一、用吐温20改进骨髓细胞染色体制备方法（论文文献综述）
张波[1]（2021）在《Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制》文中认为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP]作为最常用邻苯二甲酸酯（phthalate esters,PAEs）类的增塑剂,广泛存在于环境介质中,可通过呼吸、饮食和皮肤接触等途径进入婴幼儿体内。进入体内的DEHP可在肝脏和小肠细胞中首先水解并通过其他代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]对机体产生毒性作用。神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是最常见的小儿颅外恶性肿瘤,严重危害儿童的生命健康。一些环境内分泌干扰物能够促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。DEHP作为一种具有神经毒性作用的环境内分泌干扰物可能影响神经母细胞瘤的增殖和迁移,但其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞并给予MEHP暴露,明确MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖和迁移的影响;通过抑制Notch信号通路,探讨Notch信号通路在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用机制,可为防治神经母细胞瘤和DEHP的健康损害提供科学依据。第一部分 MEHP对SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期和细胞凋亡关键基因在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露,CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率;根据CCK8结果确定染毒剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、低剂量组（10μM MEHP）、中剂量组（50μM MEHP）、高剂量组（250μM MEHP）,暴露时间为12h和24h。采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR方法检测细胞周期、凋亡关键基因C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2 m RNA表达水平;western blot方法检测细胞周期、凋亡关键蛋白C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析,MEHP暴露组和对照组多组间差异比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,组间两两比较采用LSD检验法（Least-Significant Difference）,非正态数据采用秩和检验。检验水准为α=0.05。结果:1.MEHP暴露12h和24h后,各染毒剂量组SH-SY5Y细胞存活率均明显高于对照组（P<0.05）;随着暴露时间的增加,32、64、128、250、500和1000μM MEHP组细胞存活率明显升高（P<0.05）。2.MEHP暴露12h和24h后,MEHP暴露组G1期细胞数量均显着减少（P<0.05）,MEHP组细胞S期细胞百分比增加（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h,MEHP暴露组SH-SY5Y细胞凋亡水平显着减低（P<0.05）;且24h组250μM MEHP暴露组细胞凋亡水平低于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组C-MYC、Cyclin D1 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）;CDK4和P27的m RNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞Bax m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）;Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可以调节SH-SY5Y细胞周期、抑制细胞凋亡,促进SH-SY5Y细胞增殖。2.MEHP暴露能够上调细胞周期关键蛋白C-MYC、Cyclin D1的表达,加速细胞周期,促进SH-SY5Y细胞增殖。3.MEHP暴露能够调节细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,抑制SHSY5Y细胞凋亡,促进神经母细胞瘤增殖。第二部分 MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响,探讨细胞迁移关键基因和趋化因子在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞培养和实验分组与染毒同第一部分。采用ELISA法检测趋化因子VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8分泌水平;划痕实验检测细胞迁移水平;transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;实时荧光定量PCR方法检测细胞迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、TWIST、Vimentin、HIF-1α、GPR81和Versican m RNA表达水平;western blot方法检测细胞迁移关键蛋白表达水平。结果:1.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的迁移距离,MEHP暴露24h后,细胞的迁移距离显着增加（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的侵袭能力,中、高剂量MEHP暴露组细胞侵袭能力显着升高（P<0.05）。3.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的VEGF、PDGF以及TGF-β1的分泌水平,且24h组VEGF、PDGF和TGF-β1水平显着高于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞E-Cadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着低于对照组和DMSO组（P<0.05）;高剂量组NCadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于其余各组（P<0.05）;与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞N-Cadherin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,高剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组、DMSO组和低剂量组;与12h暴露组相比,24h各剂量组Vimentin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中、高剂量组SNAIL基因m RNA和蛋白表达升高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组HIF-1α基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞HIF-1αm RNA的表达水平更高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组Versican基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组和DMSO组（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量SHSY5Y细胞Versican m RNA的表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。2.MEHP暴露可调控迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、Vimentin、HIF-1α和Versican的表达,促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。3.MEHP暴露可能通过上调趋化因子VEGF、PDGF和TGF-β1的分泌,增强SH-SY5Y细胞的迁移能力。第三部分 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响,探讨Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖和迁移以及相关基因表达的关系。方法:实验分组与染毒同第一部分。实时荧光定量PCR方法检测细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平;western blot方法检测细胞Notch信号通路基因的蛋白表达水平。采用Pearson相关分析检验Notch信号通路蛋白表达与SH-SY5Y细胞增殖、迁移及其相关蛋白的相关性。结果:1.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Dll-1和Jagged-2 m RNA表达水平,降低Dll-4 m RNA表达水平（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3和Jagged-2蛋白表达水平,降低Dll-4蛋白表达水平（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4等蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,细胞周期关键蛋白CDK4表达水平与Dll-1蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Cyclin D1和C-MYC蛋白表达水平与Notch-1、Notch-2、Notch-4、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。MEHP暴露12h和24h后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平与Notch-1、Notch-4和Dll-4蛋白表达水平显着相关,Bcl-2的表达水平与Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力与Notch-1、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。6.MEHP暴露12h和24h后,细胞迁移相关蛋白E-Cadherin表达水平与Notch-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;N-Cadherin蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;SNAIL蛋白表达水平与Notch-4、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Vimentin和HIF-1α蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Versican蛋白表达水平与Notch-1、Notch-4和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。7.MEHP暴露12h和24h后,趋化因子VEGF的表达水平与Notch-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;PDGF的表达水平与Notch-1、Notch-4、Dll-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;TGF-β1的表达水平与Notch-3和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;CXCL-8的表达水平与Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可上调Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-2的蛋白表达水平,下调Dll-4的蛋白表达水平。2.MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞的增殖和迁移与Notch通路蛋白表达密切相关。