一、堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养（论文文献综述）
尹理君,廖申权,孙铭飞,宋忠峰,侯晓礁,李福元,吕敏娜,吴彩艳,李娟,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,于林增,肖文婉,张健騑,戚南山,顾有方[1]（2021）在《鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种危害严重的肠道寄生原虫病,每年给全球养鸡业造成巨大经济损失。活疫苗是替代抗球虫药防控鸡球虫病的有效手段,而减毒活疫苗安全性能更高,免疫原性更好,更加稳定,有效防控鸡球虫病的暴发。通过理化致弱、鸡胚传代和早熟选育方法诱导虫株毒力减弱是常用的鸡球虫毒力致弱手段,但目前尚缺乏相关方法的系统性综述。鉴于此,为综合了解当前鸡球虫毒力致弱方法的研究进展及其在鸡球虫病弱毒活疫苗的应用研究,本文通过查阅、搜集和整理国内外文献相关研究内容,对鸡球虫强毒株致弱措施和方法及其在鸡球虫病弱毒苗应用现状进行综述,为新一代鸡球虫病弱毒活疫苗的研究提供理论依据。
程振扬[2]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中研究表明鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
赵宁宁[3]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中研究说明鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
余水兰[4]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
华恩玉[5]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
王黎霞,黄芳,张建军,安健[6]（2020）在《堆型艾美耳球虫体外培养细胞的筛选及其发育研究》文中研究表明【目的】为了选择适宜堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）培养的细胞。【方法】利用纯化的E.acervulina子孢子与不同细胞（非洲绿猴肾细胞、牛肾传代细胞、兔肾传代细胞-15、鸡胚成纤维细胞及鸡肾细胞）共培养,比较E.acervulina在原代细胞和传代细胞中的入侵及发育情况。【结果】37℃比41℃适宜进行E.acervulina的体外培养;5种细胞中,牛肾传代细胞入侵率最高;继续培养,牛肾传代细胞中E.acervulina可以形成第二代裂殖体,而非洲绿猴肾细胞、兔肾传代细胞-15只能发育到第一代裂殖体阶段,鸡胚成纤维原代细胞和鸡肾原代细胞中E.acervulina有第一代裂殖子的释放,但未再次入侵,并且鸡胚成纤维原代细胞和鸡肾原代细胞不易传代,5种细胞中,牛肾传代细胞最适宜E.acervulina培养;与牛肾传代细胞共培养1 h子孢子附着于细胞表面,2 h子孢子入侵,子孢子入侵后24 h形成第一代滋养体,52 h后形成第一代成熟裂殖体,60 h第一代裂殖子释放出细胞,72 h后形成第二代裂殖体。【结论】在非洲绿猴肾传代细胞、牛肾传代细胞、兔肾传代细胞-15、鸡胚成纤维原代细胞及鸡原代细胞这5种细胞中,牛肾传代细胞是培养E.acervulina的最适宜细胞,在其中可以发育到第二代成熟裂殖体。
刘国辉[7]（2019）在《不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究》文中研究表明鸡球虫病是危害严重的寄生虫病之一,以往主要依靠药物来进行防治,但是耐药性的产生较快,食品安全要求越来越高,尤其是欧盟要求肉鸡不使用球虫药,依靠免疫方法来控制鸡球虫病,逐渐成为出口欧盟肉鸡球虫病防控的主要手段。本试验通过对规模化地面养殖商品肉鸡,使用不同球虫疫苗、不同免疫剂量、不同免疫方式与用药对照组比较。利用每克粪便球虫卵囊数值（OPG）进行计数,球虫肉眼病变评分,肠道损伤肉眼病变评分等方法,对免疫后鸡的卵囊排出情况、感染程度和肠道损伤程度进行对比评估。通过对成活率、单只均重、料肉比、欧洲指数、ND、AI抗体等指标进行数据分析,对比鸡只健康状况和生产成绩。筛选出最佳免疫方案,为将来商品肉鸡正确球虫免疫提供第一手数据支持。试验结果表明:（1）Y疫苗1倍量0天喷雾组与Y疫苗0.6倍量0天喷雾组,两组均在免疫后19天出现了OPG均值最高峰;但0.6倍量组峰值低,高峰出现后,OPG均值下降缓慢,又在免疫后23天和33天出现两个较小峰值,因此,1倍量OPG均值趋势明显好于0.6倍量。从球虫眼观病变评分、肠道眼观病变评分结果看1倍量与0.6倍量差异不显着,说明损伤与剂量关系不大,可能与疫苗本身毒力关系更大。从生产成绩方面Y疫苗1倍量与0.6倍量差异不显着。（2）Z疫苗1倍量3天拌料组嗉囊饱食率（91%±2.22%）高于Y疫苗0天喷雾组舌尖红染率（81%±3.11%）,拌料组有更多的鸡可以接触到疫苗,每只鸡可以接触到更多的疫苗。