一、K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序（论文文献综述）
苏雅婷[1]（2019）在《肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究》文中研究说明在益生菌的选育、体内效价评定以及作用机制研究中,建立肠道攻毒模型可以提供一种有效的手段,即采用特定的病原菌,建立其特异性标记和检测方法,用于体内示踪和分布的研究。常规的模型以绿色荧光蛋白标记及特异性检测居多,但存在菌株遗传稳定性差、检测特异性不强等问题,尤其受到体内背景荧光干扰大的影响,测定结果准确性不高。本研究以肠毒性大肠杆菌作为通用病原菌,采用红色荧光蛋白标记的方法,尝试应用不同的分子标记模式,拟构建出荧光表达稳定、特异性更强的荧光标记菌株,为进一步建立病原菌的攻毒模型奠定菌株和方法学基础。具体研究内容和相关结果如下:（1）选择红色荧光蛋白mKate和mCherry作为报告基因,分别连入3种常见表达载体pET-28a、pET-9a和pQE30,得到6种重组质粒并分别转化至感受态细胞TOP10中。在无诱导剂的条件下,成功筛选得到两种重组质粒pQE30-mKate,pQE30-mCherry,其转化菌株菌落呈现明显红色。以这两种重组质粒为基础,进一步分别化转到不同类型的肠毒性大肠杆菌细胞（E.coli K88ab、E.coli K88ac、E.coli K99和E.coli 987P）中,根据菌落颜色筛选阳性克隆,挑选单菌落用于荧光检测以及酶切验证。结果表明,与其他质粒和表达宿主相比,在无诱导剂的条件下,重组质粒pQE30-mCherry能够实现在E.coli K99中高效表达,过表达的mCherry可泄露至胞外,其阳性转化子在平板上呈现鲜亮的红色,在荧光显微镜下能观察到明显红色荧光。经PCR分子鉴定,荧光标记菌株毒性基因未丢失,并且生长特性无明显变化。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9998）,细胞浓度的检测限达到103 CFU/mL。（2）为增强荧光检测的灵敏度,拟通过增加其mCherry的拷贝数的方式来提高菌株的荧光表达量。分别采用mCherry多拷贝表达盒和多拷贝串联体这两种方式,来构建mCherry基因的双拷贝重组菌质粒,并分别转化E.coli K99进行异源表达。结果表明与单拷贝的重组菌E.coli K99-mCherry相比较,双拷贝的重组菌E.coli K99-2×mCherry和E.coli K99-×2mCherry的荧光强度均低于E.coli K99-mCherry,故单拷贝的mCherry基因在E.coli K99中的表达效果是最好的。（3）本试验首先探讨采用表面展示mCherry基因标记肠毒性大肠杆菌的方法,即通过over-lap PCR方法融合Lpp和OmpA作为锚定蛋白,构成重组质粒pQE30-Lpp’OmpA-mCherry,然后转化到宿主菌E.coli K99。通过镜检、分子鉴定、生长特性分析以及荧光蛋白表达稳定性等方式来评价标记菌株。结果表明,重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry菌株毒性基因未丢失,生长特性无明显变化,菌体的生长与其荧光信号同步,而且荧光表达的遗传稳定性较高。在不诱导的情况下,能通过肉眼观察到红色阳性克隆,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。表明本研究实现了外源蛋白mCherry在肠毒性大肠杆菌中的组成型表达。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9997）,得到细胞浓度的检测限为104 CFU/mL。（4）本试验进一步基于CRISPR/Cas9基因编辑技术来实现mCherry在E.coli K99菌株中定点插入标记。以大肠杆菌K12基因序列为参照,选取可插入外源基因的假基因yheO位点。根据所选假基因位点序列设计sgRNA,成功构建pTargetF-sgRNA载体。并以假基因yheO为模板扩增出yheO的左右同源臂,通过设计引物利用重叠延伸PCR将T5启动子、目的基因mCherry、左右同源臂以及线性化片段J23119（Spe I）-sgRNA-gRNA scaffold相连,最后与Kpn I和Sph I双酶切线性化载体pUC57进行连接反应,构建含有外源基因mCherry的基因编辑载体Donor。将测序成功的Donor载体转化至E.coli K99-Cas9感受态中,挑选验证成功的阳性克隆加入诱导剂IPTG,30℃振荡培养过夜,在42℃条件下培养处理16h以去除基因编辑载体。结果表明,mCherry的定点敲入构建的菌株与野生菌株相比,生长特性无明显变化,毒性基因未丢失,菌体的生长与其荧光的表达同步。遗传稳定性显示其荧光表达十分稳定。在初始诱导物诱导的情况下,单菌落呈现出肉眼可见的红色,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。α-乳糖可取代常用诱导物IPTG,且在浓度为5 g/L时,使菌体的荧光表达量达到高值。通过建立基因编辑菌株活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9999）,细胞浓度的检测限达到104 CFU/mL。（5）通过综合比较三种不同方式构建的重组菌株中mCherry表达的遗传稳定性,筛选出一株最适的标记菌株,将其接种到大鼠胃肠道分段样品中进行特异性荧光检测,并以实验室前期构建的GFP标记的E.coli K99作为对照研究。结果表明,每隔24 h连续转接10次的继代实验发现采用CRISPR/Cas9技术构建的标记菌株荧光表达最为稳定;在实际样品检测中,相比于GFP标记的肠毒性大肠杆菌,mCherry标记菌株的荧光强度检测的变异系数显着降低（p=0.0328）,表明荧光蛋白mCherry在大鼠胃肠段中能克服背景荧光干扰,检测更准确。综上所述,本实验以肠毒性大肠杆菌K99作为通用病原菌,构建利用红色荧光蛋白标记的攻毒菌株,此重组菌能稳定表达红色荧光蛋白,排除动物胃肠道自发荧光干扰,为病原菌的特异性标记研究及动物攻毒模型的构建提供了方法学基础。
沙洲[2]（2017）在《大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响》文中研究说明产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC）是导致动物腹泻的主要致病菌之一,该病常发生于幼龄动物,严重威胁畜牧养殖业的健康发展。ETEC可产生一种或几种肠毒素,其产生的耐热肠毒素为主要致病因素。近年来,由于治疗腹泻的药物价格不断提升及主要致病菌中耐药菌株的不断出现,使得通过新型微生态制剂对腹泻进行免疫预防成为当前研究的热点。酵母菌是人和动物重要的益生菌,它含有对机体有益的多种营养物质及生长因子,在增强动物生产性能的同时,促进肠道黏膜的发育并加强免疫功能,改善肠道菌群,且酵母菌是真核生物,其内的各种细胞器和多种酶能够作用于翻译后的蛋白修饰,基于此建立起来的酵母菌表面展示技术能够将基因的多样性通过正确折叠的蛋白准确表达出来。该技术可展示的蛋白种类多、分子数量大,且在筛选、纯化、活性测定等方面操作简便。目前,酵母菌表面展示技术已应用于多个研究领域,应用前景广阔。本研究旨在将大肠杆菌的耐热肠毒素（ST）融合蛋白展示在酿酒酵母菌表面,获得ST酵母基因工程菌,并探究其对大鼠肠道菌群、小肠黏膜结构及黏膜免疫的影响。为研发具有特异性免疫功能的微生态制剂奠定基础。主要研究内容和结果如下:1、应用表面展示技术构建ST酵母基因工程菌。利用Overlap PCR方法,将定点突变后的estA基因与estB基因连接,将融合基因片段连接至表面展示质粒pYD1中,构建表面展示质粒pYD1-estA-estB,将其电击转化至EBY100酿酒酵母菌中,筛选获得ST酵母基因工程菌,通过免疫荧光检测,证明ST融合蛋白成功展示在酿酒酵母菌表面。