3.Notch信号通路可能通过调节细胞增殖和迁移关键基因的表达在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能通过调节细胞趋化因子的分泌在MEHP促进SHSY5Y细胞迁移中发挥作用。第四部分 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制目的:明确Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制。方法:采用DAPT抑制Notch信号通路表达,western blot方法检测Hes-1蛋白表达水平,检测Notch信号通路的抑制效率。暴露剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、DAPT组（50μM DAPT）、MEHP组（250μM MEHP）和MEHP+DAPT组（50μM DAPT+250μM MEHP）,暴露时间为24h。Western blot方法检测细胞Notch信号通路抑制后细胞增殖和迁移相关蛋白表达水平,其余实验方法同第一部分。数据处理与分析方法同第一部分。结果:1.SH-SY5Y细胞DAPT暴露后24h后,各剂量组（0、5、10、25、50、100μM DAPT）细胞存活率无明显变化（P>0.05）;经50μM DAPT处理的SH-SY5Y细胞内Hes-1蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,Notch信号通路被有效抑制。2.DAPT可显着逆转MEHP所致SH-SY5Y细胞S期细胞数量增多。3.细胞凋亡结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）。4.细胞迁移情况结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞迁移距离显着增加（P<0.05）;与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞迁移距离降低,差异无统计学意义（P>0.05）。5.细胞侵袭结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞侵袭水平显着增加（P<0.05）,与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞侵袭水平降低,差异无统计学意义（P>0.05）。6.趋化因子结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8水平显着增加（P<0.05）;且DAPT+MEHP组细胞VEGF和TGF-β1水平显着低于MEHP组（P<0.05）。7.细胞周期和凋亡相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞C-MYC、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组C-MYC、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。8.细胞迁移相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP细胞Vimentin、SNAIL、HIF-1α和Versican蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;MEHP组和DAPT+MEHP组细胞E-Cadherin蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组HIF-1α和N-Cadherin蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.Notch信号通路能在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中起正向调控作用。2.Notch信号通路可能通过调节细胞周期关键蛋白Cyclin D1、C-MYC,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖中发挥作用。3.Notch信号通路可能通过调节细胞迁移关键蛋白N-Cadherin的表达在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能影响肿瘤细胞趋化因子VEGF和TGF-β1的分泌在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。
沙梦琪[2]（2021）在《儿童急性白血病中PD-1、PD-L1及PD-L2的表达及临床意义》文中指出目的:（1）总结分析儿童急性白血病的临床特征、生存环境等因素与危险度、复发及生存的关系,寻找与预后相关的危险因素;（2）探讨PD-1、PD-L1及PD-L2在儿童急性白血病中的表达及临床意义。方法:（1）选取2015年1月～2020年9月在我院确诊的240例初诊急性白血病患儿,收集临床特征、生存环境、家庭因素等相关资料,分析其与危险度、复发及生存的关系。（2）实验分组:初诊组、缓解组、复发组及对照组,分别采集患儿初诊、缓解、复发的骨髓,同期非恶性肿瘤患儿的骨髓作为对照,运用q RT-PCR和Western Blot法分别检测PD-1、PD-L1及PD-L2的m RNA表达水平以及蛋白表达水平。（3）将PD-1、PD-L1及PD-L2的表达情况与临床特征、生存情况等进行统计学分析。结果:（1）结果显示,年龄、WBC、外周血幼稚细胞比例、染色体核型与AL患儿危险度分层有关;诱导化疗第15天骨髓中幼稚细胞的比例与ALL患儿危险度有关（P<0.05）,但性别、粒/淋比、贫血程度、肝脾肿大、淋巴结肿大、出生胎次、出生方式、居住环境、父母离异、父母长期饮酒史、留守儿童与否无关;Logistic回归分析发现,AL患儿LDH水平与复发相关（P<0.05）,年龄、性别、WBC、HB、PLT、NLR、淋巴结及肝脾肿大、基因突变、生活环境等对复发无影响;Kaplan-Meier及Cox多因素回归分析显示,WBC、外周血幼稚细胞比例、PLT、MRD与AL患儿总生存率（overall survival,OS）相关（P<0.05）,约登指数显示WBC和LDH的临界值分别为10.35×109/L、692.5U/L;性别、胎次、生产方式、胎龄、父母长期吸烟或饮酒、父母文化程度、父母离异、患儿饮食习惯、患儿留守情况、居住环境、肝脾肿大、淋巴结肿大等与OS无关。（2）在ALL患儿中,初诊组及复发组的PD-1、PD-L1及PD-L2 m RNA表达水平较对照组及缓解组均明显降低（P<0.05）,且复发组较初诊组降低更明显（P<0.05）;与对照组及缓解组相比,初诊组及复发组PD-1、PD-L1及PD-L2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,且复发组升高更显着;PD-1的表达与缓解时间、复发相关,PD-1表达越高,达到缓解的时间越长,复发风险越大;Kaplan-Meier生存分析结果显示,PD-1、PD-L1及PD-L2表达与OS无关。（3）在AML患儿中,初诊组及复发组的PD-1、PD-L1及PD-L2 m RNA表达水平较对照组及缓解组均明显降低（P<0.05）,复发组降低更明显;与对照组及缓解组相比,初诊组与复发组PD-1、PD-L1及PD-L2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,且复发组的蛋白表达升高更显着;PD-1的表达与危险度相关,高危组PD-1表达较标危组升高（P<0.05）;Kaplan-Meier生存分析结果显示,PD-1的表达与OS相关（P<0.05）,PD-L1及PD-L2的表达与OS无关。结论:（1）外周血白细胞计数、外周血小板计数、乳酸脱氢酶及微小残留病水平是儿童急性白血病预后不良的独立危险因素;年龄、外周血白细胞计数、幼稚细胞比例、染色体核型异常会影响危险度分层;（2）急性白血病患儿存在PD-1、PD-L1及PD-L2的高表达,复发时表达更高;（3）ALL患儿PD-1的高表达会影响病情缓解的时间;PD-1高表达与复发风险相关,PD-1表达越高,复发风险较大,PD-1可能是病情缓解及复发的预测指标。（4）AML患儿PD-1的高表达与危险度及总生存率相关,而PD-L1和PD-L2对急性白血病患儿复发风险及总生存率无明显相关性。
李姝仪[3]（2021）在《ACO疾病动物模型的建立及其潜在机制靶点、候选药物的发现研究》文中提出哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠（Asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap,ACO）是一种严重的临床综合征,指患者同时具有哮喘和COPD疾病临床特征。就单纯哮喘或COPD而言,ACO患者临床症状较为严重、发作次数较为频繁。由此导致了患者生活质量得不到提升、生存周期缩短,对患者生存质量和生命安全的威胁严重,而且,ACO患者的医疗占用率和医疗费用都大幅度上升,这对社会经济与医疗资源都造成了巨大的压力。ACO不仅在其临床诊断和治疗中存在许多困难和不确定性,而且,其治疗药物的筛选与评估尚未起步,特别是其疾病动物模型尚未完全建立,严重影响了其疾病靶点机制揭示和有效药物的发现。因此,基于ACO临床疾病特征,建立ACO疾病动物模型,探索ACO与哮喘、COPD病理机制的共性和异性,对其有针对性治疗药物的开发尤为重要。鉴于此,本论文首先以ACO临床疾病特征为导向,采用OVA、LPS和香烟烟雾等哮喘和COPD模型条件叠合,诱导建立了 ACO炎症小鼠模型;进一步采用RNA-seq检测技术,探讨了 ACO与哮喘、COPD小鼠肺组织基因表达的差异,发现ACO炎症的潜在机制靶点;同时,基于天然来源化合物白藜芦醇在疾病治疗中的广泛研究,以及团队前期对其二聚体来源化合物在哮喘和COPD气道炎症研究中发现的良好疗效,采用网络药理学方法,挖掘白藜芦醇疾病靶点的文献数据,创建白藜芦醇-疾病-靶点网络,探究此类药物在ACO中的潜在作用靶点,与RNA-seq组学研究结果结合,探寻该类化合物在ACO中的潜在机制靶点;并进一步参照白藜芦醇二聚体化学结构特性,合成全新了 3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2,对其治疗ACO炎症的作用及潜在机制靶点进行初步研究。现将主要研究结果总结如下:1.基于ACO临床疾病特征,采用OVA、LPS和香烟烟雾等哮喘和COPD模型条件叠合,建立了与ACO临床基本特征相吻合的小鼠模型,模型小鼠在肺组织病理学变化、肺泡灌洗液中炎症因子水平等方面显示出哮喘和COPD重叠特征,较好的模拟了 ACO的部分临床病理特征。该模型可为ACO的病理机制研究和潜在候选药物的筛选与评价提供工具。2.采用RNA-seq检测技术,发现ACO小鼠肺组织中的基因表达差异。研究结果发现了 ACO小鼠潜在的6324个差异表达基因,其中下调基因2717个（42.7%）,上调基因3607个（57.3%）,具有肺炎、肺纤维化、慢性阻塞性气道疾病、肺肿瘤、类风湿性关节炎等基因谱特征,符合ACO临床特征;而且,ACO肺部炎症和纤维化的潜在分子机制主要与HLA-DRA、SYK、CTLA4、VAV1、NRAS和JAK3信号通路有关。该研究结果为ACO的机制研究及其药物发现提供基础思路和依据。3.基于白藜芦醇疾病治疗潜在靶点的文献报道数据,借助网络药理学举措,构建白藜芦醇-疾病-靶点网络,除此之外,通过GO富集分析与KEGG通路分析,明确其关键信号通路及分子机制,发现了与其相关的STAT3、AKT1、SRC、JAK和VEGFA等靶点,以及T细胞受体、MAPK、Toll样受体、FcεRI、TNF等多个信号通路。该研究结果挖掘发现了白藜芦醇等二苯乙烯类化合物在呼吸系统疾病中的潜在靶点,为该类化合物的改构优化及其在呼吸系统疾病中的开发研究提供启示。4.基于上述研究结果,对3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2抗ACO气道炎症作用及作用机制进行研究。研究结果显示,EAPP-2体内能显着抑制ACO小鼠炎症疾病特征,显着减少ACO小鼠肺部炎症细胞浸润、改善肺组织的炎性病理变化、降低肺泡灌洗液中炎症细胞和炎症因子的水平、减少外周血中总IgE和IgG1的生成,以及在体外有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。而且,EAPP-2能显着减少ACO气道炎症小鼠肺组织和LPS诱导的RAW264.7细胞中Syk、NF-κB蛋白的表达及磷酸化以及NLRP3和iNOS蛋白的表达,结果提示,EAPP-2的抗ACO炎症作用可能部分是通过抑制Syk的表达和磷酸化,从而抑制NF-κB和NLRP3通路实现的。该研究结果为EAPP-2在ACO治疗中的开发提供初步依据,且可为以Syk为靶点的ACO治疗药物发现提供参考。
