一、核酸疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展（论文文献综述）
李坤[1]（2018）在《鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA疫苗、卵黄抗体的研制及鱼卵中鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术》文中研究说明鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II,CyHV-2）是鲤疱疹病毒属中一种具有强致病力的DNA病毒。近年来,由CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病在江苏盐城地区大规模爆发,致死率特别高,给异育银鲫的养殖业带来巨大损失,生产上亟待开发安全高效的新型疫苗,应用于异育银鲫鳃出血病防治。1.CyHV-2新型疫苗的免疫效果评估本研究中基于杆状病毒表面展示系统构建了CyHV-2的ORF72与ORF66重组疫苗、CyHV-2的ORFD4核酸疫苗,并评估它们抗CyHV-2的免疫效果。将CyHV-2ORF72基因与CyHV-2ORF66基因分别克隆进杆状病毒表面展示载体pFastBacTMDual-P10-GP64CTD载体中,通过Bac to Bac系统获两种重组病毒,命名为BmNPV-P10-GP64-ORF72与Bm NPV-P10-GP64-ORF66。以1.0×1010TU/尾的病毒量分别腹腔注射免疫异育银鲫（体长713cm,体重35-60g）,同设免疫等体积的生理盐水作空白对照组,免疫后第3周通过竞争型酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血液中抗体的效价水平。结果显示免疫组（2组）与对照组抗体效价水平没有明显差异。表明基于杆状病毒表面展示系统构建的CyHV-2的ORF72与ORF66重组疫苗免疫异育银鲫后,机体均没有产生较高水平的特异性应答。因此,选取CyHV-2（GenBank:KT387800）的衣壳蛋白（ORF66、ORF72）和膜囊蛋白（ORF81、ORF82）作为候选疫苗蛋白,通过抗原表位预测后,将ORF66、ORF72、ORF81、ORF82的抗原表位对应的DNA序列串联,将经密码子优化后的序列克隆在β-肌动蛋白启动子下游,构建重组杆状病毒转移载体,通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒,命名为BmNPV-FA-D4ORF。分别以注射和口服的方式免疫异育银鲫（体长713cm,体重35-60g）。Bm NPV-FA-D4ORF通过腹腔注射免疫异育银鲫(2.2×1013TU/尾),同设BmNPV为阴性对照及空白对照组（等体积生理盐水/尾）。在鱼免疫后第1、2、3周通过PCR、RT-PCR的方法检测免疫鱼体中相关疫苗基因的DNA、RNA水平;免疫后第1、2周后,通过免疫组化的方法检测免疫鱼体脾脏、肾脏中疫苗基因蛋白水平的表达;免疫后第1、2、3、4周分别通过竞争型-ELISA检测抗体效价水平;免疫后第3周接种CyHV-2,评估免疫效果。结果显示,BmNPV-FA-D4ORF注射鱼体后能够进入鱼组织,表达疫苗蛋白,并刺激鱼产生特异性抗体,抗体水平在注射后的第三周达到最高水平。攻毒后,免疫组、阴性对照组、空白对照组的鳃出血病的发病率分别为7.69%、29.17%、38.46%。滴度为2.2×1011TU/ml的Bm NPV-FA-D4ORF以1ml/g喷洒鱼颗粒饲料（对照组中添加等体积生理盐水）,饲喂异育银鲫,4周后,人工感染CyHV-2免疫组、空白对照组的鳃出血病的发病率分别为15.38%、25.93%。表明BmNPV-FA-D4ORF通过注射和口服的方式免疫,均对异育银鲫鳃出血病有良好的免疫保护作用。将异育银鲫浸泡免疫在500拷贝的BmNPV-FA-D4ORF/μl的水中,5h后取鳃、脾脏、血液进行RT-PCR检测,发现浸泡免疫鱼的脾脏、脾脏、血液中均检测到了疫苗基因表达,表明BmNPV-FA-D4ORF可以通过浸泡进入鱼体,并表达疫苗基因,暗示BmNPV-FA-D4ORF可以通过浸泡免疫异育银鲫。2.CyHV-2的ORF72蛋白卵黄抗体的制备为了探讨卵黄抗体应对异育银鲫鳃出病的防治效果,将CyHV-2的ORF72基因克隆进PET28+（a）的载体中,然后在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,ORF72在大肠杆菌中成功表达,表达水平较高。筛选出高表达阳性克隆菌,再接种至发酵罐中放大培养后,收集菌体,通过破碎、变性、复性、过Ni柱、洗脱、透析等一系列过程,从大肠杆菌中纯化获得可溶性的ORF72蛋白;通过免疫鸡群,收鸡蛋制备蛋粉共获蛋粉约100千克。Western-blot检测结果显示,蛋粉中含有特异性的ORF72抗体,ELISA检测结果显示,蛋粉中的抗体效价在1:8000-16000,为测试卵黄抗体在鳃出血病防控中的效果奠定了基础。3.异育银鲫鳃出病鱼卵中的CyHV-2的检测基于CyHV-2的解旋酶基因（helicase）设计了引物,建立real time PCR检测CyHV-2的技术。对患病异育银鲫不同组织的检测结果显示,异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃的感染CyHV-2的程度存在显着差异,肾脏感染程度最高,其次是脾脏和鳃,心脏的感染程度最低。鱼卵逐粒检测结果显示,病鱼的鱼卵中,有12.5%可检测到CyHV-2。病鱼的鱼卵的集团检测结果显示,带毒量为3.31拷贝的病毒/粒鱼卵。对不同感染程度的病鱼的鱼卵检测结果显示,卵中CyHV-2的检出水平与鱼的感染程度呈一定的弱正相关性。这些结果表明CyHV-2可通过卵垂直传递给子代。
孙利杰[2]（2017）在《ADV全基因优化核酸疫苗的构建及其免疫效果的初步研究》文中研究指明水貂阿留申病（Aleutian disease,AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus,ADV）引起的一种侵害水貂免疫系统的疾病,又称为浆细胞增多症。由于其特殊的致病机理,导致目前尚无有效防治水貂阿留申病的疫苗。为了更好的研制有效对抗水貂阿留申病的疫苗,本实验以实验室所分离的水貂阿留申病强毒株DNA序列为模板,运用重叠延伸PCR技术,去除VP2基因中编码428-446氨基酸的核苷酸序列,并与pcDNA3.1（+）载体连接,构建全基因突变重组核酸疫苗pcDNA3.1-ADV-428;同时在去除428-446氨基酸序列的基础上截去487-501氨基酸序列,构建全基因突变重组核酸疫苗pcDNA3.1-ADV-428-487。将构建的重组质粒转染至L929细胞中,通过间接免疫荧光（IFA）实验检测其表达效果。选取健康小鼠分组,经肌肉注射进行免疫,用间接ELISA法检测抗体;在第42天取免疫小鼠的脾细胞用流式细胞仪检测、CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞亚群;用酶联免疫检测试剂盒,检测免疫后小鼠血清中IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ四种细胞因子的含量。最后实验结果表明所构建的重组核酸疫苗具有良好的反应原性和免疫原性。将以上所构建的核酸疫苗经肌肉注射接种到水貂体内进行免疫。免疫完成后对水貂进行攻毒,然后每隔两周对水貂进行指尖采血。应用流式细胞术检测全血中的CD8+淋巴细胞亚群;应用间接ELISA法检测血清中的抗体水平;应用血清蛋白电泳检测血清中γ球蛋白占总蛋白的百分比以及应用聚乙二醇沉淀比浊法检测水貂血清中抗原抗体复合物的含量。实验结果表明pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487组在水貂试验中γ球蛋白、CIC以及CD8+T淋巴细胞的量都要低于对照组,且pcDNA3.1-ADV-428-487的保护效果要优于pcDNA3.1-ADV-428,所构建的核酸疫苗展现了良好的疫苗潜质。
赖隆永[3]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究》文中研究表明传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由双股核糖核酸病毒科的传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的以感染雏鸡为主的免疫抑制性、高度接触性传染病;新城疫（Newcastle Disease,ND）是由副黏病毒科鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起鸡的急性、高度接触性和致死性传染病,不同年龄、品种以及性别的鸡均能感染ND,但是幼雏的发病率和死亡率明显更高。研究发现国内对ND-IBD二联灭活苗的研发及其对种母鸡免疫效果研究较少,因此,针对这种情况,对ND-IBD二联灭活苗对种母鸡免疫效果研究仍需要进一步研究;同时在生产临床实践中或者科研试验研究中,血清学方法监测雏鸡抗体水平在一定程度上,都会引起雏鸡应激,影响其生长性能和经济效益。通过从鸡蛋中提取ND和IBD卵黄抗体间接预估ND和IBD血清抗体,获取样品方便,减少雏鸡的反复应激,考虑到ND和IBD卵黄抗体与子代雏鸡ND和IBD血清抗体的关系尚不明确,因此通过测定ND和IBD卵黄抗体与ND和IBD血清抗体,进行ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析;另外,研究表明在临床实践中,机体内存在IBDV野毒和苗毒的感染,引起法氏囊病变和免疫失败,因此建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法具有重要意义。本研究拟对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,对其ND和IBD抗体水平进行检测,观察种母鸡及其子代的免疫效果,此外,对提取的种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平进行相关性分析,最后建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法。本试验的研究内容及结果如下:1.ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究。