4.4 M蛋白生物学功能分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 IBV的流行变异及其防控 |
| 1.2.1 IBV的分类及组成 |
| 1.2.2 IBV的复制转录机制 |
| 1.2.3 IBV分子遗传变异的机制 |
| 1.2.3.1 基因突变引起的IBV遗传变异 |
| 1.2.3.2 基因重组的引起的IBV遗传变异 |
| 1.2.4 IBV疫苗免疫的研究现状 |
| 1.2.5 IBV全基因组研究现状 |
| 1.2.6 泛素和泛素-蛋白酶体途径 |
| 1.2.7 泛素在增强DNA疫苗免疫应答中的应用 |
| 1.3 课题研究目的和意义 第二章 1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.1.1 毒株及其来源背景 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 目的基因的引物设计 |
| 2.1.4 IB病毒的增殖及其总RNA的提取 |
| 2.1.5 RT-PCR扩增目的基因 |
| 2.1.6 目的基因的克隆及其核苷酸序列测定 |
| 2.1.7 目的基因序列的确定及其与参考株的比较和分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 S1、N、M基因和3'UTR RT-PCR扩增结果 |
| 2.2.2 S1、N、M基因和3'UTR序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.1 IBV分离株S1基因序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.2 IBV分离株N基因序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.3 分离株M基因的序列测定及其变异的比对与分析 |
| 2.2.2.4 IBV毒株3'UTR核苷酸序列测定及对比分析 |
| 2.2.3 基因分型与血清分型关系的探讨 |
| 2.2.3.1 血清分型结果分析 |
| 2.2.3.2 血清分型与基因分型关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 IBV分离株基因序列的变异情况 |
| 2.3.2 1985-2012年IBV分离毒株之间的遗传进化关系 |
| 2.3.3 血清分型与基因分型之关系的探讨 第三章 鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 IBV分离株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 全基因扩增引物 |
| 3.1.4 生物信息学分析所用的数据 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的增殖 |
| 3.2.2 病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增 |
| 3.2.4 基因组5'RACE和3'RACE |
| 3.2.5 PCR产物的鉴定及纯化 |
| 3.2.6 连接及转化 |
| 3.2.7 克隆的鉴定及序列测定 |
| 3.2.8 测序结果的拼接及分析 |
| 3.2.9 全基因组序列的同源性分析 |
| 3.2.10 全基因组序列的系统发育分析 |
| 3.2.11 结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.12 基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 GX-C和GX-NN09032全基因组序列RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 GX-C和GX-NN09032全基因组序列的基因注释 |
| 3.3.3 全基因组序列的系统发育分析 |
| 3.3.4 结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.3.5 序列相似性分析 |
| 3.3.6 GX-NN09032和GX-C的S、N和M蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在全基因组核苷酸序列水平上分析 |
| 3.4.2 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.4.3 GX-NN09032中可能存在的重组位点及其产生的机制 |
| 3.4.4 GX-NN09032和GX-C主要抗原蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 第四章 泛素介导鸡传染性支气管炎病毒主要抗原基因真核表达质粒的构建及其免疫应答的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒株、细胞株、菌株和载体 |
| 4.1.2 主要的分子生物学试剂及试剂盒 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要的生化试剂和血清 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 构建质粒引物的设计 |
| 4.2.2 Ub、N和S1基因的RT-PCR扩增 |
| 4.2.3 pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1、pVAX1-N及pVAX1-N-S1的构建策略 |
| 4.2.4 pVAX1-Ub-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1的构建过程 |
| 4.2.4.1 构建的融合基因及其相应融合蛋白二级结构的预测 |
| 4.2.4.2 各个目的基因的PCR及pVAX1双酶切产物的纯化与回收 |
| 4.2.4.3 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 4.2.4.4 重组质粒的测序鉴定 |
| 4.2.5 构建重组质粒的体外表达及其产物的检测 |
| 4.2.5.1 构建重组质粒的体外转染 |