白玲[4]（2021）在《CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究》文中研究说明背景:急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）的免疫治疗发展迅速,使复发难治B-ALL的有效率从30%提高到90%;但由于其副作用和疗效仍然有限而限制了其应用。因此,寻找减少毒副作用和延长生存期的新策略至关重要。TLR9激动剂作为一种免疫佐剂在抗肿瘤治疗中已显示出良好的安全性和有效性,其不仅具有免疫调节作用,对于肿瘤细胞也具有直接作用。它能够在增强抗肿瘤免疫的同时影响肿瘤的抑制性免疫微环境,从而促进免疫系统更好地识别肿瘤,实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转变。然而,既往的研究主要集中在其免疫调节方面,而对于肿瘤的直接作用常被忽略,尤其是对于B-ALL的直接作用尚无报道。通过我们前期研究发现:TLR9激动剂能够抑制B-ALL增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞而清除B-ALL,但对于不同类型B-ALL的作用具有异质性。因此,明确TLR9激动剂在不同类型B-ALL患者中的作用及分子机制,可能有助于发掘TLR9激动剂治疗有效的生物标志物和患者特征,优化B-ALL的精准治疗。研究目的:1.明确TLR9表达与B-ALL患者临床病理特征及预后的关系;2.探索CpG 685对B-ALL的作用;3.探讨CpG 685诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,发掘治疗有效的关键生物标志物;4.寻找针对不同类型B-ALL的治疗策略以及CpG 685应用有效的预测标志物。研究方法：1.通过实时定量RT-PCR和流式细胞术检测TLR9的表达,应用统计学分析明确TLR9表达与临床病理特征及预后的关系;2.通过WST-1增殖实验、AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测和流式细胞术检测CpG 685在不同类型B-ALL中的作用,明确CpG 685对B-ALL细胞体外直接作用的差异;3.通过构建NCG B-ALL小鼠移植瘤模型,应用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏和外周血中肿瘤负荷的变化和观察小鼠生存期,明确CpG 685对B-ALL细胞在体内的作用差异;4.通过有或无相关信号通路及关键分子抑制剂预处理,在CpG 685刺激后,应用Western Blot、蛋白纯化及免疫沉淀、免疫荧光共定位、染色质免疫共沉淀检测TLR9下游信号通路相关蛋白的表达和基因的作用位点;通过RT-PCR和实时定量RT-PCR明确通路涉及的mi RNA的表达情况;通过对其作用机制的探究,发掘CpG 685治疗B-ALL有效的预测生物标志物;5.通过Ficol密度梯度离心法分离临床样本中的外周血单个核细胞,在有或无CpG 685刺激后,明确基于细胞系发现的预测标志物在临床应用中的可行性;6.通过在BALB/C小鼠中构建肿瘤移植瘤模型,应用流式细胞术检测各种免疫细胞所占小鼠淋巴细胞的比例,明确CpG ODN对小鼠机体抗肿瘤免疫的调节情况。研究结果:1.相比于正常人的外周血单个核细胞,TLR9在B-ALL患者的外周血单个核细胞中高表达;并且,相比于TLR9低表达组,高表达组的B-ALL患者预后较好;2.CpG 685对B-ALL细胞的作用存在异质性。对于BLIN-1细胞,其能抑制增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞、上调共刺激分子及免疫调节分子、降低小鼠骨髓、脾脏和外周的肿瘤负荷、延长生存期;而对于Sup-B15细胞无明显作用;3.BLIN-1细胞中,CpG 685通过P38/P53/BAX信号通路,依赖C-MYC过表达诱导B-ALL细胞凋亡。过表达的C-MYC可以促进P53稳定,诱导P53磷酸化,增强BAX转录,并介导BAX激活相关构象改变。4.伊马替尼和CpG 685联合应用于Ph（+）B-ALL细胞逆转两药单独应用的耐药、降低小鼠肿瘤负荷、延长小鼠生存期;伊马替尼能促进BAX的激活,同时抑制C-MYC低表达的抗凋亡效应;而CpG 685通过下调mi R-21,上调PTEN,进而逆转了PI3K/AKT/m TOR通路过度激活所致的伊马替尼耐药;5.临床患者中,CpG 685可直接诱导PBMC C-MYC高表达且Ph染色体阴性的B-ALL患者的原代B-ALL细胞凋亡;6.CpG ODN能够促进B细胞、pDC细胞的增殖,抑制MDSC细胞增殖,进而增加NK细胞、T细胞的比例,促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,促进抗肿瘤免疫的激活。结论:1.TLR9的表达与B-ALL患者的预后相关;2.TLR9是B-ALL潜在的治疗靶点,CpG 685可通过P38/P53/BAX信号通路诱导B-ALL细胞凋亡,该过程依赖于C-MYC的高表达;3.C-MYC可能是协助预测CpG 685单药对B-ALL患者有效的预测标志物;4.而对于Ph（+）B-ALL,联合应用伊马替尼和CpG 685可逆转两药单独应用的耐药。该联合治疗不仅能直接诱导Ph（+）B-ALL细胞凋亡,还增强了B-ALL细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞的识别。5.CpG ODN能够通过促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,激活抗肿瘤免疫。
李亚琪[5]（2021）在《二氯喹啉酸和苄嘧磺隆免疫分析方法研究》文中认为免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强,可以短时间内检测大量样品的特点使其在农药残留检测中具有重要的应用价值。本研究以稻田常用除草剂二氯喹啉酸、苄嘧磺隆为研究对象,制备了二氯喹啉酸和苄嘧磺隆单克隆抗体,在优化免疫分析因素和评价方法的灵敏度、特异性、准确度、精密度等指标的基础上,建立了二氯喹啉酸和苄嘧磺隆间接竞争酶联免疫分析方法（ic-ELISA）,并将方法应用于土壤、水以及农产品中二氯喹啉酸和苄嘧磺隆的残留分析。本研究所建立的二氯喹啉酸和苄嘧磺隆免疫分析方法,可为相关除草剂残留监测和控制、保障农产品质量和环境安全水平提供技术支持。一、对二氯喹啉酸、苄嘧磺隆结构进行化学修饰制备得到半抗原,通过氢核磁共振对所合成的半抗原进行验证,表明半抗原制备成功。采用碳二亚胺（NHS/DCC）法,将半抗原分别与BSA、OVA载体蛋白偶联,制备得到免疫抗原、包被抗原,并通过紫外分光光度法对所合成的人工抗原进行验证,表明人工抗原偶联成功。二、利用二氯喹啉酸、苄嘧磺隆免疫抗原免疫小白鼠获得能够稳定分泌二氯喹啉酸、苄嘧磺隆单克隆抗体的细胞单株。当包被抗原的浓度为1 mg/L时,二氯喹啉酸、苄嘧磺隆杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体效价分别为2×105、2.4×106。将细胞单株注入小鼠腹腔诱导其产生腹水,利用辛酸-硫酸铵法纯化腹水,制备得到4个二氯喹啉酸单克隆抗体、2个苄嘧磺隆单克隆抗体,选择最优效价及抑制的二氯喹啉酸D12、苄嘧磺隆G11单克隆抗体用于后续实验。三、通过优化免疫分析因素确定二氯喹啉酸ic-ELISA的最佳反应条件:二氯喹啉酸包被抗原浓度为0.25 mg/L,抗体稀释倍数为20000倍,即抗体浓度为2.52 mg/L,甲醇含量为10%,p H为7.5,Na+浓度为0.4 mol/L。在最佳免疫反应条件下,建立了二氯喹啉酸ic-ELISA竞争标准曲线,该方法的IC50为0.138 mg/L,LOD(IC10)为0.007 mg/L,检测范围(IC10-IC90)为0.007-1.288mg/L。交叉反应试验表明,二氯喹啉酸与其结构类似物交叉反应率均低于2%,不存在明显的交叉反应。二氯喹啉酸ic-ELISA在板内变异系数为2.79-7.77%,板间变异系数为2.74-7.28%。二氯喹啉酸在河水、土壤、大米中的平均添加回收率在90.36-107.21%之间,变异系数在0.27-6.51%。四、通过对免疫条件优化,得出苄嘧磺隆ic-ELISA法最佳的反应条件为:苄嘧磺隆包被抗原浓度为0.5 mg/L,抗体稀释倍数为27000倍,即抗体浓度为1.37 mg/L,甲醇含量为5%,p H为8.5,Na+浓度为0.5 mol/L。在最佳免疫反应条件下,建立苄嘧磺隆ic-ELISA竞争标准曲线。苄嘧磺隆ic-ELISA的IC50为1.377 mg/L,LOD(IC10)为0.0249 mg/L,检测范围(IC10-IC90)为0.0249-50.132 mg/L。通过交叉反应试验表明,苄嘧磺隆与其结构类似物的交叉反应率均低于4%,不存在明显的交叉反应。苄嘧磺隆ic-ELISA在板内变异系数为1.98-7.29%,板间变异系数为2.30-7.28%。苄嘧磺隆在水样、土壤、大米中的平均添加回收率在74.99-95.80%之间,变异系数在1.19-7.05%。
李健阳[6]（2021）在《绝经后妇女骨量丢失阶段证候分析及绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的机制研究》文中认为目的1.分析绝经后妇女在骨量丢失阶段、各年龄段的中医证候特征。2.将绝经后妇女依据中医辨证、骨量丢失阶段、骨折史进行分组,比较CLCF1的表达差异,进一步验证CLCF1与PMOP肾阴虚证的相关性。3.探究调控CLCF1对OPG/RANKL/RANK系统的影响。方法1.通过回顾性研究2007年至2020年收集的2823例骨量丢失阶段的资料,分析福州地区绝经后妇女在骨量丢失阶段的症状、证候、兼证特征。2.将骨质疏松诊断与中医辨证结合,对受试者进行分组后,检测外周血单个核细胞中CLCF1的m RNA、蛋白水平,比较CLCF1在各组的表达差异。3.使用过表达技术、CRISPR/Cas9技术敲除THP-1细胞中的CLCF1基因,检测OPG、RANKL、IFNα、IFNγ的表达变化,检测THP-1细胞生物行为学的变化。结果1.在各阶段,症状比例最高的为健忘,且随骨量丢失的程度加重,发脱齿摇、下肢抽筋、口干咽燥、失眠、倦怠乏力、头晕、耳鸣、多梦、畏寒肢冷、胸闷、目眩的比例呈线性上升趋势（P<0.05）;肢体麻木的比例呈线性下降趋势（P<0.05）。在各阶段,虚证比例最高的为肾虚,且随骨量丢失的程度加重,肾虚、心虚、肝虚、脾虚、气虚比例呈线性上升趋势（P<0.05）。在各阶段,肾虚兼证比例最高的为心虚、脾虚,且随骨量丢失的程度加重,肾虚兼心虚、肾虚兼脾虚的比例呈线性上升趋势（P<0.05）。在各阶段,常见证型比例最高的为肾虚血瘀,且随骨量丢失的程度加重,肾虚血瘀的比例呈线性上升趋势（P<0.05）。在各阶段的各年龄段,主要症状、虚证、肾虚兼证、常见证型基本与各阶段整体特征相符。2.在中医证型分组中,PMOP肾阴虚组的CLCF1蛋白水平显着低于无PMOP肾阴虚组、PMOP无肾虚组（P<0.05）,且PMOP肾阴虚组的CLCF1蛋白水平具有低于无PMOP对照组的趋势（P>0.05）;在骨量丢失分组中,骨质疏松组的CLCF1蛋白水平低于骨量正常组（P<0.05）;在骨折史分组中,骨折组的CLCF1蛋白水平具有低于无骨折组的趋势（P>0.05）。此外,CLCF1蛋白水平与腰椎骨密度呈显着正相关关系（r>0,P<0.05）,与骨质疏松的发生呈显着负相关关系（r<0,P<0.05）,与骨折的发生呈不显着的负相关关系（r<0,P>0.05）。3.CLCF1过表达后,OPG蛋白表达上升（P<0.05）,RANKL蛋白表达无明显变化（P>0.05）,OPG/RANKL比值显着上升（P<0.01）,IFNα、IFNγ蛋白表达下降（P<0.05）,THP-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力升高（P<0.05）;CLCF1敲除后,OPG蛋白表达下降（P<0.05）,RANKL蛋白表达无明显变化（P>0.05）,OPG/RANKL比值具有下降趋势（P>0.05）,IFNα、IFNγ的蛋白表达上升（P<0.05）,THP-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力下降（P<0.05）,早期凋亡率上升（P<0.05）。结论1.大多数绝经后妇女在低骨量阶段已表现健忘、腰脊痛、发脱齿摇、腰膝酸软、下肢抽筋等症状,与肾阴虚证相关,且与骨质疏松阶段、严重骨质疏松阶段主要症状相同,其比例随骨量丢失加重而上升,提示临床应尽早干预,缓解症状。2.骨量丢失阶段均表现出肾虚、肝虚为主的虚证,肝肾阴虚、肾虚血瘀为主的临床常见证型,且肾虚的兼证以肝虚、心虚、脾虚为主,提示OP的证型复杂,临床防治应以肝肾为主,同时重视心虚等兼证的治疗。3.CLCF1是PMOP肾阴虚证的关联基因,其蛋白表达与腰椎骨密度呈显着正相关关系,与骨质疏松的发生呈显着负相关关系,有望为PMOP肾阴虚证的分子标志物、治疗靶点。4.CLCF1的表达变化会影响OPG/RANKL/RANK系统,从而参与骨代谢,有望成为骨代谢疾病的治疗靶点。