2、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响。选取4-6周龄的SPF级SD大鼠90只,雌雄各半。随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,对各组分别灌服生理盐水、107 cfu/mL工程菌菌液、107 cfu/mL酿酒酵母菌菌液2mL/只,每日一次,持续灌服21天,再连续3天对每组大鼠灌服108 cfu/mL的大肠杆菌H10407菌液5mL/只,在灌服的第7、14、21天及攻毒3天后取所需的粪便样本,利用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,研究酵母基因工程菌对肠道菌群OTU（微生物可操作单元）和肠道内5种标志性细菌:类杆菌（Bacteroides）、梭菌（Clostridium）、肠球菌（Enterococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillus）数量的影响,并测量肠道pH值。结果显示在灌服期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值、各细菌数量均不同程度的高于空白对照组,pH值均明显低于空白对照组。攻毒后,工程菌组的OTU值、类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量极显着高于其他两组（P<0.01）,工程菌组的pH值与灌服前无显着差异（P>0.05）。结果表明ST酵母基因工程菌能丰富肠道菌群多态性,增加肠道内重要细菌数量,降低肠道酸碱度。当攻毒后,工程菌能有效降低ETEC对肠道菌群及重要细菌的影响,维持肠道pH值稳定。3、ST酵母基因工程菌对大鼠小肠绒毛结构的影响。采集大鼠的十二指肠、空肠、回肠组织制作切片,测量并统计分析各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度（V/C）的变化。结果表明,与空白对照组相比,工程菌组及酵母菌组的各段肠绒毛长度及V/C值有明显升高。灌胃大肠杆菌后,与工程菌组相比,空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V/C值均不同程度降低;空肠隐窝深度极显着升高（P<0.01）;回肠V/C值极显着下降（P<0.01）。由此表明工程菌促进小肠绒毛的发育,加强肠道黏膜的吸收功能,有效抵御ETEC对小肠绒毛结构的损伤。4、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道黏膜免疫的影响。利用ELISA、Real-time PCR技术研究肠道黏膜中的分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）及血清中免疫球蛋白G（IgG）含量变化,并对大鼠血清学指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血糖（GLU）、胆固醇（CHO）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）含量进行测定。由检测结果得出在前21天灌胃期间,工程菌组与酵母菌组sIgA、细胞因子水平均高于空白对照组,血清学指标无明显差异,工程菌组血清中IgG效价在第21天达到1:320。在攻毒ETEC后,工程菌组各项数据变化幅度最小,表明ST酵母基因工程菌能提高动物肠道黏膜免疫力,促进细胞因子的分泌,刺激机体产生免疫反应,对动物机体安全、无毒,且能降低ETEC对黏膜免疫力影响。综上所述,本研究成功构建展示大肠杆菌ST的酿酒酵母基因工程菌,试验结果证明,该工程菌不仅具有良好的益生作用,提高肠道黏膜免疫力,而且能有效预防及保护由ETEC引起的动物肠道菌群失调及小肠黏膜结构损伤。
杜元策[3]（2014）在《重组大肠杆菌肠毒素蛋白LTA192-STa13的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究》文中研究说明犊牛大肠杆菌性腹泻是由产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC）引起的1月龄内犊牛以消化紊乱、腹泻脱水、自体中毒和心力衰竭为主要病症的细菌性传染病,是引起新生犊牛生长发育不良,甚至死亡主要原因之一。ETEC主要毒力因子包括菌毛和肠毒素,菌毛有助于细菌在小肠黏膜定植,然后细菌产生肠毒素致病。由于大肠杆菌耐药菌株的不断出现,药物治疗的效果越来越差,因此研制有效预防犊牛大肠杆菌性腹泻的疫苗对预防该病的发生具有重要的实际意义。肠毒素包括耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin,ST）和不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT）,是引起犊牛腹泻的直接致病因子。本研究旨在将eltA和estA定点突变后融合,获得减毒的重组大肠杆菌肠毒素蛋白,并以此为免疫原研究其诱导小鼠体液免疫的能力,为研制犊牛大肠杆菌腹泻疫苗提供科学的实验数据。重组大肠杆菌肠毒素蛋白的表达。PCR扩增eltA和estA基因,分别将LTA第192位氨基酸Arg （AGA）突变为Gly（GGA）,将STa的第13位氨基酸Gly（GGC）突变为Gln（CAG）;通过柔性linker连接,构建融合基因eltA-stA并插入到pMD-18T Simple载体中,经序列分析鉴定后,将融合基因eltA-stA插入到表达载体pHUE中,转化宿主菌Rosetta,构建重组大肠杆菌Rosetta/pHUE-eltA-stA。SDS-PAGE分析结果显示,表达的重组蛋白LTA192-STa13分子量约为36Ku,以包涵体的形式表达,重组蛋白表达量约占全菌体蛋白的16.8%。Western blot鉴定结果证明,表达的重组蛋白LTA192-STa13分别与His单抗和STa单抗发生特异性反应。重组蛋白诱导小鼠体液免疫研究。将6周龄昆明鼠随机分为3组（A组、B组和C组）,每组包括正常鼠和妊娠鼠各5只。A、B和C组分别免疫重组蛋白LTA192-STa13、经诱导的重组大肠杆菌Rosetta/pHUE-eltA-stA灭活菌液、生理盐水,经腹腔注射,免疫3次,间隔14d。定期采集各组正常鼠、母鼠及仔鼠血液检测抗体。间接ELISA检测结果显示,A组和B组正常鼠均能产生高效价抗LTA和STa抗体,A组小鼠三免后14d抗LTA抗体效价达到1：68200,抗STa抗体效价达到1：8960；B组三免后14d抗LTA抗体效价达到1：14900,抗STa抗体效价达到1：3840。A组妊娠母鼠产后7d抗LTA抗体效价达到1：40228,抗STa抗体效价达到1：8530；B组妊娠母鼠产后7d后抗LTA抗体效价达到1：18285,抗STa抗体效价达到1：3840,母鼠所产生的特异性抗体可通过乳汁传递给新生仔鼠。仔鼠出生30d后,A组仔鼠抗LTA抗体效价达到1：3800,抗STa抗体效价达到1：850；B组仔鼠抗LTA抗体效价达到1：1060,抗STa抗体效价达到1：330。A组小鼠和仔鼠两种抗体效价均明显高于B组小鼠和仔鼠两种抗体效价。三免后14d,各组正常鼠腹腔注射10LD50ETEC （LT+）,结果显示,A、B两组正常鼠均可得到保护,其中重组蛋白LTA192-STa13免疫组正常鼠全部健活,对照组全部死亡。乳鼠灌胃实验结果显示,重组蛋白组和灭活菌液组小鼠血清均可中和STa毒素,小鼠健活,无肠积液的产生,对照组仔鼠全部死亡。用三免后各组获得的小鼠血清进行LT体外中和实验,结果显示A组和B组小鼠血清均可中和LT毒素对Y-1细胞毒性作用,其中蛋白免疫组血清中和效价较高,达1：89.13,灭活菌液免疫组血清中和效价为1：22.59。本研究证明,所表达的重组蛋白LTA192-STa13对小鼠具有良好的免疫原性,可诱导免疫鼠产生良好的体液免疫应答,可作为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗的候选抗原。