Z疫苗1倍量3天拌料组免疫后17天出现OPG高峰,早于Y疫苗1倍量喷雾或0.6倍量喷雾组免疫后19天出现OPG高峰,更有利于尽早建立免疫力,后期补偿性生长。从球虫眼观病变评分、肠道眼观病变评分结果看Z疫苗1倍量3天拌料组病变程度较Y疫苗1倍量或0.6倍量喷雾组轻,进一步说明3日龄拌料组好于0日龄喷雾组,同时,说明Z疫苗本身毒力低于Y疫苗,符合供应商提供的说明。从生产成绩看,Z疫苗成绩优于Y疫苗。（3）各组出栏成活率为92.19%±2.93%,93.57%±1.33%,92.19%±5.17%,92.76±4.32%。各组间成活率差异均不显着（P>0.05）,说明球虫免疫对成活率几乎没有影响。（4）各组ND抗体分别为7.21±0.67,6.70±1.22,7.01±1.01,7.06±0.60;H9抗体分别为7.22±1.23;6.94±1.55;6.53±1.29;6.95±0.90。各组间ND、H9抗体差异均不显着（P>0.05）,说明球虫免疫对出栏前体液免疫ND、H9抗体几乎没有影响。（5）使用活疫苗进行球虫免疫快大型商品肉鸡,可以取得满意效果,防治球虫感染效果优于用药对照组。但从单只均重（试验组低于对照组0.27kg,0.23kg,0.09kg）、料肉比（试验组高于对照组0.14,0.13,0.09）、欧洲指数（试验组低于对照组50.2,46.4,30.5）等生产成绩看,用药对照组较疫苗免疫组优势明显。
胡伟高[8]（2019）在《堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究》文中研究指明鸡球虫病是严重危害鸡群健康的重大疾病之一,世界公认的鸡球虫种类有7个种,其中堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）在7种鸡球虫中最为流行,也是我国常见的鸡球虫种类之一。本论文对堆型艾美耳球虫早熟疫苗株的不同免疫方式和免疫剂量进行免疫效果比较,为了解鸡抗球虫免疫力建立过程提供依据。第一部分研究为观察堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫与脉冲免疫接种鸡后的卵囊排泄规律。低剂量涓滴免疫组鸡于1日龄开始每天接种20个卵囊/羽,连续免疫接种21天;高剂量涓滴免疫组鸡于1～7日龄时每天接种20个卵囊/羽,之后于8～21日龄时每天接种1710个卵囊/羽。低剂量脉冲免疫组于3日龄、10日龄、17日龄时分别每只鸡免疫140个卵囊/羽,共免疫接种3次;高剂量脉冲免疫组鸡于3日龄时每只鸡免疫140个卵囊/羽,之后于10日龄和17日龄时每羽鸡再分别接种1710个卵囊/羽,共免疫接种3次。两个涓滴免疫组于4日龄开始连续采集粪便监测、记录卵囊排泄数据,两个脉冲免疫组于6～8日龄、13～15日龄、20～22日龄时采集粪便监测、记录卵囊排泄数据。结果表明,涓滴免疫组第一周龄期间出现排卵囊高峰期,4日龄到6日龄间排卵囊量逐步增加,在6日龄到达到高峰期,之后逐渐减少。相比脉冲免疫组排卵囊高峰期,涓滴免疫组排卵囊高峰期有所延迟,比脉冲免疫组排卵囊高峰期延后1天。低剂量涓滴免疫组第2周龄期间没有出现明显的排卵囊高峰期,高剂量涓滴免疫组第2周龄期间仍会出现排卵高峰期,但没有脉冲免疫组的高峰期明显。低剂量脉冲免疫组与高剂量脉冲免疫组均出现明显的卵囊排出高峰期,而且都在免疫接种后4天出现。经过两周的涓滴免疫和两次脉冲免疫接种后,由于鸡群产生一定的抗球虫免疫力,各免疫组在第3周龄或第三次脉冲免疫之后卵囊排出量均出现大幅下降。第二部分研究为攻虫免疫保护试验。分别于脉冲免疫的每一次免疫接种后的第7天进行攻虫试验,观察和比较堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫与脉冲免疫的免疫效果。随机抽取每个免疫组的10羽鸡进行攻虫,分析攻虫后鸡的肠道病变记分、相对增重率、卵囊减少率等指标。涓滴免疫组与脉冲免疫组经过第一次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分分别为:涓滴免疫攻虫组肠道病变记分3,脉冲免疫攻虫组肠道病变记分2.75,阳性对照组肠道病变记分2.75,阴性对照组肠道病变记分0。各组相对增重率分别为:涓滴免疫攻虫组94.7%,脉冲免疫攻虫组93.9%,阳性对照组89.7%,阴性对照组100%。试验结果表明,涓滴免疫组与脉冲免疫组经过第一个免疫周期均不能建立坚强的免疫保护力。鸡群经过第二次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分为:阳性对照组肠道病变记分（2.9）>低剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（2.15）>高剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.47）>低剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（0.72）>高剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（0.17）;各组相对增重率为:低剂量涓滴免疫攻虫组的相对增重率（83.