吕海峰[7]（2021）在《犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用》文中研究说明犬冠状病毒（Canine CoronavirusCCoV）是一种有囊膜的、单链正股RNA病毒。CCoV感染可导致幼犬胃肠炎的典型临床症状,如食欲不振、腹泻和呕吐等,发病率和死亡率较高。CCoV基因组全长约30 kb,3’端编码4种结构蛋白,分别为刺突蛋白（S）,包膜蛋白（E）,膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。M蛋白是一种膜结构糖蛋白,在包膜蛋白中含量最高,是病毒组装和形成的关键成分,含有B细胞识别表位。编码M蛋白的基因高度保守,与其他冠状病毒的M基因同源性较低,因此,M蛋白成为犬冠状病毒检测和诊断的主要靶标之一。犬胃肠炎可由多种病原体引起,包括病毒、细菌或寄生虫。最常见的病毒性肠炎病原体除了冠状病毒（CCoV）,还有犬细小病毒（CPV）,犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）等。因此,快速的病毒学检测对控制犬病毒性肠炎疾病至关重要。为了研制出适用于犬冠状病毒快速诊断的胶体金免疫层析试纸条,本研究制备筛选了 2株犬冠状病毒M蛋白特异单抗杂交瘤细胞,对不同单抗IgG亚类的纯化方法进行了比较,建立了犬冠状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备工艺,该试纸条具有良好的特异性和较高的敏感性。本文内容包括以下三个部分:1、犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定为制备抗犬冠状病毒（CCoV）特异单克隆抗体,用纯化的CCoV为抗原4次免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞用聚乙二醇（PEG1500）进行细胞融合,通过间接免疫荧光试验（IFA）筛选抗体阳性杂交瘤细胞。经三次克隆化,获得2株能稳定分泌抗CCoV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H11、2G3,其抗体效价在体外连续传代40代稳定。单抗Ig亚类鉴定结果表明,2H11单抗为IgG3,2G3单抗为IgG1亚类。IFA和Western blot分析均表明,2H11、2G3单抗特异识别CCoV M蛋白（28-32 kDa）。2H11、2G3杂交瘤培养上清的IFA效价均为1:1000,ELISA效价均≥1:105。单抗特异性试验结果表明,这些单克隆抗体与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPIV）等均无交叉反应。CCoV M蛋白特异单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,为CCoV鉴定和相关诊断方法的建立奠定了坚实的基础。2、小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究为了纯化小鼠腹水中的单抗隆抗体,分三个批次,制备了 2G3、2H11两株杂交瘤的小鼠腹水。分别采用饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、亲和层析、超离透析法对两株单抗进行纯化处理,分析对比蛋白浓度、纯度、效价以及回收率。结果表明不同Ig亚类的单抗,适用的纯化方法不同。2G3单抗（IgG1亚类）最适纯化方法为亲和层析,虽然亲和层析法回收率较低,但纯度高。2H11单抗属于IgG3亚类,辛酸处理导致IgG3破坏,亲和层析时蛋白G亲和柱与IgG3结合不紧密,结果洗脱下来的单抗蛋白浓度和抗体效价低,因此,辛酸-硫酸铵法、亲和层析法不适合2H11单抗的纯化。2H11单抗最适纯化方法选择为超离透析法。3、犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备为了制备胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,选择单抗2G3作为金标抗体标记胶体金,经过优化,金标最佳pH为9.0,最佳蛋白浓度为100 μg/mL。单抗2H11作为检测抗体,以1mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线（T线）,兔抗鼠IgG作为质控抗体,以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线（C线）。特异性试验证明,试纸条与CDV、CAV、CPIV和CPV等无交叉反应;敏感性试验表明,试纸条可以检测到CCoV含量至少达到102.8TCID50/mL。对临床粪便样本的检测,实验室制备的试纸条与进口试纸条的检测符合率为1 00%。本研究成功制备了检测CCoV的胶体金免疫层析试纸条,对早期诊断、预防和控制CCoV具有重要的应用价值。
王洪顺[8]（2021）在《沙利度胺介导鼠C6胶质瘤细胞程序性坏死的机制研究》文中研究说明研究背景:胶质瘤是最为常见的中枢神经系统肿瘤,其中约半数患者为胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）,约占成人恶性肿瘤总数的2%,即使经过手术、放疗、化疗等措施,患者的中位生存时间也仅在12～15个月左右[1.2],并常伴随着如认知障碍、癫痫等症状,极大的降低了患者的生存质量,是最为致命的成人恶性肿瘤之一,因此新的治疗方式及治疗药物的研究仍为当下热点。沙利度胺（Thalidomide THA）因为其严重的致畸作用被长期禁用,在对其致畸机制的研究中发现其对于实体肿瘤的治疗具有明显效果,可通过抑制血管生成[3]、免疫调节[4]、诱导凋亡[5]等机制抑制肿瘤的生长、促进肿瘤的凋亡,在肝[7]、肺[8]、骨[9]等实体肿瘤的治疗实验中取得了明显的效果,在一项胶质瘤临床治疗试验中,沙利度胺联合放化疗不仅改善了患者的生活质量,并且远期效果明显好于对照组[10],在沙利度胺治疗多种胶质瘤细胞株的实验中,均能发现明显的治疗效果[11]。但沙利度胺是否能诱导肿瘤细胞发生程序性坏死并没有阐明。研究目的:本实验从细胞及动物实验两个水平进行研究,验证沙利度胺是否能通过激活程序性坏死通路中受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）/受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）诱发鼠C6胶质瘤细胞的程序性坏死,并对鼠C6胶质瘤细胞产生治疗效果。方法:1.细胞毒性/增殖检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）测定检测细胞增殖情况。计算对照组、Thalidomide（0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L）处理后的细胞增殖抑制率及IC50。确定沙利度胺是否抑制C6的增殖。2.使用细胞凋亡与坏死检测试剂盒（Apoptosis and Necrosis Assay Kit）测定各组不同浓度的Thalidomide（0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L）作用于C6细胞48h后的碘化丙啶（PI）阳性细胞率,计算细胞坏死率。3.实验对照组、Thalidomide（0μmol/L、50μg/m L、100μg/L、200μg/m L）处理C6细胞24 h后,收集肿瘤细胞提取总蛋白,Western blotting检测程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL、Caspase8,及凋亡相关蛋白Caspase3,血管生成主要因子VEGFA的表达情况。4.Nec-1抑制C6胶质瘤细胞RIP1蛋白的表达水平。使用沙利度胺诱导肿瘤细胞死亡,借此来研究程序性坏死关键通路RIP1/RIP3对沙利度胺治疗方案的影响。细胞贴壁后,进行药物处理,将细胞分为对照组、Thalidomide（0μg/m L、200μg/m L）及Thalidomide 200μg/ml+Nec-100μmol/m L组48h后分别测定各组PI+细胞数用来计算细胞坏死率。5、收集C6细胞2×10^6悬浮于100μL的PBS中,小鼠皮下注入后获得实体肿瘤,将建模成功的小鼠随机分成两组,肿瘤细胞接种7天后开始治疗,治疗计划如下:对照组给予吐温20灌胃,治疗组按沙利度按200mg/kg给药,用吐温20将Thalidomide配置成悬浊液灌胃。每天检测肿瘤生长情况,治疗7天后处死,测量肿瘤大小、重量,进行病理分析。结果:1.随着浓度升高,沙利度胺对鼠C6胶质瘤细胞的抑制效果逐渐增强。2.沙利度胺可显着增加鼠C6胶质瘤细胞的死亡,且细胞死亡可被Necrostatin-1下调。3.Western blot发现沙利度胺可使C6胶质瘤细胞程序性坏死PIP1/RIP3/MLKL通路中的RIP3、MLKL的表达明显升高,并抑制Caspase8的表达,同时Thalidomide可以使凋亡相关蛋白Caspase3的表达相对增强,抑制血管生成因子VEGFA的表达。4.抑制程序性坏死关键蛋白RIP1后,由沙利度胺诱导鼠C6胶质瘤细胞的程序性坏死通路的关键蛋白的表达受到明显的抑制。5.沙利度胺可通过激活鼠C6胶质瘤细胞中程序性坏死RIP1/RIP3/MLKL通路诱导细胞的程序性坏死,并同时诱导凋亡、抑制血管生成达到治疗效果。结论:1.Thalidomide具有抗鼠C6胶质瘤细胞作用。2.Thalidomide的抑制作用可能是由于Thalidomide激活了C6胶质瘤细胞中程序性坏死的RIP1/RIP3/MLKL通路,抑制Casepase8的表达,使细胞发生了程序性坏死,同时激活了凋亡通路,提高了细胞中Caspase3表达,多重因素作用下导致C6细胞的死亡。3.Thalidomide可以抑制鼠C6胶质瘤细胞的VEGFA的表达,在实体肿瘤的治疗中同样可能起到抑制肿瘤增殖的作用。4.Necrostatin-1可抑制程序性坏死通路,降低Thalidomide对肿瘤的杀伤作用。
周东蕊[9]（2021）在《血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究》文中进行了进一步梳理研究目的:1.观察血塞通注射液对大鼠大脑中脉闭塞（MCAO）28天神经功能的影响,探究血塞通对损伤皮层LINGO-1,EGFR,PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。2.观察血塞通注射液对体外培养SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的保护作用,验证血塞通注射液对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。研究方法:1.采用改良的Longa法对SD大鼠进行MCAO模型的制备,假手术组大鼠只进行皮肤切开以及钝性分离血管和神经,不插入栓线。大鼠MCAO模型的成功建立评价方法选用TTC染色法。2.根据术后Longa评分将手术组大鼠随机分为模型组,血塞通小剂量组,血塞通大剂量组和尼莫地平组（即阳性药物组）。假手术组和模型组注射同等剂量的生理盐水,其余组别给与相对应的药物治疗。术后1-28天,每日清晨给药前对大鼠进行称重,根据mNSS神经功能评分表进行评分。评价血塞通对大鼠MCAO术后不同时间点（7天,14天和28天）神经功能和体重恢复的疗效。MCAO术后28天,将所有大鼠麻醉后断头取脑,采用HE染色观察大鼠大脑皮层的病理变化,采用Western blot法检测皮层梗死侧的SYN和PSD-95的蛋白表达变化,探索血塞通注射液对皮层梗死区的神经保护作用。采用qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层LINGO-1,EGFR以及PI3K/AKT的mRNA和蛋白表达,探索血塞通的神经保护机制。3.采用qRT-PCR和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达,进一步探索血塞通的神经保护机制。4.体外培养SH-SY5Y细胞,CCK-8法确定最佳缺氧时间,建立OGD/R损伤SH-SY5Y细胞模型,CCK-8法确定血塞通和bpV的最适药物浓度。将SH-SY5Y细胞随机分为正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组等5个组别,按照不同组别给与相对应的药物,正常组给与无血清的EBSS液,模型组给与无糖的Earle’s液。镜下观察血塞通对OGD/R损伤SHSY-5Y细胞生长状态的影响。采用qRT-PCR和Western Blot检测OGD/R损伤SH-SY5Y细胞的PI3K/AKT以及PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达对体内实验进一步验证,观察当使用bpV时,PTEN及其下游的PI3K/AKT通路、GSK-3β mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:1.TTC染色显示:假手术组大鼠右脑为均一的红色,表明脑组织并未损伤;手术组大鼠由于大脑右侧被梗塞而出现广泛的白色,表明MCAO可诱导大鼠右侧脑组织梗死。研究结果证明大鼠MCAO模型成功建立。2.各组大鼠的体重在造模前未见显着的差异（P>0.05）;在MCAO术后第7天和第14天,各组大鼠体重均明显低于假手术组（P<0.05或者P<0.01）;术后第28天,除模型组外,各药物治疗组大鼠的体重与假手术组没有明显差异（P>0.05）。术后第14天的假手术组大鼠的体重高于第7天假手术组的体重,余组别两个时间点比较未见明显差异（P>0.05）;而第28天各组大鼠的体重均显着高于第14天相同组别的大鼠（P<0.01）。手术组各组大鼠苏醒后EZ-Longa评分组间未见明显差异（P>0.05）。在第7天的mNSS评分中,血塞通大剂量组明显低于模型组（P<0.05）。药物治疗后14天,血塞通治疗组（包括小剂量和大剂量）和尼莫地平组大鼠的mNSS评分与模型组相比显着降低（P<0.05）。而药物治疗后28天,血塞通治疗组大鼠的mNSS评分与模型组相比明显降低（P<0.05或P<0.01）;血塞通大剂量组在降低大鼠的mNSS评分方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05）。这说明血塞通治疗可长期缓解MCAO大鼠的神经功能障碍,且具有剂量依赖性。MCAO术后相同组别的mNSS评分在不同时间点的比较显示:第7天和第14天同一组别的mNSS评分无显着差异（P>0.05）;除尼莫地平组外,第28天的mNSS评分显着高于同一组别第14天的mNSS评分（P<0.05）。