一、转基因水稻“竹转68”病害发生风险的初步研究（论文文献综述）
梁晋刚,张开心,张旭冬,王颢潜,陈子言,刘鹏程,张秀杰[1]（2021）在《中国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状与展望》文中进行了进一步梳理农业转基因生物环境安全检测标准是农业转基因生物安全管理必不可少的技术保障。截至2021年1月,农业部/农业农村部共发布了农业转基因生物环境安全检测标准47项。本文对我国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状进行初步总结,对国内外农业转基因生物环境安全检测标准的发展现状进行比较,探讨了今后一段时间内农业转基因生物环境安全检测标准的发展方向,以期为我国农业转基因生物环境安全检测标准的进一步完善提供借鉴,使其更好地为农业转基因生物安全管理工作提供技术支撑。
曹燕燕[2]（2019）在《FliD、FliK和SsbXoc蛋白参与稻黄单胞菌致病性的机理研究》文中指出水稻白叶枯病（bacterial leaf blight,BLB）是稻田生态系统中的重要细菌病害,由稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起,常间歇性和区域性爆发成灾,严重影响水稻的产量和品质,制约着粮食安全生产。Xoo可产生多种致病因子,其中包括胞外多糖、胞外酶类、Ⅲ型效应子（T3SS-secreted effector,T3SE）、生物膜和群体感应信号分子等,它们干扰和破坏寄主的正常生理代谢和免疫性,从而使水稻感病。Xoo还产生包括Ssb（single-stranded DNA binding）在内的harpin类蛋白,可在非寄主植物上激发过敏反应（hypersensitive response,HR）。另外,植物病原细菌的鞭毛蛋白可诱导植物产生基础防卫反应和参与病原菌的致病过程。然而,Xoo的鞭毛蛋白和harpin类蛋白在其侵染寄主植物时究竟起何种作用,还不十分清楚。本文以稻黄单胞菌PXO99A菌株基因组中标注的两个鞭毛蛋白FliD和FliK为对象,借助于AvrXa10-Xa10匹配时产生HR的指示系统,研究了它们的T3SS分泌性。将FliD和FliK蛋白N-端前50个氨基酸与N-端缺失28个氨基酸的AvrXa10进行融合,然后置于PXO99A菌株以及T3SS缺失突变体PΔhrcU菌株中,注射接种含有Xa10的水稻,发现FliK与AvrXa10的融合蛋白能激活Xa10抗性,提示鞭毛III型分泌系统（flagellar type III secretion system,fTTSS）和III型分泌系统（the type III secretion system,T3SS）可能具有共同进化的分泌信号。为了研究FliD和FliK鞭毛蛋白的功能,我们利用无标记双交换敲除的方法,分别获得了两个鞭毛基因的敲除突变体ΔfliD和ΔfliK。与野生型菌株相比,ΔfliD和ΔfliK的生长能力未发生明显变化,但鞭毛不能有效形成,细菌的游动性、趋化性、生物膜和胞外多糖产量降低,而其各自互补菌株都可以恢复上述缺陷至野生型水平。将ΔfliD和ΔfliK分别接种水稻后发现,植物体内与抗病相关的两个基因PAL1和PBZ1上调表达,在水稻上引起的病斑长度变短。这说明FliD和FliK是黄单胞菌全毒性所需的;ΔfliD和ΔfliK突变体在烟草上仍能激发产生HR,但烟草中抗性相关基因PTI、NPR1、APX、HIN1、HSR203J以及rbohA均有不同程度的上调表达。Western杂交结果显示,fliD和fliK基因突变后并不影响鞭毛Ⅲ型分泌蛋白FlgD的分泌。以上这些结果说明,FliD和FliK参与了细菌鞭毛的形成和细菌在水稻上的致病性。实验室前期研究发现,稻黄单胞菌中的SsbXoc是harpin类蛋白,可在非寄主烟草上激发HR。该蛋白富含酸性甘氨酸,对热稳定,缺乏半胱氨酸。SsbXoc蛋白预处理烟草和拟南芥,不仅能够促进植物生长,同时还增强了其对真菌的抗性。本研究通过农杆菌介导法,将SsbXoc基因转入本氏烟草中,获得了SsbXoc转基因烟草,并通过Southern杂交和（q）RT-PCR进行了验证。与野生型烟草相比,Ssb Xoc转基因烟草根长更长,生长量更大,并且与植物生长相关的两个基因EXPA1和EIN2的表达水平显着上调。当注射接种Hpa1蛋白和Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000（Pst DC3000）病菌时,SsbXoc转基因烟草产生HR的时间明显早于野生型烟草。与之相一致的是转基因烟草中病程相关基因PR1a和SGT1、HR marker基因HIN1和HSR203J以及MAPK途径相关基因MPK3的表达水平也显着高于野生型烟草。SsbXoc转基因烟草对野火病菌P.syringae pv.tabaci（P.s.tabaci）的抗病能力也显着增强,且病程相关基因PR1a、PR2、PR4以及SGT1的表达水平也明显提高。在盐和干旱胁迫下,与野生型烟草相比,SsbXoc转基因烟草种子的发芽率、叶片中叶绿素的保留量以及游离脯氨酸的含量都显着提高,而丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量明显降低,3个与胁迫抗性相关的基因APX、GPX以及CAT1的表达水平也明显升高。以上这些结果说明,SsbXoc基因转入烟草中后可能通过上调与植物生长相关的基因、HR标志基因、病程相关基因以及抗氧化酶基因的表达水平,从而促进转基因植株的生长,增强了HR产生能力,提高了抗生物和非生物胁迫的能力。
黄鹞[3]（2015）在《两种抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻的杂草化潜力研究》文中提出杂草化是转基因作物环境释放可能引起的生态风险之一。转基因作物的杂草化有两种方式,一是自身杂草化,即转基因作物自身演变为杂草;二是转基因作物通过花粉漂移把抗性基因转移到杂草中,导致抗性杂草的产生。单一性状转基因作物的杂草化已有较多报道,但针对复合性状转基因作物杂草化的报道很少。复合性状转基因作物是在一种受体中同时含有2个或2个以上抗性基因的转基因作物,由于多基因之间的复杂关系,使复合性状转基因作物杂草化风险的可能性增强。因此在复合性状转基因作物商业化之前务必对其杂草化的风险进行全面评估。第一种抗虫抗除草剂转基因水稻B2A68由中科院亚热带农业生态研究所培育,运用农杆菌介导法将人工优化合成的抗虫基因Cry2Aa#和抗草铵膦基因Bar连接后转入受体水稻D68中获得,该水稻对除草剂草铵膦和水稻靶标害虫具有良好的抗性。另一种转基因水稻T1c-19由华中农业大学作物遗传改良国家重点试验室培育,通过农杆菌介导法将人工优化合成的抗虫基因Cry1C*和抗除草剂基因Bar连接后转入受体水稻明恢63中而获得,田间试验表明T1c-19对草铵膦和靶标害虫（二化螟、三化螟、稻种卷叶螟）具有良好的抗性。这两种转基因水稻都具有较大的商业化可能性。本试验分别于2012年和2013年在南京地区研究了上述两种复合性状转基因水稻自身杂草化的可能性;于2014研究了以T1c-19及其受体水稻明恢63为父本,杂草稻（茂名MM,泰州TZ,益阳YY）为母本获得的F1在多种条件下的适合度。上述研究结果能为这两种复合性状转基因水稻的杂草化风险评估提供真实可靠的试验数据;也能为复合性状转基因作物杂草化安全性评估标准的制定提供试验依据。论文主要结果如下:（1）B2A68演化为杂草的可能性:在农田生态环境下比较了抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻B2A68、抗除草剂单一性状转基因水稻Bar-68和常规稻宁粳4号的生存竞争能力、繁育能力、落粒性、萌发能力、种子活力保存能力。结果表明,无论在适宜期还是非适宜期,直播和移栽条件下的B2A68与Bar-68的生存竞争能力和繁育能力均无显着差异;而与常规稻相比,B2A68也没有表现出明显的优势。B2A68与Bar-68的落粒性无显着差异,但显着高于常规稻,3种水稻的落粒性处于中等水平。田间自生苗调查结果显示,3种水稻均无自生苗出现。对收获的水稻种子进行了萌发和埋藏试验,结果显示,3种水稻的萌发率无显着差异,7d时的萌发率均在90%以上;在浅埋和深埋处理下,种子活力随着时间延长而下降,但2种转基因水稻种子活力显着低于常规稻。以上结果表明,复合性状转基因水稻在自然农田环境下演化为杂草的可能性不大。（2）T1c-19演化为杂草的可能性:在农田环境下比较了抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻T1c-19与其非转基因受体水稻明恢63（MH63）和常规稻丰两优香1号（CR）的生存竞争能力、繁育能力、落粒性、休眠性和种子活力保存能力。研究结果表明,无论是适宜期还是非适宜期,在直播和移栽条件下,T1c-19与其受体水稻MH63在生存竞争能力、繁育能力方面均无显着差异,并且显着弱于常规稻。T1c-19和MH63的落粒率低于3%,显着低于常规稻。3种水稻的休眠性都很弱。埋藏试验表明,不论深埋还是浅埋,埋藏2月后,种子活力从90%左右迅速降低到不足40%,埋藏6个月后基本检测不到有活力的种子,表明3种水稻的种子活力保存能力均不强。田间自生苗调查结果显示,3种水稻都无无自生苗出现。以上结果表明,复合性状转基因水稻T1c-19在自然农田下演化为杂草的可能性不大。（3）T1c-19与杂草稻杂交F1适合度表现:a杂交亲和性:试验以T1c-19及其受体栽培稻MH63为父本,3种杂草稻（茂名MM,泰州TZ,益阳YY）为母本,经过人工杂交获得6种F1。人工杂交的结实率在41.7%-88.7%,转基因水稻和受体水稻与同种杂草稻的杂交结实率相差不大,说明,转基因水稻、受体栽培稻与杂草稻有着较高的亲和性,且转基因对受体水稻和杂草稻的亲和性无显着影响。b复合基因对杂草稻适合度的影响:以T1c-19为父本杂交的3种抗性F1（F1+）的与以受体水稻MH63为父本的受体F1（F1-）相比。在单种自然虫压下（虫压指数18.4%）,F1+与F1-相比表现出一定的适合度利益,主要表现在单穗饱粒数和单株产量上。在总适合度上,F1MM+和F1TZ+显着高于F1MM-和F1TZ-,F1YY+与F1YY-相比差异不显着。在单种无虫压下（虫压指数0%）,F1MM+的株高、剑叶面积、穗长、单穗饱粒数、单株产量以及最后的总适合度都显着低于F1MM-,表现出显着的适合度成本。F1TZ+和F1YY+的总适合度与各自受体的F1相比差异不显着。在混种自然虫压下（13.3%）,F1TZ+与F1TZ-相比表现出明显的适合度利益,而F1MM+和F1YY+与F1MM-和F1YY-无显着差异;在混种无虫压下（0%）,F1MM+的适合度显着低于F1MM-,F1TZ+和F1YY+的适合度与F1TZ-和F1YY-无显着差异。以上结果也表明,复合基因是否给杂草稻带来适合度效应受到选择压和杂草稻基因型的影响。抗性F1与各自相应的杂草稻相比。在单种或混种的自然虫压下,3种F1+的总适合度显着大于相应的母本杂草稻,均表现出显着的适合度利益。在单种或混种的无虫压条件下,因杂草稻基因型的不同,3种F1+的适合度显着高于杂草稻或与母本杂草稻相等。c复合基因对栽培稻适合度的影响:自然虫压或无虫压下T1c-19与其受体栽培稻相比适合度均无显着性差异,说明复合基因对栽培稻的影响比较小。d选择压对携带复合基因T1c-19和抗性F1的适合度影响:草按膦选择压给T1c-19和3种F1+的适合度影响不是很明显。有虫压下,仅F1TZ+与无虫压下的F1TZ+相比表现出显着的适合度利益,对T1c-19和另外2种F1+的适合度影响不显着。双重选择压（草铵膦选择压+虫压）对携带复合基因的F1+和T1c-19的适合度影响不显着。综合上所述,抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻B2A68和T1c-19在田间条件下生存竞争能力与相应的受体水稻无显着性差异,演化为杂草的可能性不大。复合性状转基因水稻T1c-19及其受体水稻MH63与杂草稻杂交F1的适合度表现因杂草稻基因型的不同而不同。在自然虫压下,抗性F1的适合度大于或与相应的受体F1无显着差异。无虫压下,抗性F1的适合度小于受体F1或与受体F1无显着差异。与杂草稻相比,在自然虫压,抗性F1均表现出较为显着的适合度利益;但在无虫压下,F1+的适合度显着高于或与母本杂草稻相近。环境选择压对抗性F1的适合度无显着性影响。复合基因对栽培稻适合度影响较小,在自然虫压和无虫压下,T1c-19与受体水稻MH63适合度相比无显着性差异。