本试验通过对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,分别于免疫前、免疫后每隔15 d采血分离血清,利用血清学方法检测其ND和IBD抗体水平,并对其抗体水平进行分析,结果表明种母鸡接种ND-IBD二联灭活苗之后产生了较高的ND和IBD抗体水平,种母鸡得到了很好的免疫保护,并且其免疫保护力能够持续120d。可见,种母鸡免疫ND-IBD二联灭活苗,不仅可以有效地提高种母鸡的抗体水平,也可以提高子代的母源抗体水平。2.ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析。本试验通过检测种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平及其子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平,结合SPSS 18.0软件的分析,得到免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代ND血清抗体水平关系的最优方程为y=0.923+0.701x;免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代IBD血清抗体水平关系的最优方程为y=2.365+0.7x。3.IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立。根据NCBI中不同毒株的VP2共保守区段序列比对分析设计两对引物（片段长度为856bp和1356bp）和选择限制性内切酶BamHI和PstI进行RT-PCR扩增,并选择片段长度为856 bp的PCR产物,胶回收其目的基因进行限制性内切酶酶切,最后验证其特异性、敏感性和重复性,建立了IBDV强弱毒株鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。综上,种母鸡免疫接种ND-IBD二联灭活苗后种母鸡及其子代获得较高抗体水平;此外,分析免疫组种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平的相关性,获得了它们之间的最优方程;最后建立了一种高效简便的IBDV野毒与苗毒的鉴别诊断RT-PCR-RFLP方法,为临床和生产实践制定科学的免疫程序提供科学依据和提供高效便利的监测手段;同时,为IBD的流行病学和诊断治疗研究提供了一种新的手段。
贺明艳[4]（2015）在《基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用》文中指出基因工程疫苗同常规疫苗相比,是借助了现代生物方法,使生产的疫苗的安全性和稳定性得到了明显提高,且有较好的保护性免疫反应,加上成本较低,可实现1针防多病,俨然已经成为了动物疫苗今后发展的一个主要方向。本文章简要介绍了基因工程疫苗种类及其在动物疾病防治中的有效应用。
刘嫒[5]（2016）在《IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究》文中进行了进一步梳理羊口疮病毒（Orf virus,Orf V）属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行,是严重威胁养羊业、具有重要经济意义的病毒病。疫苗接种是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、灭活疫苗,但在生产实践中羊口疮弱毒苗存在散毒危险、毒力返强等缺陷,灭活苗存在灭活不彻底、产生抗体水平较低等缺陷。因此,运用基因工程技术开发Orf新型疫苗具有重要意义。Orf V诱导机体以细胞免疫为主,而IL-2是Th1型细胞因子,可作为细胞因子免疫佐剂,与核酸疫苗联用能增强其免疫效果。本研究构建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三种真核表达质粒,将山羊IL-2基因真核表达质粒作为细胞因子佐剂与Orf V真核表达质粒联合免疫小鼠,探讨山羊IL-2细胞因子佐剂对Orf V核酸疫苗免疫效果的影响研究。主要研究内容如下:1.山羊IL-2基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:采集健康贵州黑山羊外周血,分离培养淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR扩增、序列测定获得山羊IL-2基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建山羊IL-2基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和ELISA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因完整编码阅读框长468 bp,编码155个氨基酸,与Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性为95.9%-100%,氨基酸序列一致性为91.1%-100%;将羊IL-2基因序列提交Gen Bank,获得登录号KT934548;生物信息学预测,该蛋白α-螺旋与β-折叠较多,有信号肽,无跨膜结构和特定功能结构域,整条肽链表现为亲水性;经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了真核表达质粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2转染MDBK细胞48 h后的上清,RT-PCR检测到IL-2基因的m RNA转录,ELISA方法检测到MDBK细胞上清IL-2蛋白浓度约为112 pg/m L。2.羊口疮病毒B2L、F1L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:根据Gen Bank收录的Orf V基因序列（No.AY386264）,分别设计针对Orf V B2L、F1L基因引物,通过PCR扩增、序列测定获得B2L、F1L基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建B2L、F1L基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和IFA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,Orf V-GZ株B2L基因全长1137 bp,与Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性为97.1%-99.7%;F1L基因全长1029 bp,,与Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性为95.5%-99.7%;分别将Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,获得登录号KP994595、KP057582;生物信息学分析,B2L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,无跨膜结构和信号肽,含2个磷脂酶D超家族保守结构域,同时还有相应的特异性结合位点;F1L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,含2个跨膜结构,无信号肽。经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建真核表达质粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法检测转染细胞中有B2L、F1L基因m RNA转录,IFA方法检测到B2L、F1L基因在MDBK细胞中表达。3.IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果影响研究:以p VAX1-IL-2作为细胞因子佐剂,分别与p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L联合免疫小鼠,采用ELISA方法对小鼠血清中Orf V特异性抗体与Th1型（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2型（IL-4、IL-6、IL-10）细胞因子进行测定;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;FACS法检测小鼠脾淋巴细胞亚群变化。结果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三组质粒均具有良好免疫原性,各真核质粒免疫组1周后均能诱导小鼠产生Orf V特异性抗体,第6周时抗体水平最高,第7周时抗体水平开始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组抗体变化趋势明显;MTT法检测结果表明三组质粒诱导的淋巴细胞增殖反应均高于p VAX1和PBS组,差异极显着（P<0.01）,加入p VAX1-IL-2佐剂组与未加入佐剂组相比,差异极显着（P<0.01）,表明p VAX1-IL-2对三组质粒诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用,在14周能够持续增殖;FACS结果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组的CD3+CD4+T淋巴细胞含量较PBS组与p VAX1组高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组最高,且加p VAX1-IL-2细胞因子佐剂组高于未加佐剂组,CD4+T细胞含量高于CD8+T细胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值介于1.712.94之间,表明各真核质粒免疫组均能诱导淋巴细胞亚类增殖,辅助性T细胞高于抑制性T细胞,重组质粒不会引起小鼠不良反应;细胞因子检测结果表明,Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）含量高于Th2型（IL-4、IL6、IL-10）,且加入p VAX1-IL-2佐剂组高于未加佐剂组,表明细胞免疫以Th1型为主。结论:本试验成功克隆了贵州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息学分析表明三个基因具有良好抗原性。本实验构建了三种真核表达质粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2对p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠体内诱导的Orf V特异性体液免疫和细胞免疫具一定的促进作用,细胞免疫应答以Th1型为主。