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组（79.5%）>低剂量脉冲免疫攻虫组（74%）>高剂量涓滴免疫攻虫组（72.2%）>阳性对照攻虫组（66.2%）,各免疫组相对增重率明显高于阳性组;各组卵囊减少率为:低剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（68.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（13.3%）>高剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（-54.3%）>低剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（-63.4%）。经过两次免疫周期后,从试验鸡群的肠道病变记分、相对增重率、卵囊减少率等数据可以得出,各免疫组均建立了有效的免疫保护力,其中高剂量免疫组保护力较好。鸡群经过第三次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分为:阳性对照组肠道病变记分（2.9）>高剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（1.63）>高剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.4）>低剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.35）>低剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（1.24）;各组相对增重率为:高剂量涓滴免疫攻虫组相对增重率（77.4%）>低剂量涓滴免疫攻虫组相对增重率（76.3%）>低剂量脉冲免疫攻虫组相对增重率（76.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组相对增重率（74.3%）>阳性对照组相对增重率（63%）;各组卵囊减少率为:低剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（90.8%）>高剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（70.5%）>高剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（65.8%）>低剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（29.3%）。经过三次免疫周期后,各免疫组均建立了坚强的免疫保护力。从试验数据可以得出鸡群进行二次免疫周期就可以获得坚强免疫力,为养鸡生产过程中疫苗使用、垫料管理等提供理论基础。本论文分析堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫和脉冲免疫后卵囊排泄规律,并比较了涓滴免疫与脉冲免疫的免疫效果,为改进堆型艾美耳球虫免疫方法提供依据。
王晶[9]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用》文中认为鸡球虫病由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起,其所属的顶复门寄生虫可引起许多动物的肠道球虫病,其中7种艾美耳属球虫特异性感染家禽后,定植于肠道特定部位黏膜上皮细胞形成病灶,引起吸收不良或出血性肠炎,对家禽养殖业危害严重。多年来科研人员先后研制出大量抗球虫药物应用于临床治疗,但由于出现耐药虫株及药物残留引发的食品安全问题,免疫预防已成为当前研究热点。本试验将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫（山东株、吉林株、黑龙江株）用单孢子囊接种技术进行杂交,利用RAPD技术进行多态性分析,筛选出杂交株F2,再对杂交株F2代卵囊进行物理和化学两种方法致弱并进行抗球虫效果检测,具体内容如下:杂交虫株的培育:将山东株（S）与吉林株（J）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术对16个山东株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析。