蒋显斌,黄芊,凌炎,陈玉冲,龙丽萍,黄凤宽,罗群昌,肖国樱[4]（2014）在《转基因抗除草剂水稻Bar68-1田间主要病害发生情况调查初报》文中研究说明【目的】评价抗除草剂转基因水稻对稻田主要病害发生的影响,为抗除草剂转基因水稻的病虫草害综合防治及其生态安全性评价提供科学数据。【方法】以抗除草剂转基因水稻Bar68-1及对照非转基因亲本D68为材料,分别调查田间稻瘟病、纹枯病、白叶枯病和条纹叶枯病等病害的病情指数及紫鞘病、叶鞘腐败病等病害的病株率,比较转基因稻田和非转基因对照稻田各主要病害的发生情况。【结果】转基因水稻Bar68-1田间主要病害为纹枯病（病情指数为8.140.7）,有少量稻瘟病发生,水稻紫鞘病（病株率为6.7%48.0%）和叶鞘腐败病（病株率为14.2%28.7%）等病害也有发生,所发生病害的病情指数或病株率与对照相比均无显着差异（P>0.05）;试验期间Bar68-1和D68稻田均未发生水稻条纹叶枯病、白叶枯病和稻曲病。【结论】转基因抗除草剂水稻Bar68-1对稻田主要病害的发生无显着影响,没有增加稻田主要病害发生危害的风险。
李志毅[5]（2012）在《转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对田间主要昆虫种群的影响研究》文中研究指明二化螟Chilo suppressalis （Walker）、大螟Sesamia inferens （Walker）和稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenee）均是我国水稻生产上的重要害虫,受近年来我国水稻耕作制度的不断变迁、害虫抗药性的不断加剧和气候变暖等因素的影响,上述鳞翅目害虫种群的发生为害呈逐年上升趋势。转Bt基因抗虫水稻的成功研制为鳞翅目害虫的防治提供了新的策略。然而,转Bt水稻所引发的生态安全问题是制约其商业化生产的重要因子。本文以转Bt基因水稻华恢1号（CrylAc/CryAb融合基因；简称HH1）及其对照亲本明恢63（简称MH63）为试验材料,系统研究了转Bt基因水稻种植下,稻田主要靶标害虫二化螟、大螟、稻纵卷叶螟及主要非靶标害虫稻飞虱和部分主要节肢动物的发生及消长规律。该研究结果有望明确转Bt基因水稻对二化螟、大螟、稻纵卷叶螟的抗性效率；转Bt水稻种植下二化螟和大螟种群演替的风险大小；转Bt水稻对非靶标害虫稻飞虱发生及为害的影响；转Bt水稻对稻田主要节肢动物种群动态的影响,以期为转Bt水稻的生态安全评价提供重要科学数据,对转Bt基因抗虫水稻的可持续应用和健康发展具有重要理论和实践意义。主要研究结果如下：1.对稻纵卷叶螟连续两年的田间抗性效率评价试验表明,转Bt水稻对稻纵卷叶螟幼虫具有极强的抗性,抗性效率接近100%。稻纵卷叶螟半自然种群生命表的组建试验表明,转Bt水稻对稻纵卷叶螟的卵期和蛹期的存活率无显着影响,只对其幼虫各龄期的存活率有显着影响,同时,转Bt水稻对稻纵卷叶螟蛹重存在显着影响；在单位面积内落卵量达到一定密度的条件下,在转Bt水稻上仍然会有一定比例的稻纵卷叶螟能够完成整个世代,并且造成一定危害。对稻纵卷叶螟成虫产卵选择性测定结果表明,稻纵卷叶螟在转Bt水稻与其对照亲本间,无明显的产卵选择行为。2.对大螟与二化螟连续两年的田间种群动态研究表明,二化螟是当前稻田的优势种群,并且与对照亲本水稻相比,转Bt水稻上二化螟的幼虫发生量显着降低,而大螟的发生量没有显着差异,且在转Bt水稻上二化螟的幼虫量较低且与大螟差异不显着；转Bt水稻上二化螟导致的枯心/白穗率和受害株率都显着低于其在对照亲本水稻上的致害程度,而大螟的致害性差异不显着。从而说明,转Bt水稻对靶标害虫二化螟具有较高抗性,对次靶标害虫大螟的抗性相对较差,为将来高虫口密度下大螟在转Bt水稻上暴发危害、进而演变为优势虫群创造了可能,进而导致转Bt水稻大面积商业化推广种植下大田螟虫的竞争演替及次要害虫上升为主要害虫的生态风险。二化螟幼虫期自然种群生命表的组建试验表明,二化螟田间消长的关键阶段处于低龄阶段,在转Bt水稻上Bt因子致死率最高的阶段在低龄,随着龄期的增长,转Bt水稻对其幼虫的致死力逐渐降低,进而说明,转Bt水稻对其靶标害虫致死力存在时间动态。3.对褐飞虱与白背飞虱连续两年的田间种群动态研究表明,转Bt水稻对褐飞虱和白背飞虱的田间百丛若虫量、百丛成虫量、百丛种群总量种群动态指标无显着影响。褐飞虱和白背飞虱成虫在转Bt水稻与对照亲本上着落没有选择性,即转Bt水稻不会对褐飞虱和白背飞虱成虫着落选择行为造成影响。连续两年研究了转Bt水稻对稻田主要节肢动物群落的影响,结果表明,转Bt水稻对稻田捕食性天敌昆虫亚群落数量、寄生性天敌昆虫亚群落数量、非靶标害虫亚群落数量、节肢动物群落数量无明显影响。
关峰[6]（2012）在《几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究》文中认为水稻是最主要的粮食作物之一,在全世界广泛种植。全球有80%的人口以水稻作为主粮。在我国,水稻更是第一大粮食作物,对国民经济发展起着重要的支撑作用。也是粮食安全的重要保障。近年来,随着植物遗传转化技术的迅猛发展,各国育种学家愈来愈广泛地把基因工程等现代技术手段应用于育种研究中,试图将一些控制优良性状的外源基因导入水稻,以培育优质、高产、抗逆性强的水稻新品种。由于水稻品种繁多,而且植株再生和遗传转化的复杂性和随机性很大,针对某一个特定的水稻品种建立高效、稳定的再生体系和转化系统非常必要,而提高愈伤组织的再生能力一直是水稻组织培养技术需要突破的技术关键。由于不同水稻品种愈伤组织分化、再生的频率不同,这种状况严重地制约了以水稻组织培养为基础的植物遗传转化工程的发展。因此针对特定品种建立一套适合其高效遗传转化的体系,对创制新的水稻种质资源以及培育优良水稻品种具有重要意义。本研究以吉林省主栽水稻品种吉农大808为研究对象,建立了针对农大808的高频再生体系,优化了遗传转化系统,用农杆菌介导法和基因枪转化法等不同手段将Tch基因导入吉林省主栽水稻品种中,经过含有10mg/L除草剂的培养基中筛选后,获得了转基因抗性植株。吉林省主栽水稻品种的组织培养体系的建立和优化,对今后东北地区水稻规模化遗传转化以及水稻转基因研究提供了有利技术支撑。本试验获得的结果如下：1.针对水稻品种吉农大808,建立了高频再生体系并优化了遗传转化系统。（1）继代培养基中外源激素添加量为NAA1mg/L+KT0.5mg/L+2.4-D1mg/L时有利于水稻愈伤组织的分化,愈伤组织的生长速度虽有减缓,但质地紧密、呈颗粒状、圆形、分散性好的胚性愈伤组织数量明显增加,后期绿苗分化率也随之提高。优化后的体系应该是每20天继代一次,连续继代三次以上,此时愈伤状态最佳,可用作转化受体材料。（2）利用吉农大808水稻成熟胚诱导的愈伤组织,如果在分化前干燥处理4h,可引发愈伤组织细胞产生一些生理生化反应,可以显着提高愈伤组织的分化能力。但干燥处理时间不能超过8h,否则愈伤组织失水严重,其分化能力将明显降低。2.通过农杆菌介导法和基因枪转化法,将位于同一表达载体上的抗病相关目的基因Tch和抗除草剂筛选基因bar导入吉农大808中,筛选后共获得了105株抗性再生植株。PCR检测得到24株Tch和bar共转化的阳性材料,经Basta试纸条和浓度为1g/L的除草剂涂抹试验鉴定,其中2株材料经试纸条检测呈阳性,并表现出明显的Basta抗性,表明筛选基因bar已经整合到水稻基因组中并稳定表达。由于目的基因Tch和筛选基因位于同一个表达载体中,可以间接推测目的基因Tch可能具有相应的较高表达水平,进一步的验证工作正在进行中。
张长伟[7]（2011）在《转McCHIT1、alfAFP基因及其双价基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究》文中研究指明水稻是我国也是世界的主要粮食作物,稻瘟病和纹枯病的严重发生是影响其产量和品质的重要因素。生产实践证明：选育和合理栽培抗病品种是防治水稻稻瘟病和纹枯病的最经济、有效措施。因此,多年来人们运用常规育种、杂交育种技术培育出一系列抗病水稻品种,在生产上推广应用发挥了巨大的社会和经济效益。但由于病原菌遗传多样性、抗病基因匮乏、育种周期长等因素,使稻瘟病和纹枯病抗病育种成效大大降低。为提高水稻抗病育种成效,人们采用传统育种技术与组织培养、分子标记辅助育种相结合选育抗病品种,证明能缩短育种周期和提高育种效率,克服了传统育种的一些主要缺点,但育种中仍存在一些难以克服的局限,如抗病基因的缺乏和数量的不足,常使其研究举步维艰,育种成效难以彰显。而转基因技术能弥补这些育种技术的不足,已成为目前丰富水稻抗病种质资源,提高水稻抗病育种成效的有效途径之一。本实验室采用根癌农杆菌介导法将苦瓜几丁质酶基因McCHIT1、苜蓿防御素基因alfAFP及其双价基因成功地导入水稻恢复系缙恢35中,通过抗病性鉴定、GUS和PCR检测,得到了一批对稻瘟病、纹枯病抗性明显增强的转alfAFP基因、McCHITl基因、McCHIT1-alfAFP双价基因植株后代。为进一步了解这些转基因水稻植株后代对稻瘟病和纹枯病抗性的遗传变异特性,挖掘其育种利用价值,本研究从T3代起逐代进行稻瘟病和纹枯病抗性鉴定和筛选。对获得的稻瘟病和纹枯病抗性优良转基因稳定株系,一方面进行稻瘟病菌抗谱测定和主要农艺性状考察,另一方面对其所配杂交水稻组合进行稻瘟病抗性鉴定和主要农艺性状考察,以期筛选出稻瘟病抗性、纹枯病抗性和其他农艺性状优良的转基因恢复系材料,为探索广谱抗病育种新途径提供参考。主要的研究结果如下：1、转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻各世代的抗病性变异结合本实验室前期的研究可见,转McCHITl基因、alfAFP基因及其双价基因McCHIT1-alfAFP基因水稻各世代的抗病性变异有基本相同的趋势,即T2代以前的株系在稻瘟病和纹枯病抗性遗传上极不稳定,不同株系间以及同一抗病性优良株系的不同单株间存在较大的抗病性差异；T3代大多数株系的抗病性基本稳定,少部分株系属杂合株系,单株间抗病性仍存在较大的强弱分化；T3代以后随着世代的增加,转基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性遗传逐趋稳定,通过连续多代的抗病性鉴定、GUS检测和优良抗病株系的筛选,至T5代可筛选出抗病性优良的各类型转基因水稻稳定株系。