王薇[6]（2015）在《动物疫情公共危机政府防控能力建设研究》文中研究表明改革开放以来,中国的畜牧业得到了空前的发展,已经成为世界上畜牧养殖数量最大的国家,畜牧业也成为中国国民经济的重要组成部分。但是目前我国动物疫情防控形势越来越严峻复杂。动物疫病防治工作关系国家食物安全和公共卫生安全,关系社会和谐稳定,是政府社会管理和公共服务的重要职责,是农村农业工作的重要内容。2012年5月2日,《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》（以下简称《规划》）经国务院常务会议审议通过发布实施。这是新中国成立以来,第一个指导全国动物疫病防治工作的综合性规划,是我国动物疫病防治发展史上的重要里程碑,标志着动物疫病防治工作进入了规划引领、科学防治的新阶段。本论文在此背景下,从政府管理的角度出发,依据《规划》的基本理念,研究影响我国动物疫情政府防控能力的基本要素,对于我国制定合理的防控政策、创新防控组织体系建设、防控技术推广以及促进、社会防控资源整合有着很强的迫切性和现实性。本文在公共管理学、危机管理学、农业推广学、社会学、经济学等多学科视角下,综合运用公共危机管理理论、风险理论、脆弱性分析、动物卫生经济学理论以及系统管理理论对动物疫情公共危机政府防控能力建设进行理论分析的基础上,依据《规划》提出的四个能力建设的基本保障,提出我国动物疫情公共危机政府防控能力建设的四大基础要素：法制规范、组织体制、科技支撑和条件保障。分章对此四大基本要素在我国建设的基本概况、存在的基本问题、问题引发的原因、国外的基本经验及做法以及可能的改进方向和做法进行了综合分析,旨在提升我国政府提高动物疫情公共危机防控能力。本文通过理论分析、文献探讨和实证昀方法对动物疫情防控能力建设的一系列问题进行了具体分析,得出了一系列重要的观点与结论。首先,改变观念,建立系统化的动物疫情防控法律体系。其中需要改变观念,从动物卫生安全的高度看待动物疫情公共危机防控立法；健全动物防疫组织立法,防止动物疫情防控立法碎片化；树立动物疫情风险意识,健全动物卫生风险评估机制。其次,突破限制,建立开放型的动物疫情防控体制框架。需要从专业性出发设立常规性指挥机构；以任务为中心建立复合式组织结构；以政府为中心的多元主体参与共治。再次,创新科技,构建有机性的动物疫情防控科技支撑。需要做到接轨国际标准,加强科技支撑基础条件建设；抓住核心技术,做好科技支撑沟通平台建设；注重社会需求,完善科技支撑能力评价机制；重视技术应用,科学研究与防控实践相结合。最后重视投入,建立稳定性的动物疫情防控条件保障。需要在条件保障上重心前移,加大和稳定动物疫病防控财政支持；建立多元化的动物疫病防控资金分摊机制；对动物疫病防控重点领域进行合理分派；合理安排重大动物疫情应急资金和物资储备。本文借鉴相关研究成果及通过案例的实地调查和大量的统计数据来进行我国动物疫情公共危机政府防控能力建设研究,可能在两方面具有创新：一是基本研究思路的创新性。文章突破单纯的从畜牧兽医学的角度来探讨动物疫情防控问题,而是从人类社会公共管理的角度来考察人类社会的管理行为如何削弱或消减动物疫情公共危机的发生的风险。二是计量研究方法具有创新性。本项目采用回归分析对现阶段我国动物疫情防控的基本情况进行实证分析,找出目前影响防控能力的关键性要素,对我国短期内的防控政策的制定有一定的参考价值。
黄凌远[7]（2014）在《减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究》文中指出罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的暴发给罗非鱼养殖业造成了巨大的损失。本课题,以2009年,在海南暴发的罗非鱼无乳链球菌病为背景开展了针对该病的口服核酸疫苗的研究。我们将编码Sip蛋白的sip基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒pVAX1-sip,并将该重组质粒电转化到减毒沙门氏菌SL7207,成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服核酸疫苗。评价了疫苗的安全性、稳定性、在罗非鱼的组织分布以及口服免疫效果。具体内容包括：1.罗非鱼无乳链球菌sip基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达以罗非鱼源无乳链球菌的强毒力株（JF423941）的DNA为模板,PCR扩增了sip基因,并T-克隆,质粒测序分析,sip基因长度为1002bp,编码333个氨基酸（KJ398146.1）。在T-克隆重组质粒的基础上,以pVAX1为载体,成功构建了真核表达重组质粒。通过脂质体转染,重组质粒成功转染EPC细胞,利用间接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法,证明了Sip蛋白在EPC细胞内的表达和表达蛋白免疫原性。2.重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定本章采用电转化技术,成功将核酸疫苗质粒导入了减毒沙门氏菌SL7207。对构建的重组减毒沙门氏菌进行了生物学特性分析,结果表明将外源基因导入减毒沙门氏菌载体菌株后,重组减毒沙门氏菌的生长特性未发生明显变化,与原始株趋于一致。在体外,在含抗生素培养环境下SL7207-pVAX1和SL7207-pVAX1-sip两株重组菌的质粒比较稳定,传代50代后,质粒稳定性仍然在90%以上；在不含抗生素培养环境下,重组沙门氏菌中的质粒稳定性有所下降,随着传代数的增加,可能存在质粒的丢失,但在35代内,稳定性仍然能够在80%以上,显示了较好的稳定性。体内稳定性试验表明减毒沙门氏菌能够稳定携带外源基因有效侵染到罗非鱼的各组织器官,为核酸疫苗发挥效果提供了前提保障,同时重组菌在免疫接种后28d,能够完全从机体消除,也表明了该重组菌具有较好的生物安全性。本章还考察了烘干和储存温度对口服免疫饲料中重组菌的影响,结果提示低温烘干和低温储存可以降低重组菌的损失率,同时建议口服免疫饲料尽量现配现用,以保证最佳免疫效果。3.核酸疫苗的安全性研究本章将不同浓度的重组菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接种罗非鱼,统计死亡率,得该重组菌对罗非鱼的半数致死量（LD50）为1.7×1011cfu/尾,该LD50值极高,表明对罗非鱼的毒力极弱。以灌胃途径免疫接种,在不高于1.25×1010cfu/尾灌服剂量范围内,罗非鱼不会出现死亡等异常症状,相对安全。以109cfu/mL,0.5mL/尾,灌胃接种罗非鱼,整个试验期间罗非鱼未发生死亡等异常,组织病理学观察表明,对照组和免疫组的各个组织脏器均相对正常,该剂量下免疫接种不会对罗非鱼造成病理损伤,是安全的。基因整合试验表明,在检测敏感度为102拷贝数下,重组质粒不会与罗非鱼发生染色体整合。综上,通过重组菌毒力试验,重组菌对罗非鱼的病理损伤评价和外源基因与宿主基因整合性三方面考察,均证实该疫苗对罗非鱼是安全的。4.核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达本章对核酸质粒和表达的Sip蛋白进行了组织分布考察,结果表明,通过PCR检测,证明核酸质粒可分布于罗非鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏；利用免疫组化方法,检测到表达的蛋白可分布于脾脏和肝脏。核酸质粒或表达的蛋白在组织内存留的时间与免疫接种次数呈正相关。试验结果表明,减毒沙门氏菌能够作为核酸疫苗的运载体,将sip基因携带并转移到靶组织,同时核酸疫苗质粒能够在罗非鱼体内进行有效的表达,为后期免疫试验奠定了基础。5.重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察罗非鱼经灌胃和投喂免疫饲料两种途径,分不同免疫次数进行免疫接种。考察了免疫后罗非鱼的血清总蛋白含量、血清总超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清补体C3含量、血清抗菌活性这些非特异性免疫指标以及体液免疫指标抗体效价和细胞免疫指标IL-1β、TNF-α细胞因子转录水平。综合评估了本课题研究的核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果。结果表明,灌胃和投喂免疫饲料两种免疫方式,均能够有效的诱导免疫应答反应。使罗非鱼获得抗无乳链球菌感染的能力。灌胃组最高免疫保护率为57%,拌料组最高免疫保护率可达63%。基于前期的安全性研究结果,最终推荐免疫程序为：108cfu/g拌料免疫接种,进行三个免疫程序,每次间隔7d,每次连续口服7d,每次每尾按鱼体重1%投喂免疫饲料。
沙万里,杨桂连,王春凤[8]（2013）在《白细胞介素-2在动物疾病防治中的应用进展》文中认为白细胞介素-2（IL-2）是免疫学研究的重要细胞因子之一,在动物疾病防治中发挥重要作用,显示了良好的应用前景。就IL-2作为免疫佐剂增强疫苗免疫效果和提高动物抗感染性疾病能力等方面进行了综述,并对应用中存在的问题进行了探讨。