MCAO术后28天,HE染色结果显示:假手术组大鼠的脑组织形态和细胞结构完整。模型组大鼠脑组织呈大面积损伤,组织着色较浅,神经细胞坏死、核固缩、深染;治疗组大鼠的脑组织也出现一定的损伤,但是和模型组相比,损伤程度较轻,神经细胞的数量也多;与血塞通小剂量组和尼莫地平组相比,血塞通大剂量组的脑组织结构更完整,神经细胞数量亦明显增多。MCAO术后28天,与模型组相比较,各治疗大鼠的PSD-95蛋白表达显着升高（P<0.01）;对各治疗进行比较发现,血塞通大剂量组在提高PSD-95表达方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比,血塞通大剂量组和尼莫地平组可显着提高大鼠大脑皮层SYN蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）;与血塞通小剂量组相比,血塞通大剂量组在提高SYN蛋白表达方面具有显着的优势（P<0.05）。MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:各组LINGO-1,EGFR,PI3K以及AKT mRNA表达无显着变化（P>0.05）。IHC结果显示:LINGO-1的阳性颜色为深棕色,假手术组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达较少;各治疗组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达显着低于模型组的阳性表达（P<0.01）;而对各治疗组之间皮层LINGO-1的阳性表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。各组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的阳性颜色均为深棕色,假手术组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT呈低表达;各治疗组大鼠大脑皮层P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达显着高于模型组（P<0.01）;对各治疗组之间的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:各治疗组大鼠的Lingo-1蛋白的相对表达相较于模型组显着下降（P<0.01）,接近正常水平;而各治疗组之间进行比较,Lingo-1的表达未见明显差异（P>0.05）。各治疗组的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT高于模型组（有趋势,或P<0.05,或P<0.01）;治疗组之间比较无明显差异（P>0.05）。3.MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:除血塞通大剂量组的大鼠脑组织的PTEN mRNA表达明显高于假手术组的mRNA（P<0.05）,其余各组大鼠脑组织的PTEN mRNA表达组间比较未见显着差异（P>0.05）;各组大鼠脑组织的GSK-3β mRNA表达组间亦未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:与模型组相比,各治疗组的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;而各治疗组之间的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白水平无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的最佳缺氧时间为7 h;血塞通和bpV对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的最适药物浓度分别为20μg/ml和1μmol/L。通过镜下观察血塞通,bpV以及血塞通+bpV对OGD 7 h/R 24 h培养的SH-SY5Y细胞生长状态的影响发现,血塞通组、bpV组以及血塞通+bpV组的贴壁细胞数量较模型组多,大部分细胞呈多边形或梭形,部分细胞突触缩短,但大部分细胞突触仍存在,各治疗组之间的细胞形态未见明显的差异。SH-SY5Y细胞OGD 7h/R24 h培养后,qRT-PCR结果显示:正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组细胞的PI3K,AKT,PTEN和GSK-3β mRNA的水平未见显着差异（P>0.05）。Western blotting检测结果显示,与模型组相比,各治疗组大鼠大脑皮层的 P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN 以及 P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平显着升高（P<0.05,或P<0.01）;各治疗组之间的P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN以及P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平比较未见明显差异（P>0.05）。研究结论:1.血塞通可以长期缓解MCAO大鼠的脑组织损伤并促进神经重塑和再生从而增加MCAO术后大鼠的体重,改善MCAO大鼠的神经功能。2.血塞通发挥的神经保护作用机制包括抑制LINGO-1表达,激活EGFR和PI3K/AKT信号通路,抑制PTEN的表达进一步激活PI3K/AKT通路,从而抑制下游GSK-3β的活性,长期促进突触的重塑和再生。3.血塞通可以缓解OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,通过抑制PTEN的活性,激活其下游PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,发挥长期的神经保护作用。
杨永[10]（2021）在《非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA以及阻断ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高传染性动物疾病,主要临床症状为猪的表面皮肤充血、发绀,内脏出血等。ASFV属于ASFV家族,有24种基因型,是一种具有四面体结构的线性双链DNA病毒,总长度为170-190 kb,包括151个阅读框和一个包膜,共编码将近200种蛋白质。P54蛋白作为ASFV的结构蛋白之一,位于病毒颗粒的内侧,分子量约为29 k Da。P54具有很强的保守性,是一种良好的免疫原,可作为ASFV抗体的检测抗原。非洲猪瘟的爆发给中国带来巨大经济损失,此外,在当前无疫苗的情况下,抗体检测阳性即可判定为ASFV感染,因此,本研究致力于ASFV抗体检测技术,选取p54作为检测抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法。由于间接ELISA方法使用的羊抗猪IgG-HRP能广泛针对其他猪病原抗体的检测,极易产生交叉反应或者假阳性的检测结果,继而,本研究利用ASFV p54蛋白制备了抗p54蛋白单抗,建立了阻断ELISA方法,致力于为非洲猪瘟临床检测提供最适的检测方法,同时为诊断和预防非洲猪瘟提供技术支持。主要研究内容如下:1.ASFV p54蛋白的表达及间接ELISA方法的建立将ASFV p54蛋白进行有效预测和截短,并将其与pET32a（+）连接,随后将重组质粒pET32a（+）-p54转化、诱导、超声破碎以及亲和层析纯化,得到ASFV p54-HIS蛋白。再将该蛋白经SDS-PAGE以及western blot验证其纯化效果以及免疫原性后,最后获得建立ELISA方法的包被抗原p54-HIS。为了获得检测准确的间接ELISA方法,本研究将该方法的各系数进行优化,如,p54-HIS的最佳稀释倍数、羊抗猪IgG-HRP的稀释倍数、最佳血清稀释倍数,各步骤的反应时间和温度。最终的结果是:在稀释倍数上:p54-HIS为1:5000（0.3μg/m L）,二抗为1:5000,待检血清为1:40;反应时间和温度分别为30 min和37℃。判定标准为:S/P≥0.25则为ASFV抗体阳性,S/P<0.25则为ASFV抗体阴性。随后,验证了该方法的重复性、特异性、以及符合率等方面的研究。结果显示,本研究建立的方法可重复性高;与商品化试剂盒相比,间接ELISA方法特异性方面与之相当;并且符合率高达100%,具有临床使用价值。2.抗p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立本研究表达的p54-HIS蛋白具有良好的免疫原性,将其免疫BALB/c小鼠,在此过程中同时表达用于筛选阳性克隆的筛选蛋白p54-GST,即将p54基因嵌入至pET42b（+）中,获得带有GST标签的pET42b（+）-p54重组质粒,利用原核表达系统将重组质粒进行表达,继而得到p54-GST蛋白。再经过细胞融合、双标签抗原筛选阳性克隆、三次亚克隆、腹水制备、腹水纯化等程序后,最后获得了3株抗p54蛋白单克隆抗体,随后通过ELISA检测所获得的3株单克隆抗体效价,最终挑选1株效价最高的单抗4-4C,将所获4-4C进行酶标记,获得的4-4C-HRP单抗作为后续研究对象。对4-4C单抗进行一系列特性验证:4-4C的亚类鉴定为IgG和lgκ;其效价为1.6×106;ELISA、western blot、IFA均表明4-4C能特异性识别ASFV。利用p54-HIS蛋白和单抗4-4C-HRP建立了检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。根据传统程序建立方法并进行条件优化,最终得到:p54-HIS的稀释倍数为1:4000（0.38μg/m L）,单抗4-4C的稀释倍数为1:22000（0.15μg/m L）,待检血清的最佳稀释倍数为1:1,血清和抗体的反应时间均为30 min,温度均在37℃。ASFV抗体阳性的判定标准是待检样品的阻断率≥50%,反之则判定为ASFV抗体阴性。随后,将阻断ELISA与西班牙英吉纳试剂盒进行灵敏度、特异性和符合率的平行比较,所得结果为:本研究的阻断ELISA方法灵敏度为1:64,而商品化试剂盒的灵敏度为1:32;在特异性和符合率方面,二者结果相当,为非洲猪瘟的检测提供技术支持。
二、用吐温20改进骨髓细胞染色体制备方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用吐温20改进骨髓细胞染色体制备方法（论文提纲范文）
（1）Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 神经母细胞瘤概述 |
| 1.1.1 神经母细胞瘤的现状 |
| 1.1.2 神经母细胞瘤发病机制 |
| 1.1.3 神经母细胞瘤危险因素 |
| 1.2 DEHP与神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 DEHP概述 |
| 1.2.2 DEHP对神经母细胞瘤的影响 |
| 1.3 Notch信号通路与神经母细胞瘤 |
| 1.4 DEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 第2章 MEHP对 SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SH-SY5Y细胞株的体外培养 |
| 2.2.2 MEHP染毒剂量的确定和实验分组 |
| 2.2.3 SH-SY5Y细胞周期检测 |
| 2.2.4 SH-SY5Y细胞凋亡情况检测 |
| 2.2.5 SH-SY5Y细胞周期和凋亡相关基因m RNA表达水平检测 |
| 2.2.6 SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关基因m RNA表达水平的影响 |
| 2.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.4.2 细胞周期关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.4.3 细胞凋亡关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MEHP对 SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制 |
| 3.1 主要仪器和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞迁移距离测定 |
| 3.2.2 细胞侵袭能力测定 |
| 3.2.3 细胞趋化因子测定 |
| 3.2.4 细胞迁移相关基因m RNA表达水平检测 |
| 3.2.5 细胞迁移相关蛋白表达水平检测 |
| 3.2.6 数据处理与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞趋化因子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.4.2 迁移关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.3 肿瘤微环境关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.4 趋化因子在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响 |