刘淑杰[4]（2010）在《大肠杆菌粘附素亚基FaeG在Lactococcus lactis中的表达及免疫原性研究》文中研究指明携带有K88菌毛粘附素的产肠毒素大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起仔猪腹泻的主要流行致病菌株之一,FaeG是K88（F4）菌毛粘附素的主要蛋白亚基,具有粘附特性和良好的免疫原性,被认为是具有前景的疫苗抗原。L. lactis是公认的安全级微生物,具有佐剂性质,是诱导机体产生黏膜免疫的理想候选载体菌株。本研究采用L. lactis表达FaeG,期望口服免疫后,诱导仔猪产生特异性抗体,而达到抗仔猪腹泻的目的。表达FaeG的重组L. lactis构建：以ETEC C83907菌株质粒DNA为模板,通过PCR扩增FaeG基因,将其定向克隆到L. lactis细胞内表达载体pNZ8148和分泌表达载体pNZ8112中,转化宿主菌L. lactis NZ9000,构建了L. lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）和L.lactisNZ9000 （pNZ8112-faeG）,经Nisin诱导后两个重组菌均表达FaeG,但L. lactis NZ9000 （pNZ8112-faeG）培养物上清液中未检测到目的蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白分子量大小约为27.0 kD,重组FaeG表达量分别约占菌体可溶性蛋白的10%和13%。Western blot分析显示重组FaeG具有良好的反应原性。小鼠动物模型检测重组L. lactis表达FaeG的免疫原性：试验选取6周龄、雌性BALB/c小鼠112只,随机分成14组。分别通过皮下注射和口服途径免疫小鼠重组L. lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）和L. lactis NZ9000 （pNZ8112-faeG）。结果显示,皮下免疫重组L. lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）,诱导小鼠血清中产生特异性IgG,抗体滴度达11.32（10g2）；脾中产生IgG抗体分泌细胞（ASC）（817/107MC）,表明皮下免疫重组菌诱导小鼠产生系统免疫反应。口服免疫小鼠L. lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）,诱导小鼠血清中产生特异性IgG,抗体滴度达9.65（10g2）,粪中产生特异性IgA,抗体滴度达6.32（10g2）；小鼠派伊尔结、脾和肠系膜淋巴结产生特异性IgA和IgG的ASC,表明口服免疫重组L. lactis诱导小鼠产生黏膜免疫反应和系统免疫反应。同时试验显示,提高重组L. lactis口服剂量及添加粘膜佐剂CTB可能是改善免疫反应的重要因素。通过口服和皮下途径免疫小鼠L. lactis NZ9000 （pNZ8112-faeG）诱导小鼠产生与L. lactis NZ9000（pNZ8148-faeG）相似的免疫反应。仔猪注射接种重组L. lactis,研究FaeG的免疫原性：试验选取6周龄仔猪28头,随机分成4组,皮下注射接种仔猪L. lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）,结果显示,仔猪血清中产生特异性IgA、IgM和IgG,在初免后21、28、35和42 d,IgG抗体水平极显着高于载体对照组（P<0.01）；在初免后21和28 d,IgA抗体水平显着高于载体对照组（P<0.05）。重组L.lactis诱导仔猪空肠和回肠黏膜组织中产生了特异性IgA和IgM,抗体水平均高于对照组,但差异不显着（P>0.05）。免疫组化法检测组织中ASC,结果显示仔猪脾脏、十二指肠、空肠、回肠和肠系膜淋巴结中产生IgG、IgM和IgA ASC。说明注射免疫重组L. lactis,诱导仔猪产生系统免疫反应和一定水平的黏膜免疫反应。仔猪口服免疫重组L. lactis,研究FaeG的免疫原性：试验选择6周龄仔猪33头,随机分成5组,口服免疫仔猪L.lactis NZ9000 （pNZ8148-faeG）,结果显示：仔猪血清中产生特异性IgG、IgM和IgA,在初免后28 dppi, IgG抗体水平极显着高于载体对照组（P<0.01）,IgA抗体水平显着高于载体对照组（P<0.05）；另外,仔猪空肠黏膜组织中IgA抗体水平显着高于载体对照组（P<0.05）。免疫组化法检测脾脏和黏膜组织中ASC,显示仔猪脾脏、十二指肠中产生IgG和IgM ASC,而空肠、回肠和肠系膜淋巴结中产生了IgA、IgG和IgM ASC;空肠中IgM抗体IOD值显着高于载体对照组（P<0.05）,表明口服免疫重组菌诱导仔猪产生黏膜免疫反应和系统免疫反应。本研究提出致仔猪大肠杆菌性腹泻ETEC黏附素FaeG在L. lactis中重组的创新思路,成功构建细胞内表达和分泌表达FaeG的重组L. lactis,小鼠和仔猪免疫试验表明了重组FaeG具有良好的免疫原性。首次采用仔猪作为试验动物评价重组L. lactis免疫效果,为以L. lactis作为抗原递送载体,预防大肠杆菌性腹泻的基因工程制剂的研究奠定了基础,为生猪健康养殖展示了新的技术途径。
逄媛[5]（2008）在《猪源产肠毒素性大肠杆菌K88、K99，987P、F41双基因串联表达的研究》文中研究指明产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原菌,黏附素在ETEC的致病过程中起着重要作用。从动物ETEC中发现的粘附素抗原有K88、K99、987P、F41、F42、F165、F17和F18等。而猪源粘附素抗原则以K88、K99、987P、F41最为常见。本研究实现了上述四种常见黏附素抗原的克隆表达,并在此基础上对K88-K99、987P-F41进行了串联表达。对表达蛋白进行了western-blot鉴定及反向间接血凝试验,结果表明所表达的融合蛋白具有良好的反应原性和免疫活性。为基因工程二价苗及多价苗的研制奠定了基础。研究内容如下:1.利用PCR技术,以大肠杆菌C83907、C83644、C83710的质粒和C83707的基因组DNA为模板分别扩增不含信号肽的K88、K99、987P和F41基因。将其分别克隆到pMD18-t载体上,酶切鉴定成功构建重组质粒pMD18-K88、pMD18-K99、pMD18-987P、pMD18-F41。将其与pET30a载体分别经双酶切,将回收的基因小片段与载体大片段连接,得到的四种重组质粒。经酶切及PCR鉴定,并进行核苷酸序列分析,阳性质粒命名为pETK88、pETK99、pET987P、pETF41。将此四种重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,目的基因得到高效表达。2.在成功克隆K99基因的基础上,通过引物设计软件设计一对引物使扩增出的K88基因不含终止密码子。利用DNA重组技术将此K88基因亚克隆于pET30a表达载体中,得到阳性重组质粒命名为pETK88-2。进一步将K99基因融合到K88-2基因的下游,构建K88-K99串联基因,并实现其在大肠杆菌BL21中的高效表达。同时,对于F41-987P双基因串联表达,基本实验方法同K88-K99。区别在于,首先PCR扩增不含终止密码子的987P基因,将其克隆于pMD 18-T载体中,构建重组质粒,命名为pMD 18-987P-2。将987P-2基因插入到pETF41重组质粒的F41基因的上游。构建987P-F41串联基因,并实现其在大肠杆菌中的表达。3. Western-blotting检测,结果表明,K88-K99、F41-987P串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99、987P标准血清及F41抗血清识别。具有良好的反应原性。反向间接血凝实验结果表明,K88效价为28～210 ,K99效价为27～28,F41效价为26～28 ,987P效价为28～210,该串联表达蛋白具有良好的抗原性。表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。