| 4.2.5.2 免疫荧光方法检测转染重组质粒的基因表达 |
| 4.2.5.3 RT-PCR方法检测重组质粒在Vero细胞中的表达 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.6.1 动物试验的分组和处理 |
| 4.2.6.2 样品的采集和处理 |
| 4.2.6.3 免疫雏鸡血液T淋巴细胞亚型检测 |
| 4.2.6.4 血液中抗IBVIgG抗体的ELISA检测 |
| 4.2.6.5 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-ymRNA表达的检测 |
| 4.2.6.6 IBV攻击雏鸡后感染率及保护率 |
| 4.2.7 数据处理与分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 Ub基因和IBVN及S1基因PCR扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.2.1 融合基因表达蛋白特性的软件预测结果及分析 |
| 4.3.2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 |
| 4.3.2.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 4.3.3 融合基因真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 4.3.3.1 RT-PCR方法检测融合基因的mRNA表达 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光方法检测目的基因的蛋白表达 |
| 4.3.4 动物免疫保护试验结果 |
| 4.3.4.1 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-γmRNA表达水平 |
| 4.3.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态变化 |
| 4.3.4.3 IBV IgG抗体在雏鸡外周血液中的动态变化 |
| 4.3.4.4 IBV攻毒试验雏鸡后免疫保护的观察结果 |
| 4.3.4.5 临床保护率的计算结果及IB病毒含量的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计及其构建策略 |
| 4.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态的变化及分析 |
| 4.4.3 雏鸡脾脏中IL-12和IFN-γmRNA表达水平的变化及分析 |
| 4.4.4 雏鸡外周血液抗IBVIgG抗体含量动态变化结果及其分析 |
| 4.4.5 感染率及保护率计算结果的讨论与分析 |
| 4.4.6 不同免疫组免疫保护效果的比较分析 第五章 结论 参考文献 附录 致谢 攻读博士学位期间参与研究的课题 攻读博士学位期间发表的研究论文 |
（6）2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 英文摘要 目录 符号说明 文献综述 |
| 禽传染性支气管炎研究进展 参考文献 第一章 |
| 2009～2011年间国内部分地区IBV分子流行病学研究 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 参考文献 第二章 |
| Mass型H120活疫苗对不同基因型IBV流行毒株的免疫保护效力试验 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 参考文献 第三章 |
| 表达QX型IBV |
| S1蛋白的重组马立克病毒构建与免疫效力试验 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 参考文献 致谢 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（7）禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 英汉缩略词对照表 1 前言 |
| 1.1 传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 IBV生物学分类地位与病毒粒子特征 |
| 1.1.2 IBV基因组结构 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒复制机制 |
| 1.1.4 IBV的结构蛋白与生物学功能 |
| 1.1.5 IBV的非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.1.6 IBV的非编码区与生物学功能 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒分子遗传变异研究进展 |
| 1.2.1 IBV分子遗传变异的机制 |
| 1.2.2 基因突变的引起遗传变异 |
| 1.2.3 基因重组的引起遗传变异 |
| 1.3 研究目的和意义 2 试验材料 |
| 2.1 毒株 |
| 2.2 菌种、载体 |
| 2.3 鸡胚 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 常用试剂配制 |
| 2.6 主要仪器 3 试验方法 |
| 3.1 病毒培养 |
| 3.2 病毒RNA提取 |
| 3.3 Sczy3全基因组内部片段分段扩增 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 RT-PCR扩增 |
| 3.3.3 PCR反应 |
| 3.4 RACE获取基因组末端片段 |
| 3.4.1 RACE引物设计 |
| 3.4.2 3’末端cDNA的扩增(3’RACE) |
| 3.4.3 5’末端cDNA的扩增(5’RACE) |
| 3.5 PCR产物回收和纯化 |
| 3.6 PCR产物克隆 |
| 3.6.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 3.6.2 PCR回收产物与pMD19-T载体连接 |
| 3.6.3 感受态细胞DNA转化 |