| 4.1 主要仪器和材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达的影响检测 |
| 4.2.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达的影响检测 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.3 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖的关系 |
| 4.3.4 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞迁移的关系 |
| 4.3.5 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞趋化因子的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 MEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 4.4.2 Notch信号通路与细胞增殖的关联性 |
| 4.4.3 Notch信号通路与细胞迁移的关联性 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制 |
| 5.1 主要仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 DAPT对 SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 5.2.2 Notch信号通路抑制效率检测 |
| 5.2.3 实验分组 |
| 5.2.4 指标检测 |
| 5.2.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 DAPT剂量确定 |
| 5.3.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 5.3.3 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 5.3.4 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞趋化因子中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用及机制 |
| 5.4.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用及机制 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 环境内分泌干扰物与儿童神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）儿童急性白血病中PD-1、PD-L1及PD-L2的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 程序性死亡配体-2在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）ACO疾病动物模型的建立及其潜在机制靶点、候选药物的发现研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 ACO研究进展 |
| 1.1 ACO的流行病学 |
| 1.2 病因 |
| 1.3 临床表现 |
| 1.4 发病机制 |
| 1.5 ACO诊断标准 |
| 1.6 治疗 |
| 2 脾酪氨酸激酶SYK与气道炎症 |
| 2.1 Syk的分子结构及及表达 |
| 2.2 Syk的激活 |
| 2.3 Syk抑制剂的研究进展 |
| 2.4 Syk在哮喘和COPD中的作用 |
| 3 本论文的研究思路与内容 |
| 第二章 ACO动物模型的建立 |
| 前言 |
| 第一节 构建ACO小鼠模型的条件摸索 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 不同实验条件诱导的小鼠ACO气道炎症模型 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.3 血球分类计数仪检测小鼠BALF中炎症细胞数量 |
| 2.4 ELISA法检测小鼠BALF中炎症因子水平和血清中抗体水平 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同方案小鼠BALF中白细胞分类计数结果 |
| 3.2 不同方案小鼠BALF中炎症因子与血清中抗体的水平 |
| 4. 小结 |
| 第二节 构建ACO小鼠模型条件的确立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 OVA+LPS+CS诱导的小鼠ACO气道炎症模型 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.3 H&E染色检测小鼠肺组织病理学改变 |
| 2.4 血球分类计数仪检测小鼠BALF中炎症细胞数量 |
| 2.5 ELISA法检测小鼠BALF中炎症因子水平和血清中抗体水平 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ACO小鼠肺组织病理学改变 |
| 3.2 ACO小鼠BALF中白细胞分类计数结果 |
| 3.3 ACO小鼠BALF中炎症因子与血清中抗体的水平 |
| 4. 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 基于RNA-SEQ转录组技术发现ACO小鼠炎症的潜在靶点 |
| 前言 |
| 第一节 基于RNA-Seq转录组技术发现ACO小鼠炎症的潜在靶点 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 组织标本 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 数据库、生物信息学软件信息 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA-seq对转录组测序 |
| 2.2 RNA-seq测序结果及分析 |
| 2.3 差异表达基因的分析 |
| 2.4 qPCR验证差异表达基因 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA质量检测结果 |
| 3.2 转录组测序质量分析 |
| 3.3 差异表达基因分析 |
| 3.4 qRT-PCR验证差异基因表达 |
| 第二节 讨论 |
| 第四章 基于白藜芦醇的呼吸系统疾病分子靶点文献挖掘ACO的潜在候选物的结构特性及其治疗靶点机制 |
| 前言 |
| 第一节 基于白藜芦醇的呼吸系统疾病分子靶点文献挖掘ACO的潜在候选物的结构特性及其治疗靶点机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 数据库和软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 白藜芦醇基本信息 |
| 2.2 白藜芦醇作用靶点预测 |
| 2.3 呼吸系统疾病靶点筛选 |
| 2.4 白藜芦醇-靶点-呼吸系统疾病PPI网络构建与拓扑分析 |
| 2.5 KEGG通路和GO基因富集分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 白藜芦醇与呼吸系统疾病共有靶点 |
| 3.2 白藜芦醇靶点-呼吸系统疾病靶点互作网络 |
| 3.3 核心靶点拓扑关系图 |
| 3.4 PPI网络中核心靶点的关键模块 |
| 3.5 核心靶点KEGG通路和GO功能富集分析 |
| 第二节 讨论 |
| 第五章 EAPP-2抗ACO气道炎症作用及作用机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 EAPP-2抗ACO气道炎症作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞系及培养条件 |
| 1.3 主要药品试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 OVA+LPS+CS诱导的小鼠ACO模型的建立 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.3 H&E染色检测小鼠肺组织病理学改变 |
| 2.4 血球分类计数仪检测小鼠BALF中炎症细胞数量 |
| 2.5 细胞处理 |
| 2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.7 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 EAPP-2对ACO小鼠肺组织病理学改变的影响 |
| 3.2 EAPP-2对ACO小鼠BALF中白细胞分类计数的影响 |
| 3.3 EAPP-2对ACO小鼠血清中总IgE和IgG1生成水平的影响 |
| 3.4 EAPP-2对ACO小鼠BALF中炎症因子生成水平的影响 |
| 3.5 EAPP-2对RAW264.7细胞活力的影响 |
| 3.6 EAPP-2对RAW264.7细胞NO生成水平的影响 |
| 3.7 EAPP-2对RAW264.7细胞炎症因子生成水平的影响 |
| 4 小结 |
| 第二节 EAPP-2抗ACO气道炎症的靶点及作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 组织标本 |
| 1.2 细胞系及培养条件 |
| 1.3 主要药品试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 用于Western blot的RAW264.7细胞处理 |
| 2.2 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 EAPP-2对ACO气道炎症小鼠肺组织Syk表达及其磷酸化的影响 |
| 3.2 EAPP-2对ACO气道炎症小鼠肺组织NF-κB表达及其磷酸化的影响 |
| 3.3 EAPP-2对ACO气道炎症小鼠肺组织NLRP3和iNOS表达的影响 |
| 3.4 EAPP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞Syk表达及其磷酸化的影响 |
| 3.5 EAPP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB表达及其磷酸化的影响 |
| 3.6 EAPP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3和iNOS表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第三节 EAPP-2抗ACO气道炎症的靶点及作用机制验证 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 靶向抑制剂验证EAPP-2抗LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症作用机制 |
| 2.2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 靶点抑制剂验证EAPP-2通过调控Syk通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的生成 |
| 3.2 靶点抑制剂验证EAPP-2以Syk为靶点发挥其抗ACO气道炎症作用 |
| 4 小结 |
| 第四节 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间的主要研究成果 |
| 项目资助情况 |
| 致谢 |
（4）CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 Toll样受体的免疫调控机制及其所介导的肿瘤细胞死亡方式 |
| 2.1 Toll样受体 |
| 2.2 基于TLRs的免疫调节机制 |
| 2.2.1 肿瘤微环境的免疫平衡 |
| 2.2.2 TLRs对抗原提呈细胞的免疫调节机制 |
| 2.2.3 TLRs对巨噬细胞的免疫调节机制 |
| 2.3 TLRs所介导的细胞死亡的作用机制 |
| 2.4 TLRs在肿瘤治疗中的临床试验研究 |
| 2.4.1 TLR2 相关的临床研究 |
| 2.4.2 TLR3 相关的临床研究 |
| 2.4.3 TLR4 相关的临床研究 |
| 2.4.4 TLR5 相关的临床研究 |
| 2.4.5 TLR7/8 相关的临床研究 |
| 2.4.6 TLR9 相关的临床研究 |
| 2.4.7 传统抗肿瘤治疗对TLR通路的影响 |
| 2.5 总结和展望 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 主要仪器设备 |
| 3.2 主要耗材 |
| 3.3 主要抗体列表 |
| 3.3.1 流式抗体列表 |
| 3.3.2 Western Blot抗体列表 |
| 3.4 主要试剂 |