在分析中发现1株单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它株和亲本株都不同,此虫株与两亲本株间的相似值为0.83480.8340,远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9604,又远远大于株间相似值的平均值0.6627。因此该虫株为山东株与吉林株的杂交虫株（杂交一代,F1）。获得的杂交F1进一步与黑龙江株进行杂交（杂交二代,F2）,并用RAPD方法对14个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析,找到了1株与亲本株相似性为0.83570.8354的虫株,确定其为杂交株F2。杂交株F2致弱及抗球虫效果检测:将柔嫩艾美耳球虫卵囊进行物理和化学两种方法致弱,物理方法采用超声波细胞破碎仪处理孢子化卵囊,超声条件为功率200W致弱10min,化学方法采用含有叠氮钠的化学致弱剂与孢子化卵囊混合,置于4℃冰箱致弱40d。免疫后根据雏鸡存活率、体重变化、粪便计分、粪便中卵囊计数、盲肠病变计分、血液中抗体OD值变化对免疫效果进行评价。试验表明,超声波致弱柔嫩艾美耳球虫杂交株F2卵囊10min可完全破碎球虫卵囊但使其仍保持良好的免疫原性,在7日龄和14日龄时对雏鸡免疫4×103个卵囊,攻虫后7d雏鸡平均增重达89.01g,与对照组每只鸡平均增重21.31g相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率达100%。在7日龄和14日龄时给雏鸡灌服化学致弱的球虫卵囊8×103个,21日龄攻虫,攻虫后7d雏鸡平均增重达90.61g,与对照组相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率也达100%。其他指标也说明免疫效果较好,在二次免疫后7d,使用间接ELISA法可以在血清中检测到抗体。因此,在一定功率下超声处理杂交株F2卵囊和使用化学致弱剂致弱F2株卵囊,能使其毒力降低并保持良好的免疫原性,可作为疫苗使用。确定雏鸡最佳免疫时间为7日龄和14日龄,确定最佳免疫剂量为超声波致弱的卵囊每个雏鸡4×103个,化学致弱剂致弱的卵囊每个雏鸡8×103个。将这两种方法致弱的卵囊初步制成弱毒苗,使用饮水投苗和饲料投苗两种方法,投放到长春吉星实业有限公司、吉林德翔牧业有限公司、正大集团德大有限公司的四个养鸡场,共免疫了88万只雏鸡,据合作公司统计,增加了一定经济效益,减少了球虫病造成的损失。
赖华英[10]（2018）在《堆型艾美耳球虫加强免疫剂量及交叉免疫效果研究》文中指出鸡球虫病呈世界广泛性分布,普遍认为鸡艾美耳球虫有7个种,其中堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）在7种鸡球虫中最为流行。本论文以在养鸡生产上引起巨大损失的堆型艾美耳球虫为研究对象,对堆型艾美耳球虫早熟疫苗株的不同免疫剂量和免疫次数进行免疫效果对比,以及通过动物实验评估对堆型艾美耳球虫建立起免疫力的鸡群是否对不同区域的堆型艾美耳球虫分离株和其它种鸡艾美耳球虫有没有交叉免疫保护,本研究结果为鸡球虫病活疫苗的推广应用提供依据。首先,本论文通过鸡体免疫接种不同剂量与免疫次数的堆型艾美耳球虫早熟株（PAHY）,评价免疫鸡群免疫保护效果,并选出最优剂量与免疫次数。结果表明,二免后7 d,二免剂量为12000个/羽的免疫组能抵抗1×105个堆型艾美耳球虫河源株强毒的攻击。三免后7 d,三免剂量分别为4000个/羽、8000个/羽和12000个/羽的免疫组均能抵抗1.0×105个堆型艾美耳球虫河源株强毒的攻击。实际生产中选用3次免疫12000个/羽堆型艾美耳球虫早熟株卵囊较为合适。其次,对已经建立了抗堆型艾美耳球虫免疫保护力的鸡群,用3个分离自不同地区的堆型艾美耳球虫强毒株进行攻虫,观察其免疫保护效果。结果表明,以堆型艾美耳球虫早熟株建立起免疫力的鸡群,对这些同种球虫不同分离株的攻击具有相似的免疫保护力。最后,对已经建立了抗堆型艾美耳球虫免疫保护力的鸡群,用毒害艾美耳球虫贺州株（NHZ）、柔嫩艾美耳球虫梅州株（TMZ）、巨型艾美耳球虫莱阳株（MLY）、布氏艾美耳球虫保定株（BBD）、和缓艾美耳球虫保定株（MiBD）等5种球虫强毒株攻虫,观察交叉免疫保护效果。结果表明,堆型艾美耳球虫免疫保护具有种的特异性,对这5种球虫不具保护力,未发现存在种间交叉保护作用。
二、堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养（论文提纲范文）
（1）鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用（论文提纲范文）
| 1 鸡胚传代致弱法 |
| 1.1 鸡胚传代的背景 |
| 1.2 鸡胚传代的原理 |
| 1.3 鸡胚传代的优势与局限 |
| 2 理化致弱法 |
| 2.1 理化致弱的背景 |
| 2.2 理化致弱的原理 |
| 2.3 理化致弱的优势与局限 |
| 3 早熟卵囊选育法 |
| 3.1 早熟选育的背景 |
| 3.2 早熟选育的原理 |
| 3.3 早熟选育的优势 |
| 4 致弱方法在鸡球虫病疫苗研发上的应用 |