| 3.6.4 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 3.6.5 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.7 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析 4 结果 |
| 4.1 基因组内部分段RT-PCR扩增结果 |
| 4.2 基因组末端序列的扩增结果 |
| 4.3 序列测定和拼接 |
| 4.4 Sczy3全基因组结构分析 |
| 4.5 转录调控序列分析 |
| 4.6 全基因组及各基因同源性分析 |
| 4.6.1 5’UTR和3’UTR同源性比对结果 |
| 4.6.2 Gene 1基因组同源性比对结果 |
| 4.6.3 Gene 2基因组同源性比对结果 |
| 4.6.4 Gene 3基因组同源性比对结果 |
| 4.6.5 Gene 4基因组同源性比对结果 |
| 4.6.6 Gene 5基因组同源性比对结果 |
| 4.6.7 Gene 6基因组同源性比对结果 |
| 4.7 系统进化树分析 |
| 4.7.1 全基因系统进化树分析 |
| 4.7.2 S1基因系统进化树分析 |
| 4.7.2 S2基因系统进化树分析 |
| 4.7.3 E基因系统进化树分析 |
| 4.7.4 M基因系统进化树分析 |
| 4.7.5 N基因系统进化树分析 |
| 4.8 重组推测 |
| 4.8.1 RDP3.44重组检测 |
| 4.8.2 Simplot 3.5.1序列相似性分析 |
| 4.8.3 进化树拓扑结构分析 5 讨论 |
| 5.1 全基因组分段扩增 |
| 5.2 生物信息学分析 |
| 5.3 基因重组研究 6 结论 参考文献 致谢 |
（8）传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列测定与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一部分 文章综述 |
| 1 传染性支气管炎流行病学的国内外研究现状 |
| 1.1 传染性支气管炎的国外流行情况 |
| 1.2 传染性支气管炎的国内流行情况 |
| 2 传染性支气管炎病毒的病原生物学研究 |
| 2.1 传染性支气管炎病毒的分类地位 |
| 2.2 IBV的粒子结构 |
| 3 IBV的生物学特性 |
| 3.1 IBV的理化特性 |
| 3.2 血凝性 |
| 4 IBV的临床特征、组织嗜性和病理学特征 |
| 4.1 肾型 |
| 4.2 呼吸型 |
| 4.3 腺胃型 |
| 4.4 肠型 |
| 4.5 变异型 |
| 5 IBV的检测方法 |
| 5.1 病原学诊断 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学诊断技术 |
| 6 IBV的分子生物学 |
| 6.1 IBV基因组结构 |
| 6.2 IBV非编码区与编码蛋白的生物学功能 |
| 6.3 结构蛋白 |
| 第二部分 研究内容 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料及分离的病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 增殖与纯化 |
| 2.3 化病毒RNA的抽提 |
| 2.4 引物设计 |
| 2.5 cDNA第一条链合成的方法 |
| 2.6 PCR扩增体系 |
| 2.7 PCR产物的纯化回收 |
| 2.8 连接 |
| 2.9 感受态制备(CaCl2法) |
| 2.10 转化 |
| 2.11 鉴定 |
| 2.12 序列的测定 |
| 2.13 序列分析 |
| 2.14 参考毒株的IBV基因序列 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 IBV JH06111株分离株致鸡胚病变 |
| 3.2 电泳鉴定结果 |
| 3.3 IBV JH06111株全基因组大小与结构 |
| 3.4 全基因组同源性及系统进化树分析 |
| 3.5 基因重组分析 |
| 3.6 分离株S基因序列的变异情况 |
| 3.7 S蛋白糖基化位点及结构分析 |
| 4 系统进化分析 |
| 4.1 JH06111毒株与参考毒株全基因组的遗传进化树分析 |
| 4.2 JH06111毒株与参考毒株lab序列的遗传进化树分析 |
| 4.3 IBV分离株与参考毒株S基因的遗传进化树分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 基因1 |
| 5.2 基因2 |
| 5.3 基因4和基因6 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）禽传染性支气管炎病毒H120株全基因组序列测定分析（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 1 前言 |
| 1.1 禽传染性支气管炎概述 |
| 1.2 禽传染性支气管炎病毒基因结构 |
| 1.2.1 结构蛋白 |
| 1.2.2 非编码区 |
| 1.2.3 复制-转录酶蛋白 |
| 1.3 全基因组序列测定分析的研究进展 |
| 1.4 IBV重组 |
| 1.5 禽传染性支气管炎病毒H120株研究 2 试验材料 |
| 2.1 毒株 |
| 2.2 菌种、质粒 |
| 2.3 SPF鸡胚 |
| 2.4 试剂 |
| 2.5 主要仪器 3 试验方法 |
| 3.1 病毒培养 |
| 3.2 病毒RNA提取 |
| 3.3 H120全基因组内部片段分段扩增 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 cDNA合成 |
| 3.3.3 PCR反应 |
| 3.3.4 PCR产物回收和纯化 |
| 3.4 PCR产物克隆 |
| 3.4.1 感受态细胞的制备 |
| 3.4.2 PCR产物连接pMD19-T载体 |
| 3.4.3 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.4.4 阳性克隆筛选 |
| 3.4.5 阳性克隆序列测定 |
| 3.5 SMART RACE获取基因组末端片段 |
| 3.5.1 RACE引物设计 |
| 3.5.2 SMART RACE反应 |
| 3.5.3 PCR产物克隆 |