徐诗英[9]（2012）在《草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究》文中研究表明草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水养殖的主要品种之一。长期以来,草鱼出血病（hemorrhagic disease of grass carp）发病率较高,死亡率高达80%以上草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus, GCRV）已被证实为草鱼出血病的病原。GCRV隶属呼肠孤病毒科（Reoviridae）,水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）,是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒,也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。GCRV主要侵染于草鱼肝脏、心脏、肌肉、肾脏、脾、鳃、肠道等活的组织细胞内,导致化学药物难于达到治疗效果,已成为草鱼养殖发展中的“瓶颈”问题。GCRV不仅感染草鱼,而且还感染青鱼、麦穗鱼以及某些海水鱼等养殖鱼类,对淡水养殖业造成了严重的危害。GCRV为立体对称的20面体球形颗粒,由RNA核心和多层衣壳（内壳层、中间层与外壳层）组成,其基因组为11条分节段的双链RNA （double strand RNA, dsRNA）。近几年,基因序列分析和三维结构研究表明,成熟的GCRV颗粒由7种衣壳蛋白（VP1～VP7）组成,其中VP5和VP7为病毒外衣壳组分,VP7蛋白是由GCRV第10片段编码,已被揭示其在病毒感染及致病过程中起着不可替代的作用,并且具有较好的抗原性。VP5和VP7抗体都能与抗原中和,且VP7的抗体中和活性是VP5的3倍,表明VP7可能是GCRV主要的抗原决定簇,含有VP7基因的重组质粒又可成功转染到真核细胞中,使研（?）GCRV基因疫苗成为可能。核酸疫苗,又称基因疫苗或DNA疫苗,是通过基因工程改造的DNA注入机体后产生免疫应答来防治疾病一种新型疫苗。具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点,大大克服了灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等所存在的缺陷,已引起行业内的广泛关注。将团头鲂（Megalobrama amblycephala）的p-肌动蛋白启动子控制的VP7基因克隆进杆状病毒转移载体pFastBacTM ual中,同时将另一拷贝的VP7基因置于杆状病毒多角体蛋白（polh）基因启动子控制之下,构建VP7基因核酸疫苗表达载体pFastBac-β-VP71-VP72。初步开展了核酸疫苗的免疫效果以及对草鱼出血病的免疫保护实验。实验设三个重组基因疫苗pFastBac-p-VP71-VP72剂量组,注射剂量分别为10μg、30μg、60μg,空载体组注射pFastBacTM Dual30μg,对照组不注射任何疫苗。免疫后第14、21、28、49、70天对草鱼进行尾静脉取血,通过RT-PCR检测核酸疫苗的体内转录情况,间接凝集反应测定抗体水平,第21天攻毒试验来检测各组的免疫保护效果。结果显示,重组质粒pFastBac-β-VP7i-VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录。各免疫组均有抗体产生,抗体效价在第21天检测时达到最高,30μg剂量组略高于其它剂量组；攻毒试验计算注射疫苗各组死亡率分别为0%、0%和5%,空载体组和对照组分别为30%和100%。实验结果表明,构建的pFastBac-β-VP71-VP72草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗具有较好的免疫作用和免疫保护效率,为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的生产应用和产业化提供了一定的理论依据。
刘林[10]（2012）在《草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫效果研究》文中研究说明草鱼出血病病毒（Grass carp reovirus, GCRV）是水生呼肠孤病毒属中致病力最强双链RNA（dsRNA）病毒,因曾引起中国西南的85%草鱼幼鱼发生草鱼出血病而被首次发现。目前的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗,灭活疫苗不能进入主要组织相容性复合体I（MHC I）类抗原呈递途径,不能有效的诱导细胞毒性T细胞（CTL）反应,因此,免疫效果相对不理想、免疫力持久性差；减毒疫苗生产成本高,有毒力返祖现象,安全性较差,有回复致病性的潜在危险。鱼体免疫接种的常规方法是浸泡免疫和注射免疫,浸泡免疫方法操作简单,但需要大量的疫苗；但注射免疫要求鱼体要有一定的规格,操作强度大、技术要求高、技术推广困难,而且鱼的捕捞过程及注射对鱼体均造成较大损伤。因此,生产上急需开发安全可靠、高效多价、使用简便的草鱼出血病口服亚单位/DNA联合疫苗。1.草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估为了评估草鱼出血病病毒（GCRV）vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒多角体蛋白（Polh）启动子下游,同时将团头鲂（Megalobrama amblycephala）的β-肌动蛋白启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒P10启动子下游获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6.按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg免疫草鱼（体长14～20cm,体重60～120g）,同设pFastBacTMDual载体（30μg/尾）阴性对照组及空白对照组（0.4ml/尾无菌水）。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70d分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平和在免疫第21d感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28d达到最高；攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。2.原核表达GCRV VP6蛋白对草鱼出血病的免疫保护作用为了探讨草鱼出血病病毒（GCRV）VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a（+）,构建了重组质粒pET28a（+）-VP6。SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43kDa,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右；Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼（14～20cm,60～120g）,并在第14、21、28、49、70d通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14d可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21d达到最高峰,第70d仍可检测到抗体的存在；免疫注射第21d人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。研究结果为草鱼出血病亚单位疫苗的研发奠定了基础。3.GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗及免疫效果评价杆状病毒具有高效表达外源基因以及安全有效向脊椎动物细胞传递基因的功能,为了研发安全可靠、高效多价、使用方便的VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗,本研究分别用团头鲂的β-actin启动子和家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的多角体蛋白启动子控制GCRVvp6基因构建供体质粒pFastBac-FA-VP6-ph-VP6,通过Bac to Bac系统获重组杆状病毒BacFish-VP6。重组病毒感染5龄家蚕后,采集血液,SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为53kDa。重组病毒感染蚕蛹120h后,VP6蛋白的表达水平达到最高值,达血淋巴总蛋白的5%左右,冷冻干燥制成冻干粉,然后分别以1%、5%、10%的比例掺入饲料中（含2.5%淀粉）,口服免疫草鱼,通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,抗体产生水平呈剂量依赖的方式,并在免疫后第3-4周抗体水平达到最高,至3个月后仍能检测到特异性抗体的存在；RT-PCR检测结果显示,在口服免疫的鱼血液中可特异性地检测到vp6基因的mRNA,免疫组化法在免疫鱼的肝、肾组织中可检测到VP6蛋白,表明用感染重组杆状病毒BacFish-vp6的蚕蛹冻干粉口服免疫,重组杆状病毒BacFish-vp6能进入鱼体,并正确表达VP6蛋白,刺激鱼体产生免疫反应。初步的研究结果表明,表达VP6蛋白的蚕蛹冻干粉具有蛋白亚单位/DNA疫苗的双重功效,口服免疫能诱导鱼产生特异性免疫反应。
二、核酸疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核酸疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展（论文提纲范文）
（1）鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA疫苗、卵黄抗体的研制及鱼卵中鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.鲤疱疹病毒Ⅱ型的研究进展 |
| 1.1 CyHV-2的症状及流行规律 |
| 1.2 形态特征 |
| 1.3 CyHV-2的基因组及其编码的蛋白 |
| 1.4 CyHV-2的免疫学效应 |
| 1.5 CyHV-2免疫防治的研究 |
| 2.家蚕杆状病毒及其表达系统 |
| 2.1 家蚕杆状病毒表达系统的构建 |
| 2.2 家蚕杆状病毒表达系统的优点与缺陷 |
| 2.3 利用杆状病毒作为表达载体的疫苗研究 |
| 3.卵黄抗体的研究进展 |
| 3.1 卵黄抗体的概念、理化与生物学特性 |
| 3.2 卵黄抗体的应用 |
| 4.鲤疱疹病毒(CyHV-2)在亲代与子代间的垂直传播 |
| 4.1 鱼类病原体垂直传播途径的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究目的与研究内容 |
| 1.研究目的与意义 |
| 2.研究的主要内容 |
| 2.1 ORF72、ORF66杆状病毒表面展示疫苗的构建 |
| 2.2 CyHV-2ORF72-ORF81-ORF66-ORF82联合DNA疫苗的构建及免疫效果评估 |
| 2.3 CyHV-2ORF72卵黄抗体的制备 |
| 2.4 异育银鲫卵中CyHV-2的检测 |