| 5 结语 |
（2）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（4）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）堆型艾美耳球虫体外培养细胞的筛选及其发育研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 试验材料的纯化和培养 |
| 1.2.2 不同细胞系、不同温度下的E.acervulina子孢子入侵率的比较 |
| 1.2.3 不同细胞系、不同温度对入侵时间的影响 |
| 1.2.4 E. acervulina在MDBK中的发育 |
| 2 结 果 |
| 2.1 不同细胞系、不同温度对E. acervulina入侵时间的影响 |
| 2.2 不同细胞系和温度对E. acervulina入侵率的影响 |
| 2.3 E. acervulina 在MDBK中发育情况 |
| 3 讨 论 |
（7）不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.鸡球虫病国内外研究现状 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病原的形态及分类 |
| 1.3 鸡球虫病原生物学特性 |
| 1.4 鸡球虫生活史 |
| 1.5 流行病学 |
| 1.6 发病机理 |
| 1.7 症状和病变 |
| 1.8 诊断 |
| 1.9 防治 |
| 2 试验研究的目的和意义 |
| 第二章 不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 疫苗、药物、仪器、试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 试验分组 |
| 1.2.2 喷雾免疫方法 |
| 1.2.3 拌料免疫方法 |
| 1.2.4 用药组药物添加方法 |
| 1.3 球虫免疫效果评价 |
| 1.3.1 舌尖红染率、嗉囊饱食率 |
| 1.3.2 卵囊计数(OPG) |
| 1.3.3 球虫肉眼病变评分方法: |
| 1.3.4 肠道病变评分方法: |
| 1.3.5 生产成绩指标: |
| 2.结果 |
| 2.1 舌尖红染率和嗉囊饱食率结果 |
| 2.2 OPG检测结果 |
| 2.2.1 不同剂量的Y疫苗免疫后OPG值 |
| 2.2.2 Z疫苗1 倍量拌料与Y疫苗1 倍量喷雾、Y疫苗0.6 倍喷雾OPG平均值对比 |
| 2.2.3 用药组OPG趋势 |
| 2.3 球虫肉眼病变评分结果比较 |
| 2.4 肠道损伤肉眼病变评分结果比较 |
| 2.5 生产成绩比较 |
| 2.5.1 成活率对比结果 |
| 2.5.2 单只均重对比结果 |
| 2.5.3 出栏料肉比(FCR)结果对比 |
| 2.5.4 出栏欧洲指数(EPI)对比结果 |
| 2.5.5 出栏前ND抗体均值比较 |
| 2.5.6 出栏前H9 抗体比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 OPG监控、肉眼病变评分的目的和意义 |
| 3.2 拌料法与喷雾法影响 |
| 3.3 生产成绩影响 |
| 3.4 对抗体的影响 |
| 3.5 免疫鸡群早期垫料管理 |
| 3.6 应用前景与建议 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师组意见 |
| 致谢 |
（8）堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 生活史 |
| 1.4 致病性 |
| 1.5 防治 |
| 1.6 疫苗研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 堆型艾美耳球虫 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验分组及处理 |
| 2.2.2 一次脉冲免疫与涓滴免疫的免疫攻虫保护效果测定 |
| 2.2.2.1 攻虫分组 |
| 2.2.2.2 评价指标及标准 |
| 2.2.3 二次脉冲免疫与涓滴免疫的攻虫保护效果测定 |
| 2.2.3.1 二次免疫实验分组及处理 |
| 2.2.3.2 二次免疫攻虫实验设计 |
| 2.2.3.3 二次免疫保护效果评价指标及标准 |
| 2.2.4 三次脉冲免疫与涓滴免疫的攻虫保护效果测定 |
| 2.2.4.1 三次脉冲免疫实验分组与处理 |
| 2.2.4.2 第三次免疫攻虫实验设计 |
| 2.2.4.3 三免保护效果评价指标及标准 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组免疫后卵囊排放规律分析 |