姜文亿[6]（2008）在《重组ETEC K99蛋白和K88ac-STII融合蛋白的免疫原性研究》文中研究说明产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxin Escherichia coli,ETEC）是引起幼畜腹泻的主要病原之一,给畜牧业生产尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明, K88ac、K99菌毛和ST肠毒素是产肠毒素性大肠杆菌主要的致病因子,它们在幼畜腹泻疫苗研制中具有重要的作用。根据公布的产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxin Escherichia coli,ETEC）的K99菌毛抗原的核苷酸序列（序列号:M35282）。设计特异性引物,通过PCR扩增得到K99菌毛抗原成熟肽基因,回收纯化后将K99基因连于克隆载体pBS-T上,通过PCR、酶切鉴定、测序,证明其中含有K99基因片段,命名为pBS-K99。将鉴定结果正确的重组质粒和原核表达载体质粒pET-28a用XhoI/NcoI分别双酶切,通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中,转化入BL21（DE3）大肠杆菌中,经IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting检测所表达的蛋白。本研究在构建重组菌株BL21（DE3）（pET-28a-K99）和BL21（DE3）（pET28a-K88ac-STⅡ）的基础之上进一步作下述研究:采用IPTG诱导法分别对重组菌株BL21（DE3）（pET28a-K88ac-STⅡ）和BL21（DE3）（pET-28a-K99）进行诱导培养。SDS-PAGE凝胶电泳分析,重组菌株分别在约30KDa和18KDa处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致。在表达蛋白鉴定的基础之上,通过透析的方法对目标蛋白进行初步纯化回收。重复跑SDS-PAGE凝胶,切取目标蛋白条带将其装入特定孔径大小的透析袋中继续水平电泳,使得目标蛋白从凝胶中跑出,透析过夜后用PEG 6000调整定量蛋白的浓度约为3mg/mL,加入弗氏不完全佐剂作为重组蛋白疫苗。分别以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,优化检测免疫抗体水平的间接ELISA条件,通过比较三个免疫组的抗体水平来评价表达蛋白作为免疫抗原的有效性。经IPTG诱导重组菌株BL21（DE3）（pET-28a-K99）进行蛋白表达,经SDS-PAGE分析,结果表明:所表达的蛋白表达产物分子量大小为18KDa,且表达量较高,表达蛋白经Western blotting检测表明:表达的K99蛋白能和ETEC（C83912）免疫的兔血清发生特异性结合,证明其具有反应原性。以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,结果表明:重组蛋白免疫组、商品疫苗免疫组与PBS对照组抗体水平差异极显着（P<0.01）,重组蛋白免疫组和商品疫苗免疫组抗体水平差异不显着（P > 0.05）。
胡建军[7]（2008）在《K88菌毛细胞表面呈现载体的初步研究》文中研究说明肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic E .coli,简称ETEC）是引起婴幼儿和新生仔猪腹泻的主要病原之一。其致病性决定于它在宿主小肠上皮细胞上的定居能力和产肠毒素的能力。ETEC定居宿主小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的菌毛介导。细胞表面呈现技术是近来年在针对菌毛的疫苗研究中发展起来的一种新方法。将编码菌毛的基因在非毒素源性大肠杆菌中表达并使菌毛在细胞表面组装成菌毛,菌毛以完整形式在细胞表面出现,而且菌毛抗原蛋白以多聚体的形式存在,将增强菌毛抗原的免疫原性。而且可在细胞表面获得含有外源抗原表位的杂合菌毛,即所谓的细胞表面呈现,这是一种构建多价活疫苗的理想途径。本实验以Long and Accurate PCR技术扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC-faeH并克隆到pBR322质粒载体中,设计合成一段含ApaI和NcoI酶切位点的DNA序列,与SacI和BssHII酶切后的包含结构基因faeC-faeH的质粒连接;设计合成耐热肠毒素STII表位编码序列和口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP1的201-200AA的线性表位编码序列,与ApaI和NcoI酶切后的载体连接,构建融合基因。用特异性引物PCR扩增fae操纵子的调控基因faeA和faeB及faeB上游的启动子区域,并对所得序列进行序列分析和生物信息学分析。PCR扩增STI-STII融合基因,选择正向连接的克隆T-STI-STII,XhoI酶切后补平,与XhoI、SalI酶切后的T-LTB的小片段连接,构建T-STI-STII-LTB质粒;BamHI、SacI双酶切T-STI-STII-LTB后与pET28a连接,构建原核表达载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）后表达,SDS-PAGE确定最佳诱导时间和最佳IPTG浓度。实验PCR获得了K88菌毛操纵子的结构基因faeC-faeH并克隆到pBR322质粒载体中得到重组质粒pBR-fae1,在pBR-fae1中引入了ApaI和NcoI酶切位点得到了质粒pBR-fae2;在pBR-fae2的ApaI和NcoI处融合STII表位和FMDV VP1表位,成功构建了pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1质粒。克隆了fae操纵子的负调控基因faeA。对K88ab、K88ac两个血清型的faeA序列分析结果显示,两个血清型之间不存在差异;生物信息学分析结果显示,faeA基因表达产物FaeA与其他大肠杆菌菌毛操纵子的负调控蛋白序列比较发现,FaeA与其他FaeA样负调控蛋白同时存在一个7个氨基酸的保守区。实验还得到了正调控基因faeB及其启动子区域和上游调控序列;对其序列分析后显示,在faeB基因上游的序列中包含启动子的特征序列-35区和-10区,同时存在与菌毛表达调控相关的三个GATC甲基化位点。将大肠杆菌耐热性肠毒素ST和不耐热性肠毒素LT的B亚单基因融合,构建了原核表达载体pET28a-STI-STII-LTB,转化大肠杆BL21（DE3）后诱导表达。加入IPTG至终浓度为0.8mM诱导,诱导表达后的菌体蛋白行SDS-PAGE,电泳结果显示融合基因得到高效表达并且当诱导时间为4h时表达量达到最高。pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1质粒载体的构建和两个调控基因的获得为在非毒素源性大肠杆菌菌毛上呈现外源表位奠定了基础。表达的STI-STII-LTB蛋白为获得具有强免疫原性的ST蛋白用以后续的实验中制备ST的抗体检测呈现的STII表位,提供了必要的准备。
杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,王远志,李有文,刘君[8]（2008）在《大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达》文中进行了进一步梳理本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（△cya）、环腺苷酸受体蛋白基因（△crp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（△asd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。
武军元,陈创夫,王远志[9]（2007）在《大肠杆菌表达的融合蛋白K88ac-STⅡ的免疫效果》文中提出
杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,任艳[10]（2007）在《携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定》文中提出为构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,采用缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（Δasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,通过2次转化引入宿主菌,成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌株S.typhimuriumX4550（pYA3334K88ac-STII）,为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。
二、K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序（论文提纲范文）
（1）肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病机制 |
| 1.2.1 黏附素 |
| 1.2.2 肠毒素 |
| 1.3 ETEC的防治措施 |
| 1.4 荧光标记技术 |
| 1.4.1 荧光蛋白的结构和性质 |
| 1.4.2 荧光蛋白的标记方式 |
| 1.4.3 荧光蛋白的应用 |
| 1.5 攻毒模型的研究现状 |
| 1.6 研究意义及内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究技术路线 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 RFP表达载体的构建及ETEC表达宿主的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 基于RFP基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 RFP质粒转化宿主ETEC及阳性克隆的筛选 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 红色荧光蛋白mKate和 mCherry的 PCR扩增结果 |
| 2.4.2 重组质粒菌落PCR鉴定 |
| 2.4.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.4.4 重组质粒在工程菌及ETEC中的表达 |
| 2.4.5 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry的 PCR验证 |
| 2.4.6 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光显微镜观察 |
| 2.4.7 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光强度的测定 |
| 2.4.8 重组菌E.coli K99-mCherry的分子鉴定 |
| 2.4.9 重组菌E.coli K99-mCherry和菌株E.coli K99 生长曲线比较 |
| 2.4.10 重组菌E.coli K99-mCherry中 mCherry基因表达稳定性测定 |
| 2.4.11 荧光体系下E.coli K99-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 基因剂量对RFP标记ETEC的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌株和载体 |
| 3.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 多拷贝红色荧光蛋白mCherry重组质粒的构建 |
| 3.3.2 多拷贝重组质粒的转化E.coli K99 及荧光强度的测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 双拷贝重组质粒酶切鉴定 |
| 3.4.2 多拷贝菌株的荧光强度测定与比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 基于表面展示系统的ETEC-RFP特异性标记 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 菌株和载体 |
| 4.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 大肠杆菌表面展示表达载体的构建 |
| 4.3.2 E.coli K99 表面展示融合蛋白Lpp’OmpA-mCherry |
| 4.4 结果和分析 |
| 4.4.1 PCR扩增结果 |
| 4.4.2 重组质粒pLpp’OmpA双酶切鉴定 |
| 4.4.3 重组质粒pLpp’OmpA-mCherry双酶切鉴定 |
| 4.4.4 重组菌的双酶切鉴定 |
| 4.4.5 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry的分子鉴定 |
| 4.4.6 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry荧光显微镜观察 |
| 4.4.7 E.coli K99 表面展示mCherry的生物活性检测 |
| 4.4.8 E.coli K99 表面展示mCherry的表达稳定性检测 |
| 4.4.9 荧光体系下E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 系统介导的ETEC-RFP特异性标记 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 菌株和载体 |
| 5.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 5.2.3 仪器与设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 质粒DNA的制备 |
| 5.3.2 大肠杆菌K12和K99 的基因组DNA的制备 |
| 5.3.3 大肠杆菌K99和DH5α感受态细胞的制备 |
| 5.3.4 基因敲入位点的选择 |
| 5.3.5 sgRNA的设计及基因编辑载体的构建 |
| 5.3.6 基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除 |
| 5.3.7 基因编辑菌株的荧光检测 |
| 5.3.8 基因编辑菌株分子背景鉴定 |