| 3.5 临床样本 |
| 3.5.1 研究对象 |
| 3.5.2 纳入标准 |
| 3.5.3 排除标准 |
| 3.5.4 资料收集及分组 |
| 3.5.5 随访 |
| 3.6 细胞系及培养条件 |
| 3.7 CpG基序的单链脱氧寡核苷酸(CpG ODNs)的制备 |
| 3.8 RNA提取、逆转录条件 |
| 3.9 普通PCR和实时定量PCR |
| 3.10 主要引物序列 |
| 3.11 细胞凋亡测定 |
| 3.12 细胞周期测定 |
| 3.13 细胞表面及细胞胞内蛋白测定 |
| 3.14 蛋白印迹试验 |
| 3.15 蛋白纯化及免疫沉淀 |
| 3.16 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 |
| 3.17 信号通路抑制剂 |
| 3.18 免疫荧光共聚焦显微镜成像 |
| 3.19 急性B淋巴细胞白血病NCG小鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.20 CT26 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.21 小鼠全身免疫微环境的测定 |
| 3.22 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 TLR9在B-ALL患者PBMC中的表达情况 |
| 4.2 TLR9 的表达与B-ALL患者预后的相关性 |
| 4.3 B-ALL细胞系的选择及鉴定 |
| 4.4 TLR9 激动剂——CpG 685对B-ALL细胞系的体外效应 |
| 4.5 CpG 685 对小鼠肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.6 CpG 685 诱导BLIN-1 细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6.1 CpG 685 激活BLIN-1 细胞中的TLR9 下游信号通路 |
| 4.6.2 CpG 685 通过P38 MAPK信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.3 CpG 685 通过JNK/C-MYC信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.4 C-MYC过表达对CpG 685 诱导的BLIN-1 细胞凋亡至关重要 |
| 4.7 不同类型B-ALL对 CpG 685 具有异质性的影响因素 |
| 4.8 Sup-B15 细胞系对CpG 685 耐药的机制 |
| 4.9 联合应用CpG 685 和伊马替尼逆转单药耐药的分子机制 |
| 4.10 联合应用CpG 685 和伊马替尼对Sup-B15 移植瘤小鼠的肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.11 CpG 685 对原代B-ALL细胞的反应性 |
| 4.12 CpG ODN对小鼠机体免疫状态的调控 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（5）二氯喹啉酸和苄嘧磺隆免疫分析方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 除草剂残留危害 |
| 1.2 二氯喹啉酸研究概况 |
| 1.2.1 二氯喹啉酸简介 |
| 1.2.2 二氯喹啉酸残留危害 |
| 1.3 苄嘧磺隆研究概况 |
| 1.3.1 苄嘧磺隆简介 |
| 1.3.2 苄嘧磺隆残留危害 |
| 1.4 除草剂残留检测方法 |
| 1.4.1 气相色谱法(GC) |
| 1.4.2 液相色谱法(LC) |
| 1.4.3 其他检测方法 |
| 1.5 免疫分析方法 |
| 1.5.1 放射免疫分析法(RIA) |
| 1.5.2 酶免疫分析法(EIA) |
| 1.5.3 荧光免疫(FIA) |
| 1.5.4 化学发光免疫(CLIA) |
| 1.6 研究目的及内容 |
| 1.6.1 研究目的及意义 |
| 1.6.2 研究内容及技术路线 |
| 第二章 二氯喹啉酸、苄嘧磺隆人工抗原的制备 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 二氯喹啉酸半抗原的制备 |
| 2.2.2 苄嘧磺隆半抗原的制备 |
| 2.2.3 免疫原的制备 |
| 2.2.4 包被原的制备 |
| 2.2.5 人工抗原的鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 半抗原的鉴定 |
| 2.3.2 人工抗原的鉴定 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 二氯喹啉酸、苄嘧磺隆单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 生物材料及主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠免疫 |
| 3.2.2 小鼠血清效价测定与选择 |
| 3.2.3 骨髓瘤细胞准备 |
| 3.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 3.2.5 细胞融合 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞筛选 |
| 3.2.7 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.8 杂交瘤细胞的冻存 |
| 3.2.9 单克隆抗体的生产 |
| 3.2.10 小鼠腹水纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 脾细胞提供小鼠选择 |
| 3.3.2 抗体纯化 |
| 3.3.3 抗体效价测定 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第四章 二氯喹啉酸酶联免疫分析方法的建立 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要器材 |
| 4.1.3 缓冲溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 间接非竞争ELISA法操作程序 |
| 4.2.2 间接竞争ELISA法操作程序 |
| 4.2.3 免疫条件优化 |
| 4.2.4 标准曲线的建立 |
| 4.2.5 交叉反应率测定 |
| 4.2.6 精密度测定 |
| 4.2.7 添加回收率的测定 |
| 4.2.8 样品基质效应的影响 |
| 4.2.9 实际样品的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫条件优化 |
| 4.3.2 标准曲线的建立 |
| 4.3.3 交叉反应测定 |
| 4.3.4 精密度测定 |
| 4.3.5 样品基质效应影响 |
| 4.3.6 添加回收率测定 |
| 4.3.7 实际样品的检测 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 苄嘧磺隆酶联免疫分析方法的建立 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要器材 |
| 5.1.3 缓冲溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫条件的优化 |
| 5.2.2 标准曲线的建立 |
| 5.2.3 交叉反应率测定 |
| 5.2.4 精密度测定 |
| 5.2.5 添加回收率的测定 |
| 5.2.6 样品基质效应的影响 |
| 5.2.7 实际样品的检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 免疫条件优化 |
| 5.3.2 标准曲线建立 |
| 5.3.3 交叉反应测定 |
| 5.3.4 精密度测定 |
| 5.3.5 样品基质效应影响 |
| 5.3.6 添加回收率测定 |
| 5.3.7 实际样品的检测 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 讨论 |
| 5.4.2 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）绝经后妇女骨量丢失阶段证候分析及绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 绝经后妇女骨量丢失阶段证候分析 |
| 研究对象与方法 |
| 1 研究对象的来源及选择 |
| 1.1 研究对象的来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 问卷调查 |
| 2.2 骨密度检测 |
| 2.3 中医辨证 |
| 3 统计学方法 |
| 4 质量控制 |
| 结果 |
| 1 一般资料比较 |
| 1.1 各阶段一般资料 |
| 1.2 低骨量阶段各年龄段一般资料 |
| 1.3 骨质疏松阶段各年龄段一般资料 |
| 1.4 严重骨质疏松阶段各年龄段一般资料 |
| 2 骨密度比较 |
| 2.1 各阶段骨密度比较 |
| 2.2 低骨量阶段各年龄段骨密度比较 |
| 2.3 骨质疏松阶段各年龄段骨密度比较 |
| 2.4 严重骨质疏松阶段各年龄段骨密度比较 |
| 3 主要症状比较 |
| 3.1 各阶段主要症状比较 |
| 3.2 低骨量阶段各年龄段主要症状比较 |
| 3.3 骨质疏松阶段各年龄段主要症状比较 |
| 3.4 严重骨质疏松阶段各年龄段主要症状比较 |
| 4 虚证比较 |
| 4.1 各阶段虚证比较 |
| 4.2 低骨量阶段各年龄段虚证比较 |
| 4.3 骨质疏松阶段各年龄段虚证比较 |
| 4.4 严重骨质疏松阶段各年龄段虚证比较 |
| 5 肾虚兼证比较 |
| 5.1 各阶段肾虚兼证比较 |
| 5.2 低骨量阶段各年龄段肾虚兼证比较 |
| 5.3 骨质疏松阶段各年龄段肾虚兼证比较 |
| 5.4 严重骨质疏松阶段各年龄段肾虚兼证比较 |
| 6 常见证型比较 |
| 6.1 各阶段常见证型比较 |
| 6.2 低骨量阶段各年龄段常见证型比较 |
| 6.3 骨质疏松阶段各年龄段常见证型比较 |
| 6.4 严重骨质疏松阶段各年龄段常见证型比较 |
| 讨论 |
| 1 一般资料的特征分析 |
| 2 骨密度的特征分析 |
| 3 病证结合模式下,骨量丢失阶段中医证候的特征分析 |
| 4 创新与不足 |
| 4.1 创新 |
| 4.2 不足 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PMOP肾阴虚证与CLCF1 的关联性分析 |
| 实验材料与研究方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验相关溶液配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 研究对象的筛选和资料收集 |
| 2.1 研究对象的来源 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 分组依据及说明 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 问卷调查 |
| 3.2 骨密度检测 |
| 3.3 血样采集 |
| 3.4 实时荧光定量PCR |
| 3.5 蛋白质免疫印迹法 |
| 4 统计学方法 |
| 5 样本量估算 |
| 6 质量控制 |
| 7 伦理审查 |
| 结果 |
| 1 CLCF1与PMOP肾阴虚证的关联性分析 |
| 1.1 基本情况 |
| 1.2 骨密度比较 |
| 1.3 CLCF1表达水平与证型的关联性分析 |
| 2 CLCF1与骨质疏松症的关联性分析 |
| 2.1 基本情况 |
| 2.2 CLCF1与骨量丢失的关联性分析 |
| 2.3 CLCF1与骨密度及骨质疏松症发生的关联性分析 |
| 3 CLCF1与骨折发生的关联性分析 |
| 4 CLCF1与生活习惯、疾病的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 PMOP肾阴虚证与CLCF1的关联性分析 |
| 2 CLCF1与骨密度、骨质疏松症、骨折发生的关联性分析 |
| 3 创新与不足 |
| 3.1 创新 |
| 3.2 不足 |
| 4 小结 |
| 第三部分 CLCF1对OPG/RANKL/RANK系统及细胞生物学行为的影响 |
| 实验材料与研究方法 |
| 1 细胞系来源 |
| 2 主要试剂与材料 |
| 2.1 主要试剂与耗材 |
| 2.2 实验相关溶液配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 细胞培养和细胞传代 |
| 3.2 CLCF1基因的敲除 |
| 3.3 sgRNA活性检测 |
| 3.4 CLCF1基因的过表达 |
| 3.5 实时荧光定量PCR |
| 3.6 蛋白质免疫印迹法 |
| 3.7 酶联免疫吸附测定 |
| 3.8 细胞增殖实验 |
| 3.9 细胞侵袭实验 |
| 3.10 细胞迁移实验 |
| 3.11 细胞凋亡实验 |
| 4 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 CLCF1的过表达、敲除结果 |