| 3.1.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第二次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.3 涓滴免疫组与脉冲免疫组第三次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.4 涓滴免疫组与脉冲免疫组整个免疫期间卵囊排放量规律 |
| 3.2 攻虫免疫保护效果测定结果 |
| 3.2.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫结果 |
| 3.2.1.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫后体重变化情况 |
| 3.2.1.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫后病变记分结果 |
| 3.2.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第二次攻虫结果 |
| 3.2.2.1 第二次攻虫后各组体重变化情况 |
| 3.2.2.2 第二次攻虫后排卵囊量结果 |
| 3.2.2.3 第二次攻虫后病变记分结果 |
| 3.2.3 各组第三次攻虫的体重变化 |
| 3.2.3.1 各组第三次攻虫后排卵囊量结果 |
| 3.2.3.2 各组第三次攻虫后病变记分结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组卵囊排放规律 |
| 4.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组免疫效果比较 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病概述 |
| 1.1 鸡球虫分类 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 柔嫩艾美耳球虫发育过程 |
| 1.4 鸡感染球虫后的发病机制 |
| 1.5 柔嫩艾美耳球虫病变特点 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 鸡球虫病活疫苗的研究进展 |
| 2.1 强毒苗的研制 |
| 2.2 弱毒苗的研制 |
| 2.3 鸡对球虫的免疫应答 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫不同地理株杂交株制备 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物及饲养 |
| 1.2.2 虫株复壮 |
| 1.2.3 卵囊分离 |
| 1.2.4 卵囊孢子化 |
| 1.2.5 孢子化卵囊的灭菌和纯化 |
| 1.2.6 孢子囊的制备 |
| 1.2.7 单孢子囊胶囊制备及扩增 |
| 1.2.8 柔嫩艾美耳球虫DNA的提取 |
| 1.2.9 选择引物 |
| 1.2.10 PCR反应条件 |
| 1.2.11 数据分析 |
| 1.2.12 虫株的培育及鉴定 |
| 1.2.12.1 杂交F1 虫株的培育 |
| 1.2.12.2 杂交F1 虫株的鉴定 |
| 1.2.12.3 杂交F2 虫株的培育 |
| 1.2.12.4 杂交F2 虫株的鉴定 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 杂交虫株F1 的培育结果 |
| 1.3.2 杂交虫株F2 的培育 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫杂交株F2致弱方法及抗球虫效果检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫保护效果评价指标 |
| 2.2.1.1 测量体重 |
| 2.2.1.2 存活率 |
| 2.2.1.3 血便计分 |
| 2.2.1.4 麦克马斯特法检测粪便中卵囊数(OPG) |
| 2.2.1.5 盲肠病变计分 |
| 2.2.2 超声波致弱卵囊方法 |
| 2.2.3 化学致弱剂的配制及致弱方法 |
| 2.2.4 动物试验免疫程序设计 |
| 2.2.5 ELISA检测雏鸡抗体水平 |
| 2.2.6 卵囊抗原制备 |
| 2.2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择 |
| 2.2.8 间接ELISA实验步骤 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 体重变化 |
| 2.3.2 攻虫7d存活率 |
| 2.3.3 血便计分 |
| 2.3.4 攻虫后第7d卵囊数OPG |
| 2.3.5 盲肠病变计分 |
| 2.3.6 血清抗体OD值 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弱毒苗试验推广 |