2、稻瘟病抗性优良转McCHITl基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的筛选及其主要农艺性状的表现通过对T3、T4、T5代株系的稻瘟病抗性鉴定、筛选和T6代株系的稻瘟病菌抗谱测定,获得稻瘟病抗性较受体对照缙恢35极显着提高、抗谱明显拓宽的转McCHIT1基因水稻稳定株系有C36-2-1、C35-6-2、C10-7-1、C24-4-1、C24-4-2、C21-6-2和C21-3-1等7个株系,转alfAFP基因水稻稳定株系有A3-6-1、A3-6-2、A7-3-1、A7-6-1、A7-6-2、A7-8-1、A4-8-1、A10-4-1等8个株系,转McCHIT1-alfAFP基因水稻稳定株系有AC2-10-1、AC4-2-2、AC7-3-1、AC8-5-1等4个株系。在受体对照感苗瘟、叶瘟和穗颈瘟的发病情况下,这些株系的苗瘟抗性、叶瘟抗性、穗颈瘟抗性达到或接近中抗水平。这些株系的总群抗病频率比受体对照之值（36.50%）高出15个百分点以上,与受体对照相比,多数株系增加了对ZE群生理小种的抗性,提高了对ZA.ZB.ZG.ZF等4个种群生理小种的抗性,对稻瘟病菌表现出比较广谱的抗性。采用“逐代增加选择压,抗中选抗”的方法,可筛选出稻瘟病抗性优良、抗谱明显拓宽的转基因稳定株系。农艺性状考察表明,各稻瘟病抗性优良转基因水稻株系的主要农艺性状已趋稳定,但与受体对照相比,不同类型转基因株系的主要农艺性状均发生了不同程度的变异。转McCHIT1基因水稻株系与受体对照相比变异较大,主要趋势为,转基因株系的播始历期较短,植株较矮,单株有效穗数较多,穗长较短,每穗粒数较多,穗着粒较密,结实率较低,千粒重较小,而单株实粒重则趋势不明,较高、较低的变化均有,其中,以播始历期、株高、结实率和千粒重等4个性状的差异较为显着而普遍。转alfAFP基因水稻株系与受体对照相比,除单株有效穗数差异不显着,播始历期显着较长、显着较短均有,植株株高显着较高、显着较矮均有外,在其他性状上的主要趋势与转McCHT1基因水稻株系的一致,其中,在播始历期、结实率、株高等3个性状上存在较为广泛而显着的差异。转McCHIT1-alfAFP基因水稻株系与受体对照相比,穗粒数、穗着粒密度等2个性状差异不显着,播始历期较长、较短均有,单株有效穗数较多,单株粒重较大,在结实率和千粒重等2性状上与转McCHIT1-alfAFP基因水稻株系的一致,其中,以千粒重、播始历期、株高、穗长的差异较为显着而普遍。结合水稻恢复系选育的要求,综合比较,C36-2-1、C21-6-2、C21-3-1、A-7-3-1、A7-8-1、AC2-10-1和AC4-2-2等7个株系是综合农艺性状较好的抗稻瘟病转基因株系。3、稻瘟病抗性优良转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系所配组合的稻瘟病抗性及其主要农艺性状表现转基因株系所配组合的稻瘟病抗性鉴定和农艺性状考察结果表明,各抗病性优良转基因株系所配杂交水稻组合的稻瘟病抗性极显着优于受体对照和感病转基因株系所配组合,其优良抗病性能较好地传递给F1代,但转alfAFP基因株系的优良抗病性传递能力相对较好,所配组合的穗颈瘟抗性较强,达到或接近中抗水平。各抗病性优良转基因株系所配杂交水稻组合的主要农艺性状已趋稳定,与受体对照所配组合相比,除个别株系所配组合在个别或少数考察性状上与受体对照所配组合存在显着或极显着差异外,多数抗病性优良转基因株系所配组合在主要农艺性状上与受体对照所配组合相当。这与抗病性优良转基因株系的主要农艺性状与受体对照有较大差异不一致。综合比较,C21-6-2、C21-3-1、C36-2-1、A7-3-1、A7-8-1、AC2-10-1、AC4-2-2和AC7-3-1等8个抗病性优良转基因株系与水稻不育系II-32A所配组合是丰抗结合较优的转基因杂交水稻组合。4、纹枯病优良抗性转McCHITl基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的筛选通过对T3、T4、T5代株系的纹枯病抗性鉴定、筛选,获得了C36-2-1、C35-6-2、C10-7-1、C24-4-1、C10-2-1、C24-2-1、C24-2-2、C21-13-2等8个纹枯病抗性优良（病情指数值低于45%以下）的转McCHIT1基因株系,其中,C36-2-1、C10-7-1、C21-6-2、C21-3-1等4个株系属纹枯病和稻瘟病抗性均优良的转McCHIT1基因株系；获得了A3-6-1、A3-6-2、A7-6-1、A4-8-1、A10-4-1、A3-2-2、A2-9-3等7个纹枯病抗性优良（病情指数值低于45%以下）的转alfAFP基因株系,其中,A3-6-1、A3-6-2、A7-6-1、A4-8-1、A10-4-1等5个株系属纹枯病和稻瘟病抗性均优良的转alfAFP基因株系；获得了AC2-10-1、AC4-2-2、AC7-3-1、AC3-2-1、AC6-2-2等5个纹枯病抗性优良（病情指数值低于45%以下）的转McCHIT1-alfAFP基因株系,其中,AC2-10-1、AC4-2-2、AC7-3-1等3个株系属纹枯病和稻瘟病抗性均优良的转McCHIT1-alfAFP基因株系。5不同转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的抗病性强弱分化的原因分析稻瘟病菌抗谱分析表明,稻瘟病抗性优良的7个转McCHIT1基因株系、8个转alfAFP基因株系和4个转McCHIT1-alfAFP基因株系的稻瘟病抗性显着或极显着优于受体对照和其他转基因株系的主要原因是,其对稻瘟病菌总群的抗谱明显较宽,特别是对优势种群B群和重要种群A群的生理小种具有较高的抗病频率。几丁质酶活性分析表明,抗病性优良转McCHIT1基因株系在接种纹枯病菌前后的总几丁质酶活性显着或极显着高于受体对照和感病转基因株系的总几丁质酶活性,其接种前后1d的总几丁质酶活性是受体对照的3.4-4.2倍,是感病转基因株系2.1-2.7倍,接种2d后随着受体对照的总几丁质酶活性的快速提高,抗病性优良转基因株系的总几丁质酶活性较受体对照的倍率有所下降,为1.8-2.9倍,但抗病性优良转基因株系的总几丁质酶活性较接种2d前有所提高,但不显着,说明抗病性优良转基因株系的McCHIT1基因得到了较强程度的组成型表达,同时内源几丁质酶基因也能得到一定程度的诱导性表达。因此,感病转基因株系的McCHIT1基因未能高水平的组成型表达,是其抗病性显着弱于抗病性优良转基因水稻株系的原因,反之,抗病性优良转基因水稻株系的抗病性显着或极显着高于受体对照和其他转基因株系的生理原因是其McCHIT1基因得到了高水平的组成型表达。
李海青[8]（2011）在《基因工程培育抗病（稻瘟病、条纹叶枯病）转基因水稻》文中研究说明水稻是世界上最重要的粮食作物之一,但是病害,尤其是稻瘟病、条纹叶枯病,对世界各国稻区水稻的生产造成了极严重的影响。培育水稻抗病新品种,提高植物的广谱抗性,这是当今农业发展的重要研究课题之一,也是关系到国计民生的重大问题。Rs-AFP1基因作为从萌发的小萝卜种子内提取的一种多肽,属于γ-硫堇蛋白,已证明其在离体条件下能够抑制多种真菌生长;白藜芦醇是植物处于恶劣环境下或遭到病原体侵害时,植物自身分泌的一种可抵御病菌感染的抗菌素,作为一种重要的植保素,它能够增强植物抵抗病原体的能力,并被证明对多种真菌性病害有抑制作用,而白藜芦醇合成酶作为其合成途径中的关键酶,对植物体内白藜芦醇合成及代谢具有重要的调控作用。本研究中,我们分别从萌发的小萝卜种子及花生未成熟种子cDNA文库中分离出Rs-AFP1基因以及白藜芦醇合成酶基因PNRSC。对这两个基因进行生物信息学分析,并将它们分别构建入经改造的以玉米泛素Ubiquitin为启动子、以bar基因为选择标记基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导的方法对黄淮区主栽品种“圣稻13”的成熟胚进行遗传转化并获得13株转Rs-AFP1基因的植株以及7株转PNRSC基因的植株。通过除草剂Basta涂抹以及PCR分子鉴定,确定转化Rs-AFP1基因的第1、4、6、7、10、13株系为阳性转基因植株,转化PNRSC基因的第1、2、3、4、5、6株系为阳性转基因植株,并进一步对鉴定为阳性的转基因植株提取总蛋白液进行稻瘟病菌体外的抗性鉴定、田间自然发病情况下的抗病性检测以及对转基因植株进行室内苗期稻瘟病菌接种性鉴定,初步研究结果表明,各阳性转基因植株的总蛋白提取液在体外对稻瘟病菌具有一定程度上的抑制作用;在田间自然发病情况下,野生型圣稻感染了稻瘟病,而相同生长条件下的各阳性转基因株系均未感病;对T1代阳性转基因株系的三叶一心期进行室内稻瘟病菌接种性鉴定,转化Rs-AFP1基因的各阳性株系中,除第10株系表现为感病外,其余均表现为抗病,转化PNRSC基因的各阳性株系中,除第2株系表现为感病外,其余均表现为抗病。由此可见,外源Rs-AFP1基因及白藜芦醇合成酶基因PNRSC的导入均可在一定程度上提高目标植物对病害的耐性及抗性,从而为水稻抗稻瘟病转基因新品种的培育提供了候选材料。水稻条纹叶枯病病毒即RSV的基因组由4个独立的单链RNA大分子组成,按照分子量大小分别命名为RNA1～RNA4。利用由pUC19改造的具有两对同尾酶的RNAi载体分别与RSV的单链RNA正向和反向连接,中间含有一段内含子,从而使正链和反链互补形成一个发夹结构,根据RNA干扰的原理,该表达载体导入植物体后如遇到RSV的侵染,将产生使RSV的单链RNA沉默的结果,从而使其无法表达而丧失致病性。研究中我们根据RSV的4个单链RNA分别设计了12对引物,利用感染病毒的水稻叶片所提取的RNA为模板,通过RT-PCR以及PCR技术克隆出5个水稻条纹叶枯病毒不同的cDNA片段,将它们分别命名为OsRSV（1-5）,然后构建RNA干扰载体,利用农杆菌介导法转化黄淮区主栽品种“圣稻13”,获得了4株转OsRSV1片段的转基因植株、6株转OsRSV2片段的转基因植株、5株转OsRSV3片段的转基因植株、7株转OsRSV4片段的转基因植株、11株转OsRSV5片段的转基因植株,通过除草剂Basta涂抹以及PCR分子鉴定确定阳性转基因株系,并对鉴定为阳性的转基因株系进行田间自然发病情况下的抗病性观察。初步结果表明,野生型圣稻感染了条纹叶枯病,而相同生长条件下的各阳性转基因株系均未感病。接下来我们将对各阳性转化材料进行抗虫性、抗病性鉴定,进而筛选出抗病有效区段,为进一步培育抗条纹叶枯病的水稻新品系提供材料。综上所述,本研究利用基因工程手段解决稻瘟病、条纹叶枯病相关的水稻病害问题,并对获得的转基因阳性的黄淮稻区水稻主栽品种进一步进行抗病能力的筛选及检测,以期能培育并获得抗稻瘟病、抗条纹叶枯病能力提高的转基因水稻新品种。该方面的工作是保障我国未来食物安全、人民健康的需要,也是环境保护、能源替代的需要,更是转基因技术产业化发展的需要。因此,培育抗稻瘟病及抗条纹叶枯病的转基因水稻新品种意义重大而深远。