| 5.3.9 诱导剂对基因编辑菌株红色荧光蛋白表达的影响 |
| 5.3.10 基因编辑菌株生长特性曲线测定 |
| 5.3.11 基因编辑菌株稳定性的测定 |
| 5.3.12 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度标准曲线的建立 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 假基因位点的选择和验证 |
| 5.4.2 mCherry基因编辑菌株的构建及鉴定 |
| 5.4.3 基因编辑质粒的去除 |
| 5.4.4 基因编辑菌株荧光显微镜观察 |
| 5.4.5 基因编辑菌株的分子鉴定 |
| 5.4.6 不同诱导剂及其浓度对荧光蛋白表达量的影响 |
| 5.4.7 基因编辑菌株的生物活性检测 |
| 5.4.8 基因编辑菌株中mCherry的表达稳定性检测 |
| 5.4.9 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 ETEC-RFP标记菌株的综合评价及其在大鼠胃肠道样品中特异性荧光检测 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 菌株和试剂 |
| 6.2.2 实验动物 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 不同标记方法中mCherry基因表达稳定性的比较 |
| 6.3.2 胃肠道内容物样品处理方法 |
| 6.3.3 胃肠道内容物的荧光特异性检测 |
| 6.3.4 统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 标记菌株mCherry基因表达稳定性的比较 |
| 6.4.2 大鼠不同胃肠段内容物对荧光检测的干扰 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录B 基因编辑的序列 |
| 致谢 |
（2）大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 产肠毒素大肠杆菌的研究进展 |
| 第二章 微生态制剂的概述 |
| 第三章 酵母菌表面展示技术的概述 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 应用表面展示技术构建ST酵母基因工程菌 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 ST酵母基因工程菌对肠道菌群的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ST酵母基因工程菌对肠绒毛结构的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ST酵母基因工程菌对肠道黏膜免疫的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）重组大肠杆菌肠毒素蛋白LTA192-STa13的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犊牛腹泻概述 |
| 1.1.1 细菌性腹泻 |
| 1.1.2 病毒性腹泻 |
| 1.1.3 寄生虫性腹泻 |
| 1.2 产肠毒素性大肠杆菌 |
| 1.2.1 主要毒力因子 |
| 1.3 ETEC疫苗研究现状 |
| 1.3.1 全菌疫苗 |
| 1.3.2 黏附素类疫苗 |
| 1.3.3 肠毒素类疫苗 |
| 1.3.4 基因工程疫苗 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 PCR扩增引物的设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 elt 融合基因的构建 |
| 2.2.2 eltA-stA融合基因的制备 |
| 2.2.3 重组蛋白LTA_(192)-STa_(13)表达、鉴定 |
| 2.2.4 实验动物分组及免疫 |
| 2.2.5 免疫抗体检测 |
| 2.2.6 体内中和试验 |
| 2.2.7 体外中和试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 elt融合基因的构建 |
| 3.1.1 elt基因的扩增 |
| 3.1.2 elt 上、下游部分基因的扩增 |
| 3.1.3 elt 融合基因的扩增 |
| 3.1.4 elt 突变基因序列的测定 |
| 3.2 eltA-stA融合基因的制备 |
| 3.2.1 eltA基因的扩增 |
| 3.2.2 elinker-stA基因的扩增 |
| 3.2.3 eltA-stA融合基因的扩增 |
| 3.2.4 eltA-stA融合基因序列的测定 |
| 3.3 重组蛋白LTA_(192)-STa_(13)的表达与鉴定 |
| 3.3.1 重组E.coli Rosetta/pHUE-eltA-stA的鉴定 |
| 3.3.2 重组蛋白LTA_(192)-STa_(13)的表达与鉴定 |
| 3.3.3 重组菌诱导表达条件的优化 |
| 3.4 免疫原的制备 |
| 3.5 免疫抗体的检测 |
| 3.6 体内中和试验 |
| 3.6.1 乳鼠灌胃中和实验 |
| 3.6.2 LT对小鼠的LD_(50)的测定 |
| 3.6.3 LT的小鼠体内中试验 |
| 3.7 体外中和试验 |
| 3.7.1 LT对Y-1细胞的毒性作用 |
| 3.7.2 LT对Y-1 CD_(50)测定 |
| 3.7.3 LT的中和效价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫原的选择 |
| 4.2 提高STa免疫原性的策略 |
| 4.3 融合PCR技术 |
| 4.4 不同免疫原的免疫效力评价 |
| 4.5 初乳对新生犊牛的重要性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）大肠杆菌粘附素亚基FaeG在Lactococcus lactis中的表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 养猪生产背景 |
| 1.2 产肠毒素大肠杆菌黏附素 |
| 1.2.1 产肠毒素大肠杆菌的概况 |
| 1.2.2 ETEC的致病机制 |
| 1.2.3 肠毒素(enterotoxin) |
| 1.2.4 菌毛粘附素 |
| 1.2.5 F4 ETEC的受体 |
| 1.2.6 F4 ETEC致腹泻的免疫预防 |
| 1.3 乳酸乳球菌的概况 |
| 1.3.1 L.lactis表达外源蛋白的优势 |
| 1.3.2 L.lactis表达异源蛋白的调控系统 |
| 1.3.3 L.lactis表达外源抗原诱导免疫反应研究 |
| 1.4 本研究目的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 ETEC K88粘附素蛋白亚基FaeG在L.lactis中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 常用缓冲液及培养基配制 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 Fae G基因的克隆与测序 |
| 2.2.6 L.lactis表达载体的构建 |
| 2.2.7 重组FaeG的表达 |
| 2.2.8 Western blot检测重组蛋白 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 fae G基因片段的克隆与测序 |
| 2.3.2 FaeG表达载体的构建 |