| 3.技术路线 |
| 第三章 CyHV-2ORF72与ORF66杆状病毒表面展示疫苗的构建与免疫效果评估 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 BmNPV-P10-GP64-ORF72与BmNPV-P10-GP64-ORF66 |
| 2.2 BmNPV-P10-GP64-ORF72与BmNPV-P10-GP64-ORF66注射免疫鱼的抗体效价检测 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CyHV-2ORF72-ORF81-ORF66-ORF82联合DNA疫苗的构建及免疫效果评估 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 多抗原表位联合DNA疫苗的设计与序列合成 |
| 2.2 核酸疫苗载体的构建与鉴定 |
| 2.3 疫苗基因在鱼组织细胞中的表达 |
| 2.4 BmNPV-FA-D4ORF注射免疫鱼的抗体效价检测 |
| 2.5 BmNPV-FA-D4ORF免疫注射对CyHV-2感染的免疫保护作用 |
| 2.6 BmNPV-FA-D4ORF免疫注射后在鱼体内的滞留周期 |
| 2.7 口服免疫鲫抗CyHV-2的免疫保护作用 |
| 2.8 浸泡免疫后鱼体内疫苗基因的表达 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 鲤疱疹病Ⅱ型病毒ORF72蛋白的卵黄抗体的制备 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 重组蛋白的鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.4 卵黄抗体的特异性和效价检测 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 异育银鲫鳃出病鱼卵中的CyHV-2的检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 异育银鲫鳃出血病不同组织中CyHV-2的PCR定性检测 |
| 2.2 异育银鲫鳃出血病主要脏器CyHV-2的检测 |
| 2.3 异育银鲫的鱼卵中带毒率的检测以及单个鱼卵中带毒量的检测 |
| 2.4 不同发病程度与卵中CyHV-2的带毒水平 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 常用仪器 |
| 附录二 载体图谱 |
| 附录三 RT-PCR原始数据 |
| 附录四 PCR 检测 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（2）ADV全基因优化核酸疫苗的构建及其免疫效果的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 水貂阿留申病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 发病机理 |
| 1.6 诊断 |
| 第二章 水貂阿留申病毒概述 |
| 2.1 ADV的分类地位和形态特征 |
| 2.2 ADV的理化特性 |
| 2.3 ADV的培养特性 |
| 2.4 ADV分子生物学研究进展 |
| 第三章 核酸疫苗概述 |
| 3.1 核酸疫苗的特点 |
| 3.2 核酸疫苗免疫的免疫机理 |
| 3.3 影响核酸疫苗免疫效果的因素 |
| 3.4 核酸疫苗的应用前景 |
| 3.5 核酸疫苗存在的问题 |
| 第四章 水貂的经济价值 |
| 4.1 貂皮 |
| 4.2 貂肉 |
| 4.3 貂心等内脏 |
| 4.4 貂油、貂粪等 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 ADV全基因突变重组核酸疫苗的构建、表达及其免疫原性的分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 ADV全基因突变重组核酸疫苗的免疫效果评价 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IBD研究进展 |
| 1.1 IBD流行病学特点 |
| 1.2 IBD病原学特征 |
| 1.3 IBDV基因组结构与VP2蛋白 |
| 1.4 IBDV毒株 |
| 1.5 IBDV的诊断 |
| 1.6 IBD的防治 |
| 2 ND研究进展 |
| 2.1 ND流行病学特点 |
| 2.2 ND病原学特征 |
| 2.3 ND的诊断 |
| 2.4 ND的防制 |
| 3 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 3.1 IBD疫苗研究进展 |
| 3.2 ND疫苗研究进展 |
| 3.3 疫苗的基本要求 |
| 3.4 免疫失败的原因 |
| 4 疫苗免疫监测方法 |
| 5 PCR-RFLP研究进展 |
| 5.1 PCR-RFLP的基本原理 |
| 5.2 PCR-RFLP技术的应用 |
| 6 本研究目的和意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 免前抗体水平检测 |
| 2.2.1 HA试验(微量法) |
| 2.2.2 HI试验(微量法) |
| 2.2.3 TCVN(固定病毒稀释血清) |
| 2.3 免后抗体水平检测 |
| 2.4 种蛋的收集 |
| 2.5 子代雏鸡抗体水平检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡ND抗体水平的影响 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡IBD抗体水平的影响 |
| 3.3 四批次孵化雏鸡ND抗体水平的分析 |
| 3.4 四批次孵化雏鸡IBD抗体水平的分析 |
| 3.5 攻毒保护结果 |
| 3.6 中和试验中DF-1细胞病变观察 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND和IBD卵黄抗体与子代血清抗体的相关性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 氯仿法提取卵黄抗体 |
| 2.3 HI试验和ELISA试验 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.5 结果的比对 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 种蛋ND卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.2 种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.3 免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代血清ND抗体水平相关性分析 |
| 3.4 免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平相关性分析 |
| 3.5 血清抗体水平与卵黄抗体水平比对结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病毒RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR以及PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物测序 |
| 2.5 琼脂糖凝胶回收目的基因 |
| 2.6 限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 病料检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 BC6-85和B87 VP2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 BC6-85和B87酶切结果 |
| 3.3 特异性试验结果 |
| 3.4 敏感性试验结果 |
| 3.5 重复性试验结果 |
| 3.6 病料PCR-RFLP检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用（论文提纲范文）
| 1 基因工程疫苗的分类 |
| 1.1 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.2 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3 合成肽疫苗 |
| 1.4 核酸疫苗 |
| 2 基因功程疫苗的应用 |
| 2.1 亚单位疫苗应用研究 |
| 2.2 活载体疫苗应用研究 |
| 2.3 合成肽疫苗应用研究 |
| 2.4 核酸疫苗应用研究 |
| 3 结语 |
（5）IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述1 |
| 文献综述2 |
| 第一章 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 山羊IL-2 基因克隆与序列分析 |
| 2.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析 |
| 2.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建与表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 山羊IL-2 基因克隆及序列分析结果 |
| 3.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析结果 |
| 3.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于山羊IL-2 基因克隆及生物信息学分析 |
| 4.2 关于真核表达质粒载体的选择 |
| 4.3 关于pVAX1-IL-2 在MDBK细胞中的表达 |
| 5 小结 |
| 第二章 羊口疮病毒(OrfV) B2L、F1L基因真核表达质粒的构建与表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 OrfV B2L、F1L基因克隆与序列分析 |