李玉蓉[9]（2010）在《水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究》文中认为水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）是水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）种下的两个致病变种之一,引起的水稻细菌性条斑病（条斑病）（Bacterial Leaf Streak, BLS）,近年来成为水稻上的重要病害。水稻条斑病菌同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样拥有hrp基因簇,决定着病原细菌在非寄主植物上的过敏反应（hypersensitive response, HR）和在感病寄主上致病性（pathogenicity）。与水稻互作时,水稻条斑病菌的hrp基因簇编码形成Ⅲ型分泌系统（T3SS）,将T3SS效应蛋白注入植物细胞中从而导致非寄主产生HR和在水稻上产生细菌性条斑病症状。水稻条斑病菌约27kb的hrp基因簇包括10个hrp,9个hrc （hrp-conserved）和8个hpa （hrp-associated）基因,也称hrp-hrc-hpa基因簇,并由调节因子HrpG和HrpX调控。虽然水稻条斑病菌的hrp-hrc-hpa基因与其它植物病原黄单胞菌中的hrp-hrc-hpa基因有较高的同源性,但每个基因对病原菌的致病性和毒性的贡献并不清楚。本研究以野生菌株RS105为出发菌,利用自杀性载体pKMSl获得了上述29个hrp基因的无标记缺失突变体。植物上接种结果显示,hrc基因突变体全部丧失在非寄主上的HR和在水稻上的致病性（Hrp表型）；hpa基因对Hrp表型没有显着影响,仅hpaB和hpa1基因突变体分别丧失和减弱了在水稻上的致病性；hrp基因中,除hrpF表现为毒性显着减弱和仍能激发烟草HR以及hrpE3对Hrp表型没有改变外,其他hrp基因突变后,病原菌均丧失Hrp表型。这些结果为进一步揭示hrp-hrc-hpa基因的具体功能奠定了基础。为了揭示可能的调控因子对hrp-hrc-hpa基因调控关系,本研究根据其他植物病原黄单胞菌的研究结果,分别对全局性调控因子Trh、LrpX、ColR、ColS和Zur在水稻条斑病菌中的基因进行了敲除。水稻上的致病性和烟草上的HR测定结果显示,trh、lrpX、colR、colS和zur突变体降低了水稻条斑病菌在水稻上的毒性,但不影响在烟草上的HR激发能力。水稻条斑病菌的hrp基因主要由调节因子HrpG和HrpX进行调控,但至今并不清楚是否HrpG和HrpX调控所有的hpa-hrp-hrc基因转录表达。RT-PCR结果显示,hrcC、hrpD5、hrpE和hpa3基因的转录表达不完全依赖HrpG和HrpX的调控；hrcT受HrpX调控不受HrpG调控,hpa2受HrpG调控不受HrpX调控。另外发现,hrpD6基因突变后,hpa2、hpa1和hpaB基因不转录表达,hrcC和hrcT基因的转录表达水平下降。这说明,HrpG和HrpX通过调控hrpD6的表达而影响了hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的表达。为了了解其他全局性调控因子以及HrpG和HrpX对上述基因表达的调控作用,本研究将hrpA、hrpB、hrpC、hrpD和hpa3转录单元的启动子以及hrp基因簇中的启动子进行了分析,认为它们的启动子分别为phrcC、phrcT1、phrpD51和phpa3。通过软件分析后还发现,hrpB转录单元中的hrcN和hrpD转录单元的hpaP基因内存在可能的启动子,分别为phrcT2和phrpD52。将上述启动子分别与gusA基因进行融合,导入野生菌中,在水稻细胞、hrp诱导培养基XOM3和NB中进行GUS活性测定。结果发现,phrcC、hrcT1、prhD51和phpa3启动子可以驱动gusA基因在水稻细胞和XOM3中诱导表达,而不能有效在NB中表达。相应的,phrcT2和phrpD52在三种条件下都能驱动gusA基因表达。为了排除全局性调控因子对上述基因表达差异的调控作用,本研究将上述hrp-gusA构建以及hrpG和hrpX基因的启动子分别导入hrpG、hrpX、trh、lrpX、colR、colS和zur突变体中,结果发现,hrpA转录单元受HrpG、Zur、ColR和Trh的正调控,不受HrpX、LrpX和ColS的调控；hrpB转录单元受HrpX正调控,不受其他因子的调控；hrpD转录单元同时受HrpG和HrpX调控,不受其他五个全局性调控因子的调控；hrpG基因受Trh正调控,不受其他调控因子的影响；hrpX基因受HrpG的正调控影响最大,其次受Zur和Co1R的正调控,但还受LrpX的负调控作用。这表明,这些调控因子通过对hrpG或hrpX基因的转录调控作用而间接的影响hrp基因的转录表达。而五个全局性调控因子以及HrpG和HrpX对phrpD52和phpa3没有调控作用。这也提示,hrpD5、hrpE和hpa3的调控受到未知调控因子的作用。为了揭示这些因子在转录后水平上对hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3的调控作用,本研究利用Northern杂交对上述调控因子突变体中的hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3基因表达进行了分析。结果发现,hrpE基因在hrpX突变体中仍然有低水平的转录,而在lrpX突变体中表达水平超过野生型。这提示,hrpE基因的表达并不受HrpG、Trh、ColR、ColS和Zur的调控,但受到HrpX的显着正调控作用,并且LrpX对HrpX的负调控,导致hrpE转录水平升高。遗憾的是,hrcC、hrpD5和hpa3的mRNA水平太低,没有杂交信号出现。由于hrpD5、hrpE和hpa3不完全依赖hrpG和HrpX调控,这促使本研究进一步对其所在的转录单元构成进行分析。对phrpD51和phrpD52进行突变,经诱导通过RT-PCR分析后发现,hrpD转录单元的启动子phrpD51突变后,除hrpD5和hrpE基因外,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaP、hrpD6、hrpE和hpaB基因不转录表达,而可能的启动子对上述基因（hpaP除外）的转录没有影响。这说明hrcQ到hpaB基因同处一个转录单元中,而hrpD5基因的转录可能受到另外调控因子的作用。为了证实这个结果,本为从hrpC转录单元的hpaP基因开始,以hrpE3基因为终点,以两两基因为对象,通过RT-PCR扩增发现,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6、hrpE和hpaB基因处于同一转录单元中。这一结果不同于其它植物病原细菌黄单胞菌的转录单元构成,但与水稻白叶枯病菌的相应的转录单元相同。为了进一步说明HrpD6对hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的调控作用以及对hrpG和hrpX的转录表达有影响作用,本研究将细hpa2和hpa1的启动子phpa2和phpa1以及phrcC、phrcT和phrpD51与gusA的融合构建,分别置于hrpD6突变体和野生型中,经XOM3诱导表达后GUS活性检测发现,HrpD6对hpa2、hpal和hrcC基因以及hrpB转录单元有正调控作用,对hrpG、hrpX基因和hrpD转录单元转录表达没有影响。为了蛋白质水平上检测hrpD6突变后,影响了Hpa2和Hpa1的产生,本研究将hpa1和hpa2基因与c-Myc标签进行融合,分别置于野生菌株、T3S突变体hrcV突变体和hpaB突变体中。蛋白免疫杂交结果显示,hrpD6突变体和hpaB突变体中无Hpa2和Hpa1蛋白的分泌。这说明,hpa2、hpal和hpaB基因在转录水平上就受到了HrpD6的调控。为了进一步分析HrpD6对hpaB基因的调控作用,本研究以HpaB依赖而分泌的效应分子AvrXa27和不依赖HpaB而分泌的转位元HrpF为报道基因,分别与FLAG和c-Myc进行融合,导入野生菌、T3S突变体hrcV、hrpD6和hpaB突变体中,经过相同的诱导,蛋白质免疫杂交结果显示,hrpD6突变后,与同hpaB突变体一样,AvrXa27不分泌,HrpF仍能进行分泌。这表明,hrpD6基因突变后,hpaB基因不转录表达,从而AvrXa27不能进行分泌,而不依赖HpaB的HrpF能够进行分泌。明确HrpD6是hrp-hrc-hpa基因的调控因子,在黄单胞菌的hrp基因调控中还属首次报道。X. oryzae pv. oryzicola的hpa2基因位于hrp基因簇最左端,启动子区域存在imperfect PIP-box,其基因产物属lytic transglycosylase家族,推测其可能溶解植物细胞壁从而使T3SS发挥作用。hrpF基因位于hrp基因簇的右端,在寄主细胞膜上形成转位装置将效应蛋白转运至寄主细胞中。Hpa2和HrpF是否互作,从而决定病原菌的致病性,还不清楚。本研究发现,hpa2和hrpF基因分别突变后,降低了在水稻上的毒性,细菌生长能力减弱,但不影响在非寄主烟草上的HR。hpa2和hrpF同时突变后,X. oryzae pv. oryzicola在水稻上丧失了water soaking症状和致病性,但在非寄主上仍有HR激发能力。转录水平研究发现,hpa2基因的表达受HrpG调控,不受HrpX调控。细胞定位结果显示,Hpa2作用于植物细胞膜上而非细胞壁。蛋白质互作和免疫杂交结果显示,Hpa2通过T3SS进行分泌,并与HrpF互作,控制T3S效应分子AvrXa27转位进入水稻细胞中,但在hrp诱导培养基上仍等检测到AvrXa27的分泌,推测Hpa2和HrpF互作形成复合体,控制效应分子转位进入植物细胞内,从而影响病原菌的致病性。水稻条斑病菌的HrpX能够调节hrp基因的表达,而在被调节的因子启动子区域一般含有PIP-box （plant-inducible promoter, TTCGC-N15-TTCGC）.为了研究HrpX对hpa1的调控机制,通过in vivo策略,将启动子区域含有PIP-box的hpa1基因启动子分别与绿色荧光蛋白基因（green fluorescence protein, gfp）进行融合（phpa1：：gfp）,两亲交配导入水稻条斑病菌野生型菌株和hrpX突变体中,借助水稻悬浮细胞诱导表达系统,观察启动子启动gfp的表达情况。结果发现,在hrpX基因突变体ARhrpX中,融合基因不转录表达,ΔRhrpX中菌体不显示荧光。同时RT-PCR结果揭示,ARhrpX中hpa1基因不能转录表达。以上结果表明,水稻条斑病菌中hpa1的转录表达受到HrpX的调控。水稻条斑病菌的hpa1是唯一已知的编码Harpin的基因,但是其在引起细胞死亡的生理生化机制尚不清楚。为此,基于对Hpal的氨基酸序列分析,本研究将Hpal缺失互补丧失HR的双突变体ARhpa1△hrpF观察HR,结果显示Hpa1 N端的α-helix决定其在非寄主烟草上产生HR,且第47位（C）和第53位（L）氨基酸是关键氨基酸。通过瞬时表达GFP,洋葱表皮定位显示Hpal主要定位于细胞膜上,暗示其可能通过破坏植物细胞膜起作用。根据X. oryzae pv. oryzae中的AvrXa10和Xa10的特异性互作关系,同时以avrXa10为报道基因,将RS105hpa1 N端60aa与缺失N端分泌信号（A28aa）的avrXalO融合后导入X. oryzae pv. oryzae PXO99A中,接种含有Xa10的水稻品种IRBB10观察褐色抗病反应,结果表明Hpa1能经细菌T3S进行分泌,Western Blot（?）必出性检测结果与此一致。这将为进一步揭示非寄主抗性提供更多的理论依据和有利线索。鉴于调控元件PIP-box序列保守性,可以将其作为一个有效的筛选标记从大量的基因组数据中获得HrpX调节子。基因组信息提示,X. oryzae pv. oryzicola的很多基因在启动子区域都含有完整或不完整的PIP-box。因此为了从X. oryzae pv. oryzicola中获得更多受HrpX调节的基因,本研究选取5个候选因子（hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234）借助启动子-gfp（PIP-gfp）融合表达方法,导入X. oryzae pv. oryzicola hrpX基因突变体中,与水稻悬浮细胞互作后观察荧光有无或强弱,建立了筛选HrpX调节子的体系,同时也提示某些含有imperfect PIP-box的因子如kgtP和Z1234也是HrpX调节子,这为新的Ⅲ型效应分子的发掘提供依据。鉴于X. oryzae pv. oryzicola hpal基因编码产物Harpin具有在非寄主烟草上激发过敏反应的能力,其产物体外施用诱导植物产生多种有益表型,如抗病、抗虫及促生等,而转基因手段则可以实现其在植物体内的运用。为此,将水稻条斑病菌的hpa1放在组成型表达的CaMV35S启动子下获得重组质粒pBIhpa1。但Hpa1并没有直接的杀菌活性,为此将Hpa1和Cecropin A （CA）（?）勺α螺旋结构以及Meltin （ME）的α螺旋结构通过polylinker以及自由环进行连接,获得具有杀菌功能的融合基因hcm1。通过3种不同的构建策略将hcm1基因分别放在组成型表达的CaMV35S启动子、受病原菌诱导表达的hsr203J和PR1α启动子下获得重组质粒pBIhcml、pBIhshcml和pBIPRhcml。将上述转基因重组质粒转化根癌土壤杆菌EHA105菌株,通过农杆菌介导的方法,进行水稻武粳15的成熟胚愈伤组织的转化,获得hpa1和hcm1转基因水稻植株,能够激活水稻防卫反应,并能表现出对稻瘟病、水稻纹枯病的抗性。另外进行小麦扬麦158的幼胚愈伤组织的转化,对已有的转化体系进行优化,经抗性筛选和初步PCR检测获得hcm1转基因小麦植株。