| 2.3.3 重组FaeG的表达 |
| 2.3.4 Western blot检测重组蛋白 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达FaeG重组L.lactis免疫小鼠的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 常用缓冲液及培养基配制 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 F4菌毛提取 |
| 3.2.6 重组L.lactis免疫抗原的制备 |
| 3.2.7 实验动物分组与免疫 |
| 3.2.8 样品的采集与处理 |
| 3.2.9 小鼠血清及粪样中抗体水平的检测 |
| 3.2.10 Elispot检测组织中抗F4菌毛特异性抗体分泌细胞 |
| 3.2.11 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 L.lactis NZ9000(pNZ8148-faeG)免疫小鼠血清和粪中特异性抗体的测定 |
| 3.3.2 L.lactis NZ9000(pNZ8148-faeG)免疫小鼠组织中特异性抗体分泌细胞的测定 |
| 3.3.3 L.lactis NZ9000(pNZ8112-faeG)免疫小鼠特异性抗体的测定 |
| 3.3.4 L.lactis NZ9000(pNZ8112-faeG)免疫小鼠组织中特异性抗体分泌细胞的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组L.lactis注射接种仔猪诱导免疫反应的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要试剂及其配制 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 F4菌毛的提取 |
| 4.2.5 免疫抗原的制备 |
| 4.2.6 试验动物选择、分组与免疫 |
| 4.2.7 样品采集与处理 |
| 4.2.8 血清、粪样及肠黏膜组织浸提物中抗F4菌毛特异性抗体检测 |
| 4.2.9 免疫组化法检测组织中抗体分泌细胞 |
| 4.2.10 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肌肉注射免疫重组L.lactis对仔猪体重的影响 |
| 4.3.2 仔猪血清中抗F4菌毛特异性抗体水平检测 |
| 4.3.3 仔猪肠道粘膜组织中抗F4菌毛特异性抗体水平检测 |
| 4.3.4 组织中抗体分泌细胞和抗体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组L.lactis口服免疫断奶仔猪诱导免疫反应研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 主要试剂及其配制 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 免疫抗原的准备 |
| 5.2.5 试验动物选择、分组与免疫 |
| 5.2.6 样品采集与处理 |
| 5.2.7 血清、粪样及肠黏膜组织浸提物中抗F4菌毛特异性抗体检测 |
| 5.2.8 免疫组化方法检测仔猪组织中抗体分泌细胞 |
| 5.2.9 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 口服免疫重组L.lactis对仔猪体重的影响 |
| 5.3.2 仔猪血清中抗F4菌毛特异性抗体水平检测 |
| 5.3.3 仔猪粪便浸提物中抗F4菌毛特异性抗体水平检测 |
| 5.3.4 仔猪肠道粘膜组织中抗F4菌毛特异性抗体水平检测 |
| 5.3.5 仔猪脾脏及肠道黏膜组织中抗体分泌细胞和抗体的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 论文主要结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录:溶液配制 |
（5）猪源产肠毒素性大肠杆菌K88、K99，987P、F41双基因串联表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第二部分 研究内容 |
| 实验一 产肠毒素性大肠杆菌黏附素基因 K88、K99、 987P、F41 的克隆与初步表达 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 实验二 产肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原K88-K99、F41-987P双基因串联表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 实验三 重组串联菌株的免疫学检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况及个人简介 |
（6）重组ETEC K99蛋白和K88ac-STII融合蛋白的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述:ETEC 的生物学特征及防治研究进展 |
| 1 ETEC 的细菌学特征 |
| 2 ETEC 的流行病学特征 |
| 2.1 传染源及传染途径 |
| 2.2 流行特征 |
| 3 ETEC 的毒力因子 |
| 3.1 菌毛 |
| 3.2 肠毒素 |
| 4 ETEC 的防治 |
| 4.1 抗生素治疗 |
| 4.2 微生态制剂治疗 |
| 4.3 疫苗预防 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 K99 菌毛抗原成熟肽基因的克隆与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 K99 抗原成熟肽PCR 扩增结果 |
| 2.2 K99 抗原成熟肽基因的克隆和鉴定 |
| 2.3 K99 抗原成熟肽的亚克隆和鉴定 |
| 2.4 K99 抗原成熟肽基因表达及初步纯化结果 |
| 2.5 Western blotting 结果 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 K99 蛋白、K88AC-STⅡ融合蛋白的免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组菌株表达蛋白的SDS-PAGE 分析 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 间接ELISA 方法的建立 |
| 2.4 免疫各组仔猪抗体水平的检测 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 5 主要结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 相关试剂配制 |
| 附录二 K99 抗原成熟肽基因的原核表达载体构建路线图 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）K88菌毛细胞表面呈现载体的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述大肠杆菌 K88 菌毛及细胞表面呈现技术研究进展 |
| 1 产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的研究进展 |
| 1.1 ETEC 的致病机理 |
| 1.2 产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白亚基的合成及菌毛结构的装配 |