| 2.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析 |
| 2.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒构建与表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 OrfV B2L、F1L基因的克隆及序列分析结果 |
| 3.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析结果 |
| 3.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于OrfV核酸疫苗目的基因的选择 |
| 4.2 关于OrfV B2L与F1L基因的生物信息学分析 |
| 4.3 关于OrfV pVAX1-B2L和pVAX1-F1L在MDBK细胞中的转录和表达 |
| 5 小结 |
| 第三章 IL- 2 基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L和pVAX1-F1L质粒制备 |
| 2.2 实验动物(KM系)免疫试验 |
| 2.3 免疫小鼠血清中特异性抗体水平检测 |
| 2.4 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 |
| 2.5 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 2.6 免疫小鼠血清中Th1/ Th2型细胞因子检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清中特异性抗体水平动态变化结果 |
| 3.2 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.3 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类分析结果 |
| 3.4 免疫小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于IL-2 基因佐剂对核酸疫苗免疫效果的影响 |
| 4.2 关于OrfV核酸疫苗诱导免疫反应 |
| 4.3 关于免疫检测指标的选择 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 附录二 攻读硕士期间取得的成果 |
| 附录三 主要培养基、溶液及试剂配制 |
| 致谢 |
（6）动物疫情公共危机政府防控能力建设研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题背景及研究意义 |
| 1.1.1 选题背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 国内外文献综述 |
| 1.2.1 危机防控能力研究 |
| 1.2.2 动物疫情公共危机的研究 |
| 1.2.3 动物疫情公共危机防控研究 |
| 1.2.4 对已有研究的评述 |
| 1.3 研究问题与内容 |
| 1.4 本文研究框架与方法 |
| 第2章 相关概念及理论基础 |
| 2.1 相关概念界定 |
| 2.1.1 公共危机 |
| 2.1.2 动物疫情公共危机 |
| 2.1.3 危机防控能力 |
| 2.1.4 能力建设及其基础 |
| 2.2 相关理论基础 |
| 2.2.1 公共危机管理理论 |
| 2.2.2 风险管理与脆弱性研究 |
| 2.2.3 动物卫生经济学 |
| 2.2.4 系统管理理论 |
| 第3章 我国动物疫情公共危机能力建设基础及其形成 |
| 3.1 能力基础之一：法制体系建设情况 |
| 3.2 能力基础之二：管理体制建设情况 |
| 3.3 能力基础之三：科技研发支持情况 |
| 3.4 能力基础之四：条件保障建设情况 |
| 3.5 综合能力形成：应急响应实施情况 |
| 第4章 动物疫情公共危机防控法制体系建设 |
| 4.1 我国动物疫情公共危机防控法制体系建设 |
| 4.1.1 我国动物卫生法律体系建设概况 |
| 4.1.2 我国动物疫情公共危机应急管理法规建设情况 |
| 4.2 我国动物疫情应急法制体系建设存在的问题 |
| 4.2.1 立法文本及内容自身存在的问题 |
| 4.2.2 法律文本与实践工作存在脱节 |
| 4.2.3 应急法律体系的操作性存在欠缺 |
| 4.3 其他国家动物疫情防疫法律体系建设经验借鉴 |
| 4.3.1 美国：1+N系统化动物卫生法律体系 |
| 4.3.2 澳大利亚：风险监控为主的动物疫情防控立法 |
| 4.3.3 加拿大：体系健全覆盖面广的疫情防控立法 |
| 4.3.4 欧盟：规范化、人性化的动物卫生立法体系 |
| 4.4 我国动物疫情防控立法的改进方向 |
| 4.4.1 健全动物防疫组织立法,防止立法碎片零散 |
| 4.4.2 树立动物疫情风险意识,健全风险评估机制 |
| 4.4.3 改变动物疫病防控观念,做好系统规范立法 |
| 第5章 动物疫情公共危机防控管理体制建设 |
| 5.1 构建应急管理组织体系的理论基础 |
| 5.1.1 应急管理组织结构设计的原则 |
| 5.1.2 公共危机组织结构的特点 |
| 5.2 我国动物疫情公共危机管理体制建设现状 |
| 5.3 我国动物疫情公共危机管理体制建设的问题及原因 |
| 5.3.1 动物疫情常态应急机构尚未建立 |
| 5.3.2 危机管理指挥联动系统尚且缺乏 |
| 5.3.3 官方组织缺乏与社会力量的整合 |
| 5.3.4 重大动物疫情区域合作机制缺乏 |
| 5.4 动物疫情公共危机防控管理体系的改进 |
| 5.4.1 专业性、常规性指挥机构的设立 |
| 5.4.2 以任务为中心建立复式组织结构 |
| 5.4.3 政府、企业、社会组织相协调 |
| 第6章 动物疫情公共危机防控科技支撑体系建设 |
| 6.1 动物疫病公共危机防控科技支撑体系建设现状 |
| 6.1.1 我国动物疫病防控科研机构发展现状 |
| 6.1.2 我国动物疫情防控科技成果研发情况 |
| 6.1.3 我国动物疫情防控科技成果运用情况 |
| 6.2 我国动物疫情防控科技支撑体系建设的问题 |
| 6.2.1 防控科技人力资本待遇较低、队伍不稳 |
| 6.2.2 防控技术研究投资不足、应用水平偏低 |
| 6.2.3 防控科研项目立项及管理处于无序状态 |
| 6.2.4 科技成果鉴定评价机制忽视了实践需求 |
| 6.2.5 科研成果推广缓慢,不能满足社会需求 |
| 6.3 制约科技支撑体系建设的主要因素分析 |
| 6.3.1 缺乏与时俱进的科学劳动价值评价机制 |
| 6.3.2 缺乏全面、完整、连续的经费资助机制 |
| 6.3.3 缺乏国家层面统一的科技管理服务平台 |
| 6.3.4 缺乏科技需求方主导的制度化评价机制 |
| 6.3.5 缺乏与社会转型相适应的成果转化机制 |
| 6.4 我国动物疫情科技支撑体系建设的途径 |
| 6.4.1 优化薪酬结构,尊重科技人才价值 |
| 6.4.2 改善投资机制,加强基础条件建设 |
| 6.4.3 抓住核心技术,做好管理平台建设 |
| 6.4.4 注重社会需求,完善鉴定评价机制 |
| 6.4.5 重视技术应用,科研与防控相结合 |
| 第7章 动物疫情公共危机防控条件保障建设 |
| 7.1 我国动物疫病财政支持政策概述 |
| 7.1.1 我国动物疫病防控财政支持政策的历史演变 |
| 7.1.2 我国动物疫病防控条件保障基本理念的形成 |
| 7.2 我国动物疫病财政支持存在的问题 |
| 7.2.1 财政支持总量尚显不足 |
| 7.2.2 财政支出结构不够合理 |
| 7.2.3 财政支持的持续性不够 |
| 7.3 我国动物疫病财政支持存在问题的原因分析 |
| 7.3.1 财政投入理念存在差距 |
| 7.3.2 财政分摊机制并未健全 |
| 7.3.3 财政支出方式过于单一 |
| 7.4 美国和澳大利亚动物疫病防控财政支持的基本经验 |
| 7.4.1 财政支持总量充足力度较大 |
| 7.4.2 财政支出结构动态均衡变化 |
| 7.4.3 多元主体共同平衡分摊费用 |
| 7.4.4 疫病消灭计划占据较大比重 |
| 7.5 改进我国动物疫病防控条件保障的建议 |
| 7.5.1 加大和稳定动物疫病危机防控财政支持 |
| 7.5.2 建立多元化动物疫病防控资金分摊机制 |
| 7.5.3 对动物疫病防控重点领域进行合理分派 |
| 7.5.4 合理安排动物疫情应急资金和物资储备 |
| 第8章 政府动物疫情公共危机防控的应急响应 |
| 8.1 动物疫情公共危机防控应急响应的理论框架 |
| 8.2 Matlab回归分析理论模型 |
| 8.3 我国动物疫情防控应急响应的实证研究 |
| 8.4 提升动物疫情公共危机防控的应急响应的路径选择 |
| 第9章 基本结论与政策建议 |
| 9.1 改变观念,建立系统化的动物疫情防控法律体系 |
| 9.2 突破限制,建立开放型的动物疫情防控体制框架 |
| 9.3 创新科技,构建有机性的动物疫情防控科技支撑 |
| 9.4 重视投入,建立稳定性的动物疫情防控条件保障 |
| 第10章 研究不足与展望 |
| 10.1 防控能力建设基础的综合性研究 |
| 10.2 防控能力基础条件的精细化研究 |
| 10.3 防控能力建设效果的全面性评估 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 读博期间科研成果目录 |
（7）减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述部分 |
| 第一章 鱼类无乳链球菌研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现史 |
| 1.2 生物学性状 |
| 1.3 血清型与基因分型 |
| 1.4 不同宿主来源的无乳链球菌交叉感染 |
| 2 传播途径 |
| 3 致病性与致病机理 |
| 3.1 感染宿主及临床症状 |
| 3.2 致病机理 |
| 3.3 毒力因子 |
| 4 诊断 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 病原检测 |
| 4.3 分子快诊技术 |
| 4.4 试剂盒快诊技术 |
| 5 防治现状 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 免疫预防 |
| 5.3 综合防控 |
| 6 小结 |