张迎春[10]（2010）在《转Bt基因水稻对环境微生物的影响》文中指出本研究以室外3个不同施肥水平下转Bt基因水稻明恢63（以下简称“Bt水稻”）及其亲本非转基因水稻明恢63（以下简称“CK水稻”）为材料,分别在2009年6月23日、2009年8月18日、2009年10月21日采集根系土壤样品,研究了土壤微生物的数量、碳源代谢活性。同时以温室栽培转Bt基因水稻及其亲本非转基因水稻为材料,研究了转Bt基因水稻植株的基本表型和生理生化性状及其抗病性变化。主要研究结果如下:1.Bt水稻的总气孔数量多于CK水稻,气孔大小与CK水稻一致。Bt水稻的花粉大小和纹饰与CK水稻无显着差异。2.Bt水稻和CK水稻叶片和根中的可溶性蛋白含量在生长期内的变化趋势一致,即在孕穗期含量达到最高,至成熟期含量又有所降低。相同时期同一施肥条件下Bt水稻和CK水稻叶片和根中的可溶性蛋白含量没有显着性差异。Bt水稻和CK水稻叶片和根中的可溶性糖含量在生长期内的变化趋势与可溶性蛋白相同。相同时期同一施肥条件下Bt水稻和CK叶片和根中的可溶性糖含量没有显着性差异。Bt水稻花粉中的可溶性蛋白含量在采集前几天显着低于CK水稻,最后一天显着高于CK水稻,Bt水稻花粉中的可溶性糖含量普遍高于CK水稻,并在采集的第一天、第三天、第五天有显着性差异。3.水稻的叶片,根,以及花粉均会表达不同量的Bt蛋白,其中叶片中Bt蛋白的表达量最多,根次之,花粉中Bt蛋白表达量少于叶片和根。根系分泌物中也检测到微量的Bt蛋白。4.采样时期、施肥量、水稻品种对微生物类群数量均有不同程度的影响。可培养的好氧或兼性厌氧细菌、真菌、厌氧性细菌、亚硝化细菌的数量随水稻的生长逐渐增加,至成熟期达最多,放线菌数量在孕穗期达最多;施肥量的加大增加了真菌、厌氧性细菌、反硝化细菌的数量;与CK水稻相比,Bt水稻的种植造成了土壤好氧或兼性厌氧细菌数量的显着增加;采样时期和施肥的交互作用对厌氧性细菌数量影响最大,水稻品种和施肥条件的交互作用以及采样时期、水稻品种和施肥条件的交互作用对亚硝化细菌数量影响最大。5.Bt水稻的种植不会造成根系土壤微生物活性的降低。短期施肥不会对土壤微生物活性造成显着变化。Bt水稻的种植不会造成土壤微生物群落代谢多样性的改变,CK水稻根系微生物对施肥更加敏感,合理的施肥可以提高微生物代谢多样性。水稻生长各时期不同处理条件水稻的根系土壤微生物利用的碳源数量和种类均不相同,微生物活性高的土壤中微生物利用的碳源种类和数量多。Bt水稻叶面微生物碳源代谢活性没有发生显着变化,其碳源代谢活性相对于CK水稻较弱,利用的总碳源数较少。Bt水稻不会造成其叶面微生物群落代谢多样性的显着改变。6.与亲本CK水稻相比, Bt水稻接种典型病原菌条斑病细菌后的发病率和病情指数均高于CK水稻,平均病斑长度显着大于CK水稻,植株未出现死亡;Bt水稻接种稻瘟病菌后的发病率和病情指数均高于CK水稻,植株未出现死亡。
二、转基因水稻“竹转68”病害发生风险的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因水稻“竹转68”病害发生风险的初步研究（论文提纲范文）
（1）中国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状与展望（论文提纲范文）
| 1 农业转基因生物环境安全检测标准 |
| 1.1 转基因玉米 |
| 1.1.1 目标性状功能效率的有效性 |
| 1.1.2 生存竞争能力 |
| 1.1.3 外源基因漂移 |
| 1.1.4 对生物多样性影响 |
| 1.2 转基因大豆 |
| 1.2.1 目标性状功能效率的有效性 |
| 1.2.2 生存竞争能力 |
| 1.2.3 外源基因漂移 |
| 1.2.4 对生物多样性影响 |
| 1.3 转基因水稻 |
| 1.3.1 目标性状功能效率的有效性 |
| 1.3.2 生存竞争能力 |
| 1.3.3 外源基因漂移 |
| 1.3.4 对生物多样性影响 |
| 1.4 转基因油菜 |
| 1.4.1 目标性状功能效率的有效性 |
| 1.4.2 生存竞争能力 |
| 1.4.3 外源基因漂移 |
| 1.4.4 对生物多样性影响 |
| 1.5 转基因棉花 |
| 1.5.1 目标性状功能效率的有效性 |
| 1.5.2 生存竞争能力 |
| 1.5.3 外源基因漂移 |
| 1.5.4 对生物多样性影响 |
| 1.6 转基因苜蓿 |
| 1.7 对非靶标生物影响 |
| 2 国内外农业转基因生物环境安全检测标准比较 |
| 2.1 标准框架 |
| 2.2 内容结构 |
| 3 展望 |
| 3.1 标准的个案性进一步增强 |
| 3.2 复合性状转基因植物环境安全检测 |
| 3.3 转基因植物对地下微生物群落的影响检测 |
| 3.4 风险低、熟悉度高的转基因植物环境安全检测 |
| 3.5 具备新性状、使用新技术研发的转基因植物环境安全检测 |
（2）FliD、FliK和SsbXoc蛋白参与稻黄单胞菌致病性的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 稻田生态系统中水稻白叶枯病的发生 |
| 1.1.1 水稻白叶枯病的分布与危害性 |
| 1.1.2 水稻白叶枯病的病原学 |
| 1.1.3 水稻白叶枯病发生的宏观生态条件 |
| 1.1.4 水稻白叶枯病发生的微观生态条件 |
| 1.1.5 水稻对白叶枯病的抗病性 |
| 1.2 稻黄单胞菌致病相关因子 |
| 1.2.1 胞外多糖 |
| 1.2.2 脂多糖 |
| 1.2.3 胞外酶类 |
| 1.2.4 Ⅲ型分泌系统及Ⅲ型效应子 |
| 1.2.5 生物膜 |
| 1.3 群体感应系统及c-di-GMP调控系统 |
| 1.3.1 群体感应及其信号分子 |
| 1.3.2 第二信使c-di-GMP |
| 1.4 植物病原细菌的分泌系统及鞭毛Ⅲ型分泌系统 |
| 1.4.1 植物病原细菌的分泌系统 |
| 1.4.2 鞭毛的结构和功能 |
| 1.4.3 鞭毛Ⅲ型分泌系统 |
| 1.4.4 鞭毛Ⅲ型分泌蛋白 |
| 1.5 细菌趋化性 |
| 1.5.1 细菌趋化性的发现 |
| 1.5.2 细菌趋化性的分子机制 |
| 1.5.3 趋化性在植物病原菌致病机理中的作用 |
| 1.6 稻黄单胞菌激发的植物非寄主抗性 |
| 1.6.1 稻黄单胞菌激发非寄主植物产生过敏反应 |
| 1.6.2 过敏反应激发子 |
| 1.6.3 植物过敏反应的生理学和遗传学基础 |
| 1.6.4 过敏反应激发子在农业上的潜在应用价值 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 1.7.1 研究目的与意义 |
| 1.7.2 研究技术路线 |
| 第二章 FliD和 FliK参与稻黄单胞菌致病性的机理研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试菌株及质粒 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 培养基及试剂的配置 |
| 2.1.4 细菌培养条件及抗生素的使用 |
| 2.1.5 所用植物材料及其生长条件 |
| 2.1.6 所用试剂及仪器 |
| 2.1.7 质粒的提取 |
| 2.1.8 DNA遗传操作体系 |
| 2.1.9 稻黄单胞菌基因组DNA的提取 |
| 2.1.10 大肠杆菌遗传转化 |
| 2.1.11 稻黄单胞菌遗传转化 |
| 2.1.12 III型分泌信号检测载体的构建 |
| 2.1.13 稻黄单胞菌无标记基因敲除 |
| 2.1.14 稻黄单胞菌功能互补菌株的获得 |
| 2.1.15 蛋白的表达与纯化 |
| 2.1.16 鞭毛Ⅲ型分泌蛋白的表达和纯化 |
| 2.1.17 酵母转化 |
| 2.1.18 Western blot |
| 2.1.19 Southern blot |
| 2.1.20 RNA提取及其反转录 |
| 2.1.21 荧光定量PCR |
| 2.1.22 稻黄单胞菌鞭毛形态观察 |
| 2.1.23 稻黄单胞菌生长能力测定 |
| 2.1.24 稻黄单胞菌生物膜及沉降性测定 |
| 2.1.25 稻黄单胞菌游动性测定 |
| 2.1.26 稻黄单胞菌趋化性测定 |
| 2.1.27 黄单胞菌胞外多糖产量测定 |
| 2.1.28 水稻和烟草的抗病性测定 |
| 2.1.29 烟草中氧化氢含量的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 FliD和 FliK两鞭毛蛋白在基因组中的位置分析 |
| 2.2.2 FliD和 FliK两鞭毛蛋白前50 个氨基酸序列分析 |
| 2.2.3 两鞭毛蛋白敲除突变体的获得 |
| 2.2.4 两鞭毛蛋白突变体生长能力测定 |
| 2.2.5 两鞭毛蛋白突变体鞭毛形态电镜观察 |
| 2.2.6 两鞭毛蛋白突变体游动性测定 |
| 2.2.7 两鞭毛蛋白突变体对葡萄糖的趋化能力测定 |
| 2.2.8 两鞭毛蛋白突变体生物膜及沉降性测定 |
| 2.2.9 两鞭毛蛋白突变体胞外多糖产量测定 |
| 2.2.10 两鞭毛蛋白突变体致病力检测 |
| 2.2.11 两鞭毛蛋白突变体接种水稻后抗病相关基因表达水平分析 |
| 2.2.12 两鞭毛蛋白基因突变后不影响Xoo激发烟草产生HR的能力 |
| 2.2.13 两鞭毛蛋白突变体接种烟草后抗性相关基因表达水平分析 |
| 2.2.14 两鞭毛蛋白突变体接种烟草后H_2O_2含量检测分析 |
| 2.2.15 两鞭毛蛋白突变后不影响FlgD的分泌 |
| 2.2.16 酵母双杂交方法钓取FliD在水稻中的互作因子 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 过敏反应激发蛋白Ssb_(Xoc)转基因烟草抗逆性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试菌株及质粒 |
| 3.1.2 引物设计与合成 |
| 3.1.3 培养基及试剂的配置 |
| 3.1.4 细菌培养条件及抗生素的使用 |
| 3.1.5 所用植物材料及其生长条件 |