| 1.3 肠毒素大肠杆菌 K88 菌毛疫苗的研究进展 |
| 2 细胞表面呈现技术 |
| 2.1 构建细胞表面呈现载体的一般原则 |
| 2.2 细胞表面呈现体系的种类 |
| 2.3 细胞表面呈现技术的应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 K88菌毛基因的克隆及外源表位序列的融合 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 FaeG 和STII 蛋白的预测分析 |
| 1.3 菌毛结构基因的克隆 |
| 1.4 外源表位编码序列在菌毛基因上的融合 |
| 2. 结果 |
| 2.1 K88 菌毛抗原蛋白 FaeG 的预测分析及插入位点的确定 |
| 2.2 STII 成熟肽中被呈现表位的确定 |
| 2.3 K88 菌毛操纵子结构基因的扩增 |
| 2.4 目的片段的克隆 |
| 2.5 菌毛抗原基因的改造 |
| 2.6 耐热肠度素 STII 表位序列在菌毛抗原基因上的融合 |
| 2.7 FMDV 外壳蛋白 VP1 表位序列在菌毛抗原基因上的融合 |
| 3 讨论 |
| 3.1 扩增 K88 菌毛结构基因的选择 |
| 3.2 K88 菌毛上外源 DNA 片段插入位点的选择 |
| 3.3 外源表位的选择 |
| 3.4 菌毛未成功装配的原因分析 |
| 参考文献 |
| 实验二 K88 菌毛表达调控基因的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 faeA 基因的克隆 |
| 1.3 faeB 基因的克隆及结构基因启动子区的获得 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 faeA 基因的克隆 |
| 2.2 faeA 基因的序列分析 |
| 2.3 faeA 基因的生物信息学分析 |
| 2.4 faeB 基因及启动子区的克隆 |
| 2.5 faeB 基因及启动子区的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 faeA 基因在菌毛操纵子表达中的作用 |
| 3.2 faeB 基因及调控区在菌毛操纵子表达中的作用 |
| 参考文献 |
| 实验三 肠毒素 STⅠ-STⅡ-LTB 融合基因的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 STI-STII 融合基因的 PCR 扩增和克隆 |
| 1.3 STI-STII 和 LTB 的融合基因的构建 |
| 1.4 原核表达载体的构建 |
| 1.5 目的基因的表达 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 T-STI-STII 正向连接克隆的获得 |
| 2.2 STI-STII-LTB 融合基因的构建 |
| 2.3 原核表达载体的构建 |
| 2.4 目的基因的表达 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 大肠杆菌肠毒素的生物学特性 |
| 3.2 表达 ST-LTB 融合蛋白的意义 |
| 参考文献 |
| 第三章 结论与设想 |
| 1 实验结论 |
| 2 进一步实验设想 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（9）大肠杆菌表达的融合蛋白K88ac-STⅡ的免疫效果（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 相关试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫抗原的制备 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 免疫小鼠抗体水平测定 |
| 1.2.4 攻毒试验 |
| 1.2.5 攻毒小鼠回肠组织的病理变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫小鼠抗体水平检测 |
| 2.2 免疫攻毒保护结果 |
| 2.3 显微病理变化 |
| 3 讨论 |
（10）携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细菌与质粒 |
| 1.1.2 工具酶 |
| 1.1.3 试剂盒 |
| 1.1.4 其他试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 质粒提取及纯化 |
| 1.2.2 质粒酶切鉴定 |
| 1.2.3 目的基因的扩增 |
| 1.2.4 测序与对照 |
| 1.2.5 重组质粒pYA3334-K88ac-STII的构建与鉴定 |
| 1.2.6 重组菌减毒沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII) 的构建与鉴定 |
| 1.2.7 重组菌减毒沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII) 的SDS分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因K88ac-STII的鉴定与获得 |
| 2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII) 的构建及鉴定 |
| 2.4 X4550 (pYA3334-K88ac-STII) 的SDS分析 |
| 3 讨论 |
四、K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序（论文参考文献）
- [1]肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究[D]. 苏雅婷. 中南民族大学, 2019(08)
- [2]大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响[D]. 沙洲. 吉林农业大学, 2017(02)
- [3]重组大肠杆菌肠毒素蛋白LTA192-STa13的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究[D]. 杜元策. 东北农业大学, 2014(01)
- [4]大肠杆菌粘附素亚基FaeG在Lactococcus lactis中的表达及免疫原性研究[D]. 刘淑杰. 江南大学, 2010(07)
- [5]猪源产肠毒素性大肠杆菌K88、K99，987P、F41双基因串联表达的研究[D]. 逄媛. 山东农业大学, 2008(02)
- [6]重组ETEC K99蛋白和K88ac-STII融合蛋白的免疫原性研究[D]. 姜文亿. 石河子大学, 2008(01)
- [7]K88菌毛细胞表面呈现载体的初步研究[D]. 胡建军. 石河子大学, 2008(12)
- [8]大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达[J]. 杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,王远志,李有文,刘君. 中国预防兽医学报, 2008(02)
- [9]大肠杆菌表达的融合蛋白K88ac-STⅡ的免疫效果[J]. 武军元,陈创夫,王远志. 中国兽医杂志, 2007(09)
- [10]携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定[J]. 杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,任艳. 石河子大学学报(自然科学版), 2007(03)