| 第二章 鱼类核酸疫苗研究进展 |
| 1 核酸疫苗概述 |
| 1.1 核酸疫苗的发展 |
| 1.2 核酸疫苗的构成 |
| 1.3 核酸疫苗的作用机理 |
| 1.4 核酸疫苗的优点和存在的主要问题 |
| 2 鱼类核酸疫苗的研究概况 |
| 2.1 鱼类核酸疫苗的类型 |
| 2.2 鱼类核酸疫苗的接种途径 |
| 2.3 鱼类DNA疫苗的影响因素 |
| 3 鱼类核酸疫苗载体 |
| 3.1 载体种类及特点 |
| 3.2 减毒沙门氏菌载体 |
| 3.3 减毒沙门氏菌载体在鱼类核酸疫苗的应用 |
| 4 鱼类DNA疫苗的佐剂 |
| 5 小结 |
| 第三章 研究目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第四章 罗非鱼无乳链球菌SIP基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株、细胞、载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 无乳链球菌sip基因克隆、鉴定 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 sip基因的PCR扩增 |
| 2.1.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.1.5 PCR产物的T/A连接 |
| 2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.1.7 重组菌DH5α-pMD19-sip的PCR鉴定 |
| 2.1.8 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.9 测序及序列分析 |
| 2.2 重组真核表达质粒的构建、转化及鉴定 |
| 2.2.1 重组真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 重组真核表达质粒的转化 |
| 2.2.3 重组真核表达质粒的鉴定 |
| 2.3 pVAX1-sip在EPC细胞的表达及鉴定 |
| 2.3.1 兔抗无乳链球菌血清的制备 |
| 2.3.2 表达产物间接免疫荧光法鉴定 |
| 2.3.3 Western blot检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 无乳链球菌sip基因的扩增、T克隆及鉴定 |
| 3.2 sip基因测序与结果分析 |
| 3.3 真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 真核表达产物的间接免疫荧光及Western blot检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗候选基因的选择 |
| 4.2 sip基因的T克隆和序列分析 |
| 4.3 真核表达载体的选择 |
| 4.4 真核表达载体的体外表达及检测 |
| 5 小结 |
| 第五章 重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组减毒沙门氏菌核酸疫苗的构建 |
| 2.1.1 沙门氏菌感受态的制备 |
| 2.1.2 沙门氏菌的电转化 |
| 2.1.3 电转重组菌的鉴定 |
| 2.2 重组减毒沙门氏菌的生物学特性鉴定 |
| 2.2.1 重组减毒沙门氏菌的生长特性试验 |
| 2.2.2 重组减毒沙门氏菌体外遗传稳定性试验 |
| 2.2.3 重组减毒沙门氏菌体内遗传稳定性试验 |
| 2.2.4 口服免疫饲料的制备及计数 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组减毒沙门氏菌构建与鉴定 |
| 3.2 重组沙门氏菌生长特性 |
| 3.3 重组质粒在沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 3.4 重组质粒在沙门氏菌的体内稳定性试验 |
| 3.5 烘干及储存温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.1 烘干温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.2 储存温度对饲料中重组菌的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒转化减毒沙门氏菌 |
| 4.2 重组沙门氏菌的稳定性考察 |
| 4.3 重组沙门氏菌在饲料中的稳定性 |
| 5 小结 |
| 第六章 核酸疫苗的安全性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的LD_(50)测定 |
| 2.2 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的病理学观察 |
| 2.3 重组质粒核酸疫苗与罗非鱼染色体的整合性研究 |
| 2.3.1 免疫接种 |
| 2.3.2 组织细胞基因组DNA提取及提纯 |
| 2.3.3 PCR敏感试验 |
| 2.3.4 免疫组pVAX1-sip整合率测检 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组菌对罗非鱼的安全性试验 |
| 3.2 人工感染罗非鱼的病理学观察 |
| 3.3 染色体的整合性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 沙门氏菌的减毒 |
| 4.2 减毒沙门氏菌对罗非鱼的毒力 |
| 4.3 核酸疫苗的基因整合性 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅰ 免疫后罗非鱼组织病理形态 |
| 第七章 核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 核酸质粒在罗非鱼体内的分布 |
| 2.1.1 免疫接种 |
| 2.1.2 组织细胞基因组DNA提取 |
| 2.1.3 PCR检测质粒DNA分布情况 |
| 2.2 免疫组化检测Sip蛋白的分布 |
| 2.2.1 兔高免血清的制备 |
| 2.2.2 Sip蛋白的组织分布检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 核酸质粒的组织分布 |
| 3.2 sip蛋白在免疫后罗非鱼组织体内的定位分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 减毒沙门氏菌的侵入机制 |
| 4.2 核酸质粒及表达蛋白的组织分布 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅱ SIP蛋白的组织分布 |
| 第八章 重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 接种菌株和口服饲料的准备 |
| 2.2 免疫程序及采血 |
| 2.3 免疫指标的检测 |
| 2.3.1 血清总蛋白含量测定 |
| 2.3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 2.3.3 血清溶菌酶活性的测定 |
| 2.3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 2.3.5 血清抗菌活性 |
| 2.3.6 采用ELISA检测抗体效价 |
| 2.3.7 核酸疫苗对罗非鱼细胞因子转录影响 |
| 2.3.8 免疫保护力测定 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清总蛋白含量的测定 |
| 3.1.1 灌胃组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.1.2 拌料组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 3.2.1 灌胃组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.2.2 拌料组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.3 血清溶菌酶活性含量测定 |
| 3.3.1 灌胃组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.3.2 拌料组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 3.4.1 灌胃组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.4.2 拌料组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.5 血清抗菌活性测定 |
| 3.6 血清抗体效价 |
| 3.6.1 灌胃组罗非鱼抗体效价 |
| 3.6.2 拌料组罗非鱼抗体效价 |
| 3.7 罗非鱼IL-1β和TNF-α的转录水平变化 |
| 3.8 免疫保护率 |
| 3.8.1 灌胃组免疫保护率 |
| 3.8.2 拌料组免疫保护率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗对非特异性免疫的影响 |
| 4.2 核酸疫苗对抗体效价影响 |
| 4.3 核酸疫苗对细胞因子的影响 |
| 4.4 不同免疫程序对保护率的影响 |
| 4.5 推荐免疫程序 |
| 5 小结 |
| 第九章 结论与创新 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（8）白细胞介素-2在动物疾病防治中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 IL-2作为免疫佐剂提高疫苗免疫效果 |
| 1.1 增强常规疫苗免疫效果 |
| 1.2 增强基因工程疫苗免疫效果 |
| 2 在动物感染性疾病防治中的应用 |
| 2.1 防治细菌性感染疾病 |
| 2.2 防治病毒性感染疾病 |
| 2.3 防治寄生虫性感染疾病 |
| 3 问题与展望 |
（9）草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 草鱼出血病的流行病学和病原研究 |
| 1.2 草鱼呼肠孤病毒的研究进展 |