| 3.1.6 所用试剂及仪器 |
| 3.1.7 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 3.1.8 烟草基因组DNA的提取 |
| 3.1.9 Southern blot |
| 3.1.10 RNA提取及其反转录 |
| 3.1.11 RT-PCR |
| 3.1.12 荧光定量PCR |
| 3.1.13 蛋白表达与纯化 |
| 3.1.14 转基因烟草表型测定 |
| 3.1.15 DAB染色 |
| 3.1.16 烟草过氧化氢含量的测定 |
| 3.1.17 细菌生长量测定 |
| 3.1.18 烟草发芽率的测定 |
| 3.1.19 烟草叶绿素含量的测定 |
| 3.1.20 烟草MDA含量的测定 |
| 3.1.21 烟草脯氨酸含量的测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Ssb_(Xoc)转基因烟草的获得 |
| 3.2.2 Ssb_(Xoc)转基因烟草生长表型测定 |
| 3.2.3 转基因烟草接种蛋白和病原菌后ROS水平分析 |
| 3.2.4 转基因烟草接种Pst DC3000 后抗性相关基因表达水平分析 |
| 3.2.5 转基因烟草接种野火病菌后抗病能力分析 |
| 3.2.6 盐和干旱胁迫下转基因烟草的发芽率统计分析 |
| 3.2.7 盐和干旱胁迫下转基因烟草MDA含量分析 |
| 3.2.8 盐和干旱胁迫下转基因烟草脯氨酸含量分析 |
| 3.2.9 盐胁迫下转基因烟草叶绿素含量分析 |
| 3.2.10 盐和干旱胁迫下转基因烟草抗性相关基因表达水平分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 主要创新点 |
| 4.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ssb_(Xoc)受体ADF转基因水稻和烟草的鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 供试菌株及质粒 |
| 1.1.2 引物设计与合成 |
| 1.1.3 细菌培养条件及抗生素的使用 |
| 1.1.4 所用仪器及试剂 |
| 1.1.5 转基因水稻和烟草的获得 |
| 1.1.6 植物接种实验 |
| 1.1.7 RNA提取及其反转录 |
| 1.1.8 荧光定量PCR |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 ADF7 转基因水稻的鉴定 |
| 1.2.2 ADF2 转基因烟草的鉴定 |
| 1.2.3 ADF7 转基因水稻接种病原菌后抗病相关基因表达水平分析 |
| 1.2.4 ADF2 转基因烟草接种病原菌后抗性相关基因表达水平分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间(待)发表的学术论文 |
（3）两种抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻的杂草化潜力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 全球复合性状转基因作物概况 |
| 1.1 全球复合性状转基因作物种植规模 |
| 1.2 复合基因的概念及获得方法 |
| 1.3 不同国家地区对复合性状转基因作物的管理 |
| 2 转基因植物杂草化 |
| 2.1 杂草特征 |
| 2.2 转基因植物杂草化的途径 |
| 3 转基因水稻杂草化的研究进展 |
| 3.1 转基因水稻自身杂草化 |
| 3.2 转基因水稻的基因漂移 |
| 3.3 转基因水稻与野生近缘种的杂交后代的适合度 |
| 第二章 复合性状转基因水稻自身杂草化的风险评估 |
| 第一节 复合性状转基因水稻B2A68自身杂草化的风险评估 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第二节 复合性状转基因水稻T1c-19自身杂草化的风险评估 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验设计 |
| 4 结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 第三章 复合性状转基因水稻与杂草稻杂交F1适合度研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 人工杂交 |
| 2.3 杂种的鉴定 |
| 2.4 田间试验设计 |
| 2.5 测定的指标 |
| 2.6 数据分析及相对适合度计算 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 杂交亲和性比较 |
| 3.2 杂种的鉴定 |
| 3.3 田间靶标害虫的发生情况 |
| 3.4 单种条件下,复合转基因对栽培稻及杂草稻群体适合度的影响 |
| 3.5 混种情况下,复合转基因对栽培稻及杂草稻群体适合度的影响 |
| 3.6 选择压对T1c-19及抗性F1适合度的影响 |
| 3.7 落粒率 |
| 4 讨论 |
| 全文结论与创新点 |
| 一 全文结论 |
| 二 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）转基因抗除草剂水稻Bar68-1田间主要病害发生情况调查初报（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验地概况 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 转基因水稻试验安全控制措施 |
| 1.3.2 转基因水稻试验田间管理 |
| 1.3.3 转基因抗除草剂水稻对水稻主要病害的影响 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因抗除草剂水稻田间纹枯病发生情况 |
| 2.2 转基因抗除草剂水稻田间白叶枯病、稻瘟病和条纹叶枯病发生情况 |
| 2.3 转基因抗除草剂水稻田间稻曲病、紫鞘病、叶鞘腐败病发生情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对田间主要昆虫种群的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻主要害虫及稻田节肢动物群落研究 |
| 1.1 水稻主要害虫的发生与为害 |
| 1.2 稻田节肢动物群落研究 |
| 2 转基因水稻研究现状 |
| 2.1 转基因抗虫水稻研究 |
| 2.2 转基因抗病水稻研究 |
| 2.3 抗除草剂水稻研究 |
| 2.4 转基因抗逆水稻研究 |
| 3 转Bt基因水稻研究现状 |
| 3.1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫机理 |
| 3.2 转Bt基因水稻的发展概况 |
| 4 转Bt基因水稻生物安全性评价研究进展 |
| 4.1 转Bt基因水稻食品安全性评价 |
| 4.2 转Bt基因水稻生态安全性评价 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 本研究的技术路线图 |
| 第二章 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对鳞翅目害虫种群的影响研究 |
| 第一节 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对稻纵卷叶螟的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试水稻材料 |
| 1.2 昆虫的收集与饲养 |
| 1.3 田间试验小区设置及田间管理 |
| 1.4 稻纵卷叶螟幼虫室内存活率测定 |
| 1.5 稻纵卷叶螟半自然种群生命表组建 |
| 1.6 田间调查取样方法 |
| 1.7 稻纵卷叶螟成虫产卵选择性测定 |
| 1.8 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 稻纵卷叶螟幼虫室内存活率 |
| 2.2 稻纵卷叶螟半自然种群生命表 |
| 2.3 稻纵卷叶螟产卵选择性 |
| 2.4 2010年与2011年稻纵卷叶螟在转基因和非转基因水稻上的种群动态 |
| 2.5 2010年与2011年稻纵卷叶螟在转基因和非转基因水稻上致害力差异 |
| 3 讨论 |
| 第二节 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对大螟与二化螟种群的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试水稻材料 |
| 1.2 昆虫的收集与饲养 |
| 1.3 田间试验小区设置及田间管理 |
| 1.4 化螟田间自然种群不完全生命表的组建 |
| 1.5 田间调查取样方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 化螟田间自然种群不完全生命表 |
| 2.2 2010年与2011年大螟与二化螟在转基因和非转基因水稻上的种群动态 |
| 2.3 2010年与2011年大螟与二化螟在转基因和非转基因水稻上的致害力差异 |
| 3 讨论 |
| 第三章 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对非靶标昆虫种群的影响研究 |
| 第一节 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对褐飞虱和白背飞虱的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试水稻材料 |
| 1.2 昆虫的收集与饲养 |
| 1.3 田间试验小区设置及田间管理 |
| 1.4 褐飞虱与白背飞虱的成虫选择性 |
| 1.5 稻飞虱的田间调查方法 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 褐飞虱与白背飞虱的成虫选择性 |
| 2.2 转Bt水稻对褐飞虱发生量的影响 |
| 2.3 转Bt水稻对白背飞虱发生量的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二节 转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对稻田节肢动物群落的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试水稻材料 |
| 1.2 田间试验小区设置及田间管理 |
| 1.3 调查及分类方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转Bt水稻对稻田捕食性天敌昆虫亚群落数量的影响 |
| 2.2 转Bt水稻对稻田寄生性天敌昆虫亚群落数量的影响 |
| 2.3 转Bt水稻对稻田主要非靶标害虫亚群落数量的影响 |
| 2.4 转Bt水稻对稻田节肢动物群落数量的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的研究论文 |
（6）几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 水稻转基因研究的发展及现状 |