| 3.6 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析 4 结果 |
| 4.1 全基因组分段扩增结果 |
| 4.2 序列测定和拼接 |
| 4.3 基因组结构分析 |
| 4.4 转录调控序列分析 |
| 4.5 序列同源性分析 |
| 4.6 系统进化树分析 |
| 4.7 重组推测 5 讨论 |
| 5.1 全基因组分段扩增 |
| 5.2 生物信息学分析 |
| 5.3 基因重组研究 参考文献 致谢 附录 禽传染性支气管炎病毒H120株基因组全序列 |
（10）四省区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 IBV研究概况 |
| 1.1 IBV流行概况 |
| 1.2 IBV的病原生物学 |
| 1.2.1 IBV的分类地位 |
| 1.2.2 IBV病毒粒子结构 |
| 1.3 IBV的生物学特性 |
| 1.3.1 IBV病毒的理化特性 |
| 1.3.2 生物学特性 |
| 1.3.3 实验室宿主系统 |
| 1.4 IBV的分子生物学 |
| 1.4.1 IBV的基因组结构 |
| 1.4.2 IBV编码的主要结构蛋白及生物学功能 |
| 1.5 IBV的转录与复制 |
| 1.5.1 IBV的转录机制 |
| 1.5.2 IBV的复制 |
| 1.6 IBV的分子变异 |
| 1.6.1 S1基因遗传变异 |
| 1.6.2 N基因遗传变异 |
| 1.7 IBV的血清型及分型 |
| 1.8 IBV的组织嗜性 |
| 1.8.1 呼吸型 |
| 1.8.2 肾型 |
| 1.8.3 肠型 |
| 1.8.4 腺胃型 |
| 1.8.5 变异型 |
| 1.9 IB监控技术研究 |
| 1.9.1 RT-PCR及其产物的RFLP |
| 1.9.2 免疫荧光法(IFA) |
| 1.9.3 寡聚核苷酸序列图谱分析 |
| 1.9.4 核酸探针 |
| 1.10 IBV的疫苗研究进展 |
| 1.10.1 IB弱毒疫苗 |
| 1.10.2 IB灭活疫苗 |
| 1.10.3 IB基因工程疫苗 |
| 1.10.4 IB核酸疫苗 |
| 1.10.5 活病毒载体疫苗 |
| 1.10.6 转基因植物疫苗 |
| 第二章 IBV M基因的克隆与遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料或病毒的收集 |
| 2.1.2 SPF鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.2 病毒的增殖与纯化 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 RT-PCR |
| 2.2.5 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.6 连接 |
| 2.2.7 转化 |
| 2.2.8 感受态制备(CaCl_2法) |
| 2.2.9 鉴定 |
| 2.2.10 序列测定 |
| 2.2.11 序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 IBV分离株致鸡胚病变 |
| 2.3.2 IBV M基因序列的比较分析 |
| 2.3.3 M基因序列的同源性及系统进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 IBV分离株的分离 |
| 2.4.2 IBV的RT-PCR |
| 2.4.3 IBV分离株M基因的变异情况及遗传衍化关系 |
| 第三章 IBV N基因的克隆及遗传进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料方法 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 IBV N基因序列的比较分析 |
| 3.2.2 N基因序列的同源性及系统进化树分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 常用溶液与培养基配方 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、Cloning and Sequencing of S Gene of Novel Variant of Infectious Bronchitis Virus ZJ971 Isolates in China（论文参考文献）
- [1]四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究[D]. 董志华. 广西大学, 2019(01)
- [2]鸡传染性支气管炎病毒强弱毒株全基因组序列测定与分析[D]. 韩绪春. 福建农林大学, 2015(01)
- [3]中国部分Massachusetts型鸡传染性支气管炎病毒的生物学特性[D]. 陈玲凤. 中国农业科学院, 2014(12)
- [4]鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备[D]. 杜威威. 东北农业大学, 2014(01)
- [5]广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究[D]. 李孟. 广西大学, 2013(06)
- [6]2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制[D]. 张小荣. 扬州大学, 2012(07)
- [7]禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析[D]. 赵芳芳. 四川农业大学, 2011(05)
- [8]传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列测定与分析[D]. 宋翥远. 湖南农业大学, 2010(03)
- [9]禽传染性支气管炎病毒H120株全基因组序列测定分析[D]. 王霆. 四川农业大学, 2010(03)
- [10]四省区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因分子流行病学研究[D]. 时莉. 新疆农业大学, 2009(11)
标签：基因组论文; 基因型论文; 鸡传染性支气管炎论文; 基因合成论文; 高通量测序论文;