| 1.2.1 病毒结构研究 |
| 1.2.2 理化特性和感染特性研究 |
| 1.2.3 病毒蛋白及免疫性研究 |
| 1.2.4 病毒的检测 |
| 1.3 草鱼出血病免疫防治研究进展 |
| 1.3.1 环境对草鱼免疫防治的影响 |
| 1.3.2 干扰素的免疫调节功能 |
| 1.3.3 免疫增强剂的应用 |
| 1.3.4 疫苗防治研究 |
| 1.4 核酸疫苗的研究与应用 |
| 1.4.1 核酸疫苗的构建与作用机理 |
| 1.4.2 核酸疫苗的优点与存在的问题 |
| 1.4.3 核酸疫苗在鱼类免疫中的应用 |
| 1.5 研究目的与实验设计 |
| 第2章 目的基因VP7的扩增、克隆与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 VP7基因的扩增 |
| 2.2.2 VP7基因的T载体克隆与鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 VP7基因的扩增结果 |
| 2.3.2 VP7基因的T载体克隆及测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 目的蛋白VP7免疫原性的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 VP7基因的pET-28a(+)载体克隆与鉴定 |
| 3.2.2 VP7蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 VP7蛋白的SDS-PAGE及Western Blot分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组载体pET-VP7鉴定结果 |
| 3.3.2 SDS-PAGE及Western Blot分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 目的基因VP7核酸疫苗的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 β-肌动蛋白启动子的扩增与克隆 |
| 4.2.2 VP7双基因的克隆 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 β-肌动蛋白启动子的扩增与克隆结果 |
| 4.3.2 VP7双基因的克隆结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 核酸疫苗的免疫效果研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 重组质粒与实验鱼的处理 |
| 5.2.2 RT-PCR检测核酸疫苗的转录 |
| 5.2.3 抗体水平的测定 |
| 5.2.4 攻毒用毒株的LD_(50)测定 |
| 5.2.5 人工感染试验 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 RT-PCR检测核酸疫苗的转录结果 |
| 5.3.2 抗体水平的测定 |
| 5.3.3 LD_(50)测定结果 |
| 5.3.4 死亡率和免疫保护力 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录：读研期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 草鱼出血病病毒研究进展 |
| 1.1 草鱼出血病的症状及流行规律 |
| 1.2 GCRV形态特征 |
| 1.3 GCRV理化特性 |
| 1.4 病毒组织嗜性和病理变化 |
| 1.5 GCRV分子生物学 |
| 1.6 GCRV的免疫学效应 |
| 1.7 草鱼出血病免疫防治研究 |
| 2 家蚕杆状病毒及其表达系统 |
| 2.1 家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建 |
| 2.2 家蚕杆状病毒表达系统的优点 |
| 2.3 家蚕杆状病毒表达系统存在的缺陷 |
| 2.4 利用杆状病毒作为表达载体的疫苗研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究目的和研究内容 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 研究的主要内容 |
| 2.1 草鱼出血病病毒(GCRV)vp6核酸疫苗的构建及免疫效果评估 |
| 2.2 GCRV VP6蛋白对草鱼出血病的免疫效果评估 |
| 2.3 GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评估 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 实验一般材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 载体与菌种 |
| 1.2 生物材料 |
| 1.3 工具酶及试剂盒 |
| 1.4 其它试剂 |
| 1.5 主要实验试剂与配制 |
| 1.6 免疫组化相关试剂 |
| 1.7 间接凝集法测抗体效价相关试剂 |
| 2 常用仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 TG1感受态细胞的制备 |
| 3.2 DNA的连接反应体系 |
| 3.3 连接产物的转化 |
| 3.4 碱裂解法少量制备质粒DNA |
| 3.5 DNA的酶切反应体系 |
| 3.6 PCR扩增目的片段 |
| 3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.8 目的片段的分离和回收 |
| 3.9 Bac to Bac系统 |
| 3.10 SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 3.11 Western blotting |
| 3.12 多克隆抗体的制备 |
| 3.13 过柱纯化蛋白 |
| 3.14 过柱纯化蛋白含量测定(Bradford蛋白质测定法) |
| 3.15 免疫组化 |
| 3.16 间接凝集法测抗体效价 |
| 参考文献 |
| 第四章 草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GCRV vp6基因的序列分析 |
| 2.2 核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6的鉴定 |
| 2.3 免疫后鱼体中vp6基因的表达 |
| 2.4 核酸疫苗免疫鱼后抗体效价检测 |
| 2.5 核酸疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 材料方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表达载体pET28a(+)-VP6的鉴定 |
| 2.2 重组VP6蛋白的鉴定 |
| 2.3 诱导表达时间的优化 |
| 2.4 VP6重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.5 重组VP6蛋白的纯化 |
| 2.6 重组VP6蛋白的免疫效果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评价 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组病毒BacFish-VP6的产生及鉴定 |
| 2.2 病毒滴度的测定 |
| 2.3 VP6抗体的鉴定 |
| 2.4 重组VP6蛋白在细胞和五龄家蚕中的表达 |
| 2.5 口服免疫鱼体中vp6特异性抗体的产生规律 |
| 2.6 口服免疫后鱼血中vp6 mRNA的检测 |
| 2.7 免疫焚光检测免疫草鱼组织和BacFish-VP6感染CIK细胞中的VP6蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 1 已取得的成果 |
| 2 有待进行的研究 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 1 研究论文 |
| 2 GenBank登录序列 |
| 资助项目 |
| 附录 |
| 1 缩略词表 |
| 2 部分质粒图谱 |
| 致谢 |
四、核酸疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展（论文参考文献）
- [1]鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA疫苗、卵黄抗体的研制及鱼卵中鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术[D]. 李坤. 苏州大学, 2018(01)
- [2]ADV全基因优化核酸疫苗的构建及其免疫效果的初步研究[D]. 孙利杰. 吉林农业大学, 2017(01)
- [3]ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究[D]. 赖隆永. 福建农林大学, 2017(01)
- [4]基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用[J]. 贺明艳. 中国畜牧兽医文摘, 2015(11)
- [5]IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究[D]. 刘嫒. 贵州大学, 2016(03)
- [6]动物疫情公共危机政府防控能力建设研究[D]. 王薇. 湖南农业大学, 2015(08)
- [7]减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究[D]. 黄凌远. 四川农业大学, 2014(10)
- [8]白细胞介素-2在动物疾病防治中的应用进展[J]. 沙万里,杨桂连,王春凤. 中国兽药杂志, 2013(04)
- [9]草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究[D]. 徐诗英. 南京师范大学, 2012(06)
- [10]草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫效果研究[D]. 刘林. 苏州大学, 2012(06)