| 1.2 水稻抗真菌病害基因工程研究 |
| 1.3 作物转几丁质酶基因研究进展 |
| 1.4 根癌农杆菌介导的植物遗转转化 |
| 1.5 基因枪转化法的应用 |
| 1.6 本文研究的背景、目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 水稻吉农大808再生体系的建立 |
| 3.2 植物表达载体p33T1和p33AT的构建 |
| 3.3 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 3.4 基因枪法转化水稻愈伤 |
| 3.5 抗性再生植株分子检测 |
| 3.6 水稻的抗除草剂鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻品种吉农大808再生体系的建立 |
| 4.2 载体构建中内含子对基因表达的影响 |
| 4.3 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 4.4 基因枪法转化水稻愈伤 |
| 4.5 转基因水稻抗除草剂鉴定 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读期成果 |
（7）转McCHIT1、alfAFP基因及其双价基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物的抗病性 |
| 1.1.1 植物的被动抗病性 |
| 1.1.2 植物的主动抗病性 |
| 1.2 植物抗病的分子机制 |
| 1.2.1 植物抗病基因的种类和功能 |
| 1.2.2 植物防卫反应基因的种类和功能 |
| 1.2.3 植物病原菌无毒基因的种类和功能 |
| 1.2.4 无毒基因和抗病基因互作的分子机制 |
| 1.2.5 植物抗病反应的信号传导 |
| 1.3 水稻抗病基因工程研究 |
| 1.3.1 水稻抗病基因工程的基础研究 |
| 1.3.2 抗真菌病害基因工程 |
| 1.3.3 抗细菌病害基因工程 |
| 1.3.4 抗病毒病害基因工程 |
| 1.3.5 抗线虫病基因工程 |
| 1.3.6 水稻抗病基因工程的展望 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的和意义 |
| 2.2 技术路线 |
| 第三章 转McCHIT1基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究 |
| 3.1 供试材料 |
| 3.1.1 水稻材料 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.2.1 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)菌株及来源 |
| 3.1.2.2 纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuhu)菌株及来源 |
| 3.1.3 培养基和缓冲液的配制 |
| 3.1.4 生化试剂 |
| 3.1.5 主要仪器、设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 转McCHIT1基因水稻株系的稻瘟病抗性研究 |
| 3.2.1.1 苗瘟抗性鉴定 |
| 3.2.1.2 叶瘟、穗颈瘟抗性鉴定 |
| 3.2.1.3 转基因植株的GUS组织化学检测 |
| 3.2.1.4 稻瘟病抗性优良转McCHIT1基因水稻株系的筛选 |
| 3.2.1.5 不同抗病水平转McCHIT1基因水稻稳定株系的抗谱测定 |
| 3.2.2 转McCHIT1基因水稻株系的纹枯病抗性研究 |
| 3.2.2.1 纹枯病抗性鉴定 |
| 3.2.2.2 纹枯病抗性优良转McCHIT1基因水稻株系的筛选 |
| 3.2.2.3 转基因植株的GUS检测 |
| 3.2.3 几丁质酶活性的测定 |
| 3.2.4 抗病性优良转基因稳定株系的主要农艺性状考察 |
| 3.2.5 抗病性优良转基因稳定株系所配杂交组合的稻瘟病抗性鉴定和主要农艺性状考察 |
| 3.2.6 数据统计方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转McCHIT1基因水稻的抗病性研究 |
| 3.3.1.1 T3代转McCHIT1基因株系的抗病性 |
| 3.3.1.2 T4、T5代转McCHIT1基因株系的抗病性及优良抗病株系的筛选 |
| 3.3.1.3 抗病性优良转McCHIT1基因水稻株系的纯合性复检 |
| 3.3.1.4 不同抗病水平转McCHIT1基因水稻稳定株系对稻瘟病菌的抗谱分析 |
| 3.3.1.5 抗病性优良转McCHIT1基因水稻株系的几丁质酶活性 |
| 3.3.1.6 抗病性优良转McCHITI基因稳定株系的主要农艺性状 |
| 3.3.1.7 抗病性优良转McCHIT1基因稳定株系所配组合的稻瘟病抗性及其他主要农艺性状 |
| 第四章 转alfAFP基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究 |
| 4.1 供试材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转alfAFP基因水稻的抗病性研究 |
| 4.2.1.1 T_3代转alfAFP基因株系的抗病性 |
| 4.2.1.2 T_4、T_5代转alfAFP基因株系的抗病性及抗病性优良株系的筛选 |
| 4.2.1.3 抗病性优良转alfAFP基因水稻株系的纯合性复检 |
| 4.2.1.4 不同抗病水平转alfAFP基因水稻稳定株系对稻瘟病菌的抗谱分析 |
| 4.2.1.5 抗病性优良转alfAFP基因水稻稳定株系的主要农艺性状 |
| 4.2.1.6 抗病性优良转alfAFP基因稳定株系所配组合的稻瘟病抗性及其主要农艺性状 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 转McCHIT1-alfAFP双价基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转McCHIT1-alfAFP双价基因水稻的抗病性研究, |
| 5.2.1.1 T3代转McCHIT1-alfAFP基因株系的抗病性及其变异 |
| 5.2.1.2 T4、T5代转McCHIT1-alfAFP基因株系的抗病性及优良抗病株系的筛选 |
| 5.2.1.3 抗病性优良转McCHIT1-alfAFP基因水稻株系的纯合性复检 |
| 5.2.1.4 不同抗病水平转McCHIT1-alfAFP基因水稻稳定株系对稻瘟病菌的抗谱分析 |
| 5.2.1.5 抗病性优良转McCHIT1-alfAFP双价基因水稻株系的主要农艺性状 |
| 5.2.1.6 抗病性优良转McCHIT1-alfAFP基因稳定株系所配组合的稻瘟病抗性及其他主要农艺性状表现 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 抗病转基因稳定株系的筛选 |
| 6.1.1 抗稻瘟病转基因稳定株系的筛选 |
| 6.1.2 抗纹枯病转基因稳定株系的筛选 |
| 6.2 抗病转基因稳定株系的苗瘟、叶瘟和穗颈瘟抗性的相关性 |
| 6.3 苦瓜几丁质酶基因McCHIT1的广谱抗性及其抗病性优良转基因水稻株系的应用前景 |
| 6.4 苜蓿防御素基因alfAFP的广谱抗性及其抗病性优良转基因水稻株系的应用前景 |
| 6.5 McCHIT1基因和alfFP基因在转基因水稻植株中的协同作用 |
| 6.6 转基因植株主要农艺性状的变异 |
| 第七章 主要结论与创新点及下一步研究设想 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.1.1 转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻各世代的抗病性变异 |
| 7.1.2 稻瘟病抗性优良转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的筛选及主要农艺性状的表现 |
| 7.1.3 稻瘟病抗性优良转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系所配组合的稻瘟病抗性及其主要农艺性状表现 |
| 7.1.4 纹枯病优良抗性转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的筛选 |
| 7.1.5 不同转McCHIT1基因、alfAFP基因及其双价基因水稻稳定株系的抗病性强弱分化的原因分析 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 下一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要缩略词 |
| 附录B 转基因T6代株系抗谱测定所用的稻瘟病菌有效菌株编号 |
| 致谢 |
| 发表论文及参加课题一览表 |
（8）基因工程培育抗病（稻瘟病、条纹叶枯病）转基因水稻（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一.基因工程培育抗稻瘟病水稻的研究进展 |
| 1. 水稻稻瘟病及其病菌的研究概况 |
| 1.1 水稻稻瘟病介绍 |
| 1.2 水稻稻瘟病菌概述 |
| 2. 对水稻稻瘟病的抗性研究进展 |
| 2.1 水稻稻瘟病抗性及抗性基因概述 |
| 2.2 抗稻瘟病相关基因及其产物功能研究 |
| 3. 水稻抗稻瘟病育种研究 |
| 3.1 常规抗病育种 |
| 3.2 基因工程育种 |
| 3.3 分子标记辅助选择育种 |
| 二、基因工程培育抗条纹叶枯病水稻的研究进展 |
| 1. 水稻条纹叶枯病及其病毒的研究概况 |
| 1.1 水稻条纹叶枯病概况 |
| 1.2 条纹叶枯病毒概况 |
| 2. 水稻条纹叶枯病的防治 |
| 3. RNA 干扰机理概述 |
| 3.1 RNA 干扰的发现 |
| 3.2 RNA 干扰的作用机制 |
| 4. RNA干扰技术在抗病毒育种中的应用 |
| 三、无选择标记系统培育转基因植物的概况及安全性评价 |
| 1. 无选择标记系统培育转基因植物概况 |
| 2. 无选择标记系统培育转基因植物的方法概述 |
| 2.1 共转化系统 |
| 2.2 转座子系统 |
| 2.3 位点特异性重组系统 |
| 3. 转基因植物的安全性评价策略 |
| 四、本研究的目的意义 |
| 第二部分 实验论文 |
| 第一章：抗稻瘟病转基因水稻的培育 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 重要的试剂及溶液 |
| 1.4 植物培养材料 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 常用培养基的配制 |
| 2.2 水稻转化培养基的配制 |
| 2.3 常用试剂及溶液的配制 |
| 2.4 Trizol 试剂提取小萝卜总 RNA |
| 2.5 CTAB-LiCl 法提取花生叶片总RNA |
| 2.6 RNA 的反转录实验 |
| 2.7 引物设计及相关的PCR 扩增 |