| 3.1 试验方法 |
| 3.1.1 计算雏鸡每日饮水和饲料量 |
| 3.1.2 计算免疫剂量 |
| 3.1.3 弱毒苗的使用方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 疫苗特性 |
| 3.3.2 投苗方法比较 |
| 3.3.3 弱毒苗免疫效果比较 |
| 3.3.4 经济效益分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）堆型艾美耳球虫加强免疫剂量及交叉免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 鸡球虫卵囊 |
| 2.2 试验动物 |
| 2.3 试验用饲料 |
| 2.4 试验基地 |
| 2.5 主要设施设备 |
| 2.6 试剂 |
| 2.7 不同接种剂量与免疫次数的效果比较方法 |
| 2.7.1 试验分组及处理 |
| 2.7.2 首免攻虫免疫保护效果测定 |
| 2.7.3 二免攻虫免疫保护效果测定 |
| 2.7.4 三免攻虫免疫保护效果测定 |
| 2.8 不同区域虫株免疫保护效果测定方法 |
| 2.8.1 试验分组及处理 |
| 2.8.2 三免攻不同区域虫株免疫保护效果测定 |
| 2.8.3 评价指标及标准 |
| 2.9 球虫种间交叉免疫保护效果测定方法 |
| 2.9.1 试验分组及处理 |
| 2.9.2 评价指标及标准 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 首免攻虫免疫保护效果测定结果 |
| 3.1.1 首免排卵囊量的结果分析 |
| 3.1.2 关于首免攻毒后相关数据结果分析 |
| 3.2 二免不同免疫剂量攻虫免疫保护效果测定结果 |
| 3.2.1 二免排卵囊量结果分析 |
| 3.2.2 相对增重率的结果 |
| 3.2.3 病变记分结果分析 |
| 3.2.4 卵囊减少率分析 |
| 3.3 三免不同免疫剂量攻虫免疫保护效果测定结果 |
| 3.3.1 三免排卵囊量结果分析 |
| 3.3.2 相对增重率的结果 |
| 3.3.3 病变记分的结果 |
| 3.3.4 卵囊减少率的结果 |
| 3.4 堆型艾美耳球虫不同区域虫株免疫保护效果结果 |
| 3.4.1 攻堆型艾美耳球虫河源株试验结果 |
| 3.4.2 攻堆型艾美耳球虫德阳株试验结果 |
| 3.4.3 攻堆型艾美耳球虫中江株试验结果 |
| 3.5 堆型艾美耳球虫种间交叉免疫保护效果测定结果 |
| 3.5.1 攻和缓艾美耳球虫强毒株结果 |
| 3.5.2 攻柔嫩艾美耳球虫强毒株结果 |
| 3.5.3 攻毒害艾美耳球虫强毒株结果 |
| 3.5.4 攻巨型艾美耳球虫强毒株结果 |
| 3.5.5 攻布氏艾美耳球虫强毒株结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同免疫剂量与免疫次数的效果比较 |
| 4.2 交叉免疫保护分析 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养（论文参考文献）
- [1]鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用[J]. 尹理君,廖申权,孙铭飞,宋忠峰,侯晓礁,李福元,吕敏娜,吴彩艳,李娟,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,于林增,肖文婉,张健騑,戚南山,顾有方. 畜牧与兽医, 2021(11)
- [2]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [3]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [4]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [5]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [6]堆型艾美耳球虫体外培养细胞的筛选及其发育研究[J]. 王黎霞,黄芳,张建军,安健. 北京农学院学报, 2020(03)
- [7]不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究[D]. 刘国辉. 青岛农业大学, 2019(03)
- [8]堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究[D]. 胡伟高. 华南农业大学, 2019(02)
- [9]柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用[D]. 王晶. 吉林农业大学, 2019(03)
- [10]堆型艾美耳球虫加强免疫剂量及交叉免疫效果研究[D]. 赖华英. 华南农业大学, 2018(08)