| 2.8 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.9 PCR 扩增产物的回收 |
| 2.10 回收产物与pMD18-T 载体连接 |
| 2.11 克隆载体的构建 |
| 2.12 植物双元表达载体的构建 |
| 2.13 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定 |
| 2.14 水稻转化 |
| 2.15 提取水稻叶片 DNA |
| 2.16 转基因苗的检测、鉴定 |
| 2.17 TCA-丙酮沉淀法提取植物总蛋白 |
| 2.18 稻瘟病菌的培养 |
| 2.19 体外抑菌性鉴定 |
| 2.20 转基因植株室内稻瘟病菌抗种性鉴定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 Rs-AFP1 基因和PNRSC 基因的克隆 |
| 3.2 Rs-AFP1 基因和PNRSC 基因生物信息学分析 |
| 3.3 Rs-AFP1 基因和PNRSC 基因中间载体的构建 |
| 3.4 用于植物转化的双元表达载体的构建 |
| 3.5 农杆菌介导的水稻转化 |
| 3.6 转基因阳性植株的鉴定 |
| 3.7 田间转基因植株对稻瘟病菌抗性的初步观察 |
| 3.8 转基因植株体外抑菌性鉴定 |
| 3.9 转基因植株室内稻瘟病菌接种性鉴定结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 硫堇蛋白类基因Rs-AFP1 的结构及其在抗稻瘟病中的作用 |
| 4.2 白藜芦醇合成酶基因PNRSC 的结构及其在抗稻瘟病中的作用 |
| 4.3 硫堇蛋白类基因Rs-AFP1 及白藜芦醇合成酶基因PNRSC 在水稻抗稻瘟病育种中的展望 |
| 4.4 Ubi 启动子及bar 基因为选择标记的优势 |
| 4.5 抗稻瘟病育种现状及前景 |
| 5. 本章小结 |
| 第二章：抗条纹叶枯病转基因水稻的培育 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 感染水稻条纹叶枯病的水稻总RNA 的提取和第一链cDNA 的合成 |
| 2.3 五条RSV 干扰片段的获得 |
| 2.4 pUC19 改造的RNA 干扰载体的构建 |
| 2.5 pCAMBIA1300 改造的植物双元表达载体的构建 |
| 2.6 农杆菌介导的水稻的遗传转化及转基因植株的获得 |
| 2.7 转基因植株的鉴定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 五个RSV 干扰片段的克隆及酶切鉴定 |
| 3.2 pUC19-RNAi-OsRSV(1-5)系列干扰载体的构建 |
| 3.3 pCA1300-Ubi-RNAi-OsRSV(1-5)系列植物双元表达载体的构建 |
| 3.4 农杆菌介导的水稻转化 |
| 3.5 转基因植株的鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 RNA干扰、玉米泛素Ubi启动子及bar基因在水稻抗病毒方面的应用 |
| 4.2 抗条纹叶枯病育种现状及前景 |
| 5. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 附录一 水稻培养基母液的配置 |
| 附录二 水稻转化培养基的配置 |
| 硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 水稻-水稻条斑病菌模式互作系统研究进展 |
| 1 稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和水稻细菌性条斑病(Bacterial Leaf Streak) |
| 2 水稻条斑病菌小种多样性 |
| 3 水稻条斑病菌的毒性和致病性 |
| 4 水稻黄单胞菌中非寄主抗性因子的发掘与利用 |
| 5 展望 |
| 第二章 转基因植物研究进展 |
| 1 转基因植物研究概况 |
| 2 植物转基因方法 |
| 3 植物转基因在农业中的应用 |
| 4. 转基因植物检测 |
| 5 转基因植物生物安全性 |
| 6 展望 |
| 研究内容 |
| 第一章 水稻条斑病菌hrp-hrc-hpa基因在毒性和致病性中的功能评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 水稻条斑病菌hrp基因簇的转录表达和调控分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Hpa2与HrpF互作决定水稻条斑病菌在水稻上的致病性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 水稻条斑病菌hpa1基因的转录表达和激发非寄主HR机理分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 PIP-gfp策略鉴定水稻条斑病菌的HrpX调节子 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 抗菌和杀菌功能融合基因hcm1转基因水稻的遗传转化和检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 附录 hcm1转基因小麦的体系建立和再生植株的获得 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 本论文主要创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）转Bt基因水稻对环境微生物的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因水稻研究进展 |
| 1.1.1 转基因抗虫水稻研究 |
| 1.1.2 转基因抗病水稻研究 |
| 1.1.3 转基因抗逆水稻研究 |
| 1.2 转 Bt 基因抗虫水稻研发进展 |
| 1.2.1 Bt 的结构与致病机理 |
| 1.2.2 转Bt 基因水稻的研发 |
| 1.3 转 Bt 基因水稻生物安全性研究进展 |
| 1.3.1 转Bt 基因水稻食品安全性问题 |
| 1.3.2 转Bt 基因水稻生态安全性问题 |
| 1.3.3 转Bt 基因水稻生理生化性状变化问题 |
| 1.4 水稻细菌性条斑病和稻瘟病及其抗性研究进展 |
| 1.4.1 水稻细菌性条斑病及其抗性 |
| 1.4.2 水稻稻瘟病及其抗性 |
| 第二章 转 Bt 基因水稻的生理生化特性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 水稻叶片表面观察 |
| 2.1.3 水稻花粉表面观察 |
| 2.1.4 无菌水培水稻 |
| 2.1.5 水稻根系分泌物的收集 |
| 2.1.6 水稻各组织中Bt 蛋白含量的测定 |
| 2.1.7 水稻各组织中可溶性蛋白和可溶性糖含量的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转Bt 基因水稻与其亲本水稻叶表面气孔及花粉性质的研究 |
| 2.2.2 转Bt 基因水稻与亲本水稻各组织中Bt 蛋白的表达动态研究 |
| 2.2.3 转Bt 基因水稻与亲本水稻各组织中可溶性蛋白和糖含量研究 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 转Bt 基因水稻与其亲本水稻叶表面气孔及花粉性质的研究 |
| 2.3.2 转Bt 基因水稻与亲本水稻各组织中Bt 蛋白的表达动态研究 |
| 2.3.3 转Bt 基因水稻与亲本水稻各组织中可溶性蛋白和糖含量研究 |
| 第三章 转 Bt 基因水稻对土壤微生物群落及叶面微生物群落的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 水稻室外栽培 |
| 3.1.2 土壤样品采集 |
| 3.1.3 土壤微生物数量测定 |
| 3.1.4 土壤微生物Biolog 分析 |
| 3.1.5 叶面微生物Biolog 分析 |
| 3.1.6 数据处理方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转Bt 基因水稻对根系土壤可培养微生物数量的影响 |
| 3.2.2 转Bt 基因水稻对根系土壤微生物碳源代谢的影响 |
| 3.2.3 转Bt 基因水稻对其叶面微生物碳源代谢的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 转Bt 基因水稻种植对根系土壤微生物群落数量及碳源代谢的影响 |
| 3.3.2 转Bt 基因水稻对叶面微生物群落碳源代谢的影响 |
| 第四章 转 Bt 基因水稻对主要病原微生物的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 水稻病原菌接种液的制备 |
| 4.1.4 转Bt 基因水稻及其亲本对水稻条斑病细菌的抗性测定 |
| 4.1.5 转Bt 基因水稻及其亲本对稻瘟病菌的抗性测定 |
| 4.1.6 统计方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转Bt 基因水稻及其亲本对条斑病细菌的抗性 |
| 4.2.2 转Bt 基因水稻及其亲本对稻瘟病菌的抗性 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
四、转基因水稻“竹转68”病害发生风险的初步研究（论文参考文献）
- [1]中国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状与展望[J]. 梁晋刚,张开心,张旭冬,王颢潜,陈子言,刘鹏程,张秀杰. 中国油料作物学报, 2021(01)
- [2]FliD、FliK和SsbXoc蛋白参与稻黄单胞菌致病性的机理研究[D]. 曹燕燕. 上海交通大学, 2019(06)
- [3]两种抗虫抗除草剂复合性状转基因水稻的杂草化潜力研究[D]. 黄鹞. 南京农业大学, 2015(06)
- [4]转基因抗除草剂水稻Bar68-1田间主要病害发生情况调查初报[J]. 蒋显斌,黄芊,凌炎,陈玉冲,龙丽萍,黄凤宽,罗群昌,肖国樱. 南方农业学报, 2014(11)
- [5]转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因抗虫水稻对田间主要昆虫种群的影响研究[D]. 李志毅. 南京农业大学, 2012(01)
- [6]几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究[D]. 关峰. 吉林农业大学, 2012(04)
- [7]转McCHIT1、alfAFP基因及其双价基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究[D]. 张长伟. 西南大学, 2011(06)
- [8]基因工程培育抗病（稻瘟病、条纹叶枯病）转基因水稻[D]. 李海青. 山东师范大学, 2011(08)
- [9]水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究[D]. 李玉蓉. 南京农业大学, 2010(05)
- [10]转Bt基因水稻对环境微生物的影响[D]. 张迎春. 南京林业大学, 2010(05)