| 1.1 过表达慢病毒转染效率的检测 |
| 1.2 CAS9 sgRNA活性检测结果 |
| 1.3 CLCF1调控后的mRNA表达变化 |
| 1.4 CLCF1调控后蛋白表达变化 |
| 1.5 CLCF1调控后蛋白含量变化 |
| 2 CLCF1对OPG、RANKL及干扰素 α、干扰素 γ的影响 |
| 2.1 CLCF1对OPG、RANKL及干扰素 α、干扰素 γmRNA表达的影响 |
| 2.2 CLCF1对OPG、RANKL及干扰素 α、干扰素 γ蛋白表达的影响 |
| 2.3 CLCF1对OPG、RANKL蛋白含量的影响 |
| 3 CLCF1对细胞生物学行为的影响 |
| 3.1 CLCF1对细胞增殖的影响 |
| 3.2 CLCF1对细胞迁移、侵袭的影响 |
| 3.3 CLCF1对细胞凋亡的影响 |
| 讨论 |
| 1 CLCF1对OPG/RANKL/RANK系统的影响 |
| 2 CLCF1对IFNα、IFNγ的影响 |
| 3 慢病毒载体、Crispr/Cas9 基因编辑技术及THP-1 细胞系的选择 |
| 4 CLCF1对细胞生物行为学的影响 |
| 5 创新与不足 |
| 5.1 创新 |
| 5.2 不足 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 骨质疏松症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 犬冠状病毒研究进展 |
| 前言 |
| 1.1 犬冠状病毒分类地位 |
| 1.2 病毒形态与结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 病毒感染的临床表现及病理变化 |
| 1.5 治疗与预防 |
| 1.6 犬冠状病毒诊断技术 |
| 1.7 免疫胶体金检测技术及其在兽医领域的应用 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第2章 犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）沙利度胺介导鼠C6胶质瘤细胞程序性坏死的机制研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 沙利度胺诱导C6胶质瘤细胞程序性坏死的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 1.主要实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验器械和仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CCK-8测定Thalidomide对鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用 |
| 2.2 Hoechst/PI双染法测定Thalidomide对C6胶质瘤细胞的抑制率 |
| 2.3 Nec-1抑制RIP1后CCK-8测定THA对鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用 |
| 2.4 细胞总蛋白提取 |
| 2.5 BCA检测蛋白浓度 |
| 2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.7 电转膜 |
| 2.8 免疫反应 |
| 3.数据处理 |
| 实验结果 |
| 1.CCK-8测Thalidomide治疗鼠C6细胞的增殖抑制率 |
| 2.Hoechst33342和碘化丙啶(PI)染色结果 |
| 3.Western blot比较各组药物干预48h后RIP1/RIP3通路相关蛋白表达的变化 |
| 小结 |
| 第二部分 沙利度胺对鼠C6胶质瘤细胞瘤动物模型的治疗研究 |
| 材料和方法 |
| 1.主要实验材料 |
| 1.1 实验细胞及动物 |
| 1.2 实验器械和仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配置 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 小鼠鼠C6胶质瘤模型建立 |
| 2.2 肿瘤组总蛋白提取及蛋白浓度测定 |
| 2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.4 电转膜 |
| 2.5 免疫反应 |
| 2.6 HE染色 |
| 实验结果 |
| 1.沙利度胺对小鼠C6胶质瘤模型的治疗效果 |
| 1.1 胶质瘤模型的建立 |
| 1.2 沙利度胺治疗C6胶质瘤动物模型 |
| 1.3 Western blot检测蛋白表达 |
| 1.4 HE染色结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:沙利度胺治疗胶质瘤机制研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 三七、三七总皂苷各成分对脑卒中的研究进展 |
| 1 中药三七和其成分的研究 |
| 2 三七总皂苷及其各成分对脑卒中的研究进展 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 LINGO-1及其下游信号通路在缺血性脑卒中后神经再生的机制研究 |
| 1 LINGO-1 |
| 2 EGFR |
| 3 PI3K//AKT |
| 4 PTEN |
| 5 GSK-3β |
| 6 PTE、AKT以及GSK-3β的关系 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 大鼠MCAO模型的建立和评价 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后28天LINGO-1,EGFR以及下游PI3K/AKT通路的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠术后28天PTEN和GSK-3β的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 mNSS神经功能评分表 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（10）非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA以及阻断ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 非洲猪瘟的出现 |
| 1.2 非洲猪瘟的流行病学 |
| 1.3 ASFV介绍 |
| 1.3.1 ASFV基因组 |
| 1.3.2 ASFV的表达与复制 |
| 1.4 ASFV p54 蛋白 |
| 1.5 单克隆抗体的介绍 |
| 1.6 ASFV的血清学检测 |
| 1.7 间接ELISA |
| 1.8 阻断ELISA |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 第2章 非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌种、血清 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基以及缓冲液的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原p54 蛋白的优化 |
| 2.2.2 重组质粒p ET32a(+)-p54 的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒p ET32a(+)-p54 的转化 |
| 2.2.4 重组蛋白p54 的提取 |
| 2.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.2.6 Western blot检测 |
| 2.3 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3.1 抗原和酶标抗体最佳稀释倍数的确定 |
| 2.3.2 待检血清最佳稀释倍数的确定 |
| 2.3.3 样品最佳反应时间的确定 |
| 2.3.4 酶标记物反应时间的确定 |
| 2.3.5 底物显色液最佳反应时间的确定 |
| 2.3.6 临界值的确定 |
| 2.4 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 2.5 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 2.6 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 2.7 间接ELISA方法的符合率 |
| 2.8 结果与分析 |
| 2.8.1 p54 蛋白预测结果 |
| 2.8.2 PCR结果 |
| 2.8.3 SDS-PAGE结果 |
| 2.8.4 Western blot结果 |
| 2.9 间接ELISA方法最佳条件的确定 |
| 2.9.1 确定抗原和酶标二抗的最佳稀释倍数 |
| 2.9.2 确定待检样本的最佳稀释倍数 |
| 2.9.3 样品最佳反应时间的确定 |
| 2.9.4 确定酶标二抗的最佳反应时间 |
| 2.9.5 确定显色液最佳反应时间 |
| 2.9.6 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 2.10 敏感性试验结果 |
| 2.11 特异性试验结果 |
| 2.12 重复性试验结果 |
| 2.13 符合率试验结果 |
| 第3章 非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测方法的建立 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、细胞以及小鼠 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 培养基及其配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组抗原p54-GST蛋白的表达 |
| 3.2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 ASFV p54 单克隆抗体的制备 |
| 3.3.1 动物免疫 |
| 3.3.2 细胞融合 |
| 3.3.3 阳性克隆筛选 |
| 3.3.4 有限稀释法获得单一阳性孔 |
| 3.3.5 杂交瘤细胞染色体技术 |
| 3.3.6 腹水制备 |
| 3.3.7 效价测定 |
| 3.3.8 单克隆抗体的纯化 |
| 3.3.9 单抗浓度的测定 |
| 3.3.10 单抗特性鉴定 |
| 3.3.11 单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记 |
| 3.4 阻断ELISA方法的条件摸索 |
| 3.4.1 抗原与酶标单克隆抗体最佳稀释度确定 |
| 3.4.2 血清最佳稀释度的确定 |
| 3.4.3 临界值的确定 |
| 3.5 敏感性试验 |
| 3.6 特异性试验 |
| 3.7 符合率试验 |
| 3.8 结果与分析 |
| 3.8.1 重组蛋白p54-GST的表达 |
| 3.8.2 基于p54-GST建立的筛选方法 |
| 3.8.3 融合细胞株状态 |
| 3.8.4 阳性克隆筛选 |
| 3.8.5 杂交瘤细胞染色体计数 |
| 3.8.6 腹水效价测定 |
| 3.8.7 单克隆抗体纯化结果 |
| 3.8.8 单克隆抗体浓度测定 |
| 3.8.9 单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.8.9.1 亚类结果 |
| 3.8.9.2 单克隆抗体与ASFV的反应原性 |
| 3.9 阻断ELISA检测方法的建立 |
| 3.9.1 阻断ELISA检测方法最佳条件 |
| 3.9.2 临界值的确定 |
| 3.10 敏感性试验结果 |
| 3.11 特异性试验结果 |
| 3.12 符合率试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 原核表达重组蛋白p54 |
| 4.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.3 ASFV p54 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.4 阻断ELISA方法的建立 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、用吐温20改进骨髓细胞染色体制备方法（论文参考文献）
- [1]Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制[D]. 张波. 吉林大学, 2021(01)
- [2]儿童急性白血病中PD-1、PD-L1及PD-L2的表达及临床意义[D]. 沙梦琪. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]ACO疾病动物模型的建立及其潜在机制靶点、候选药物的发现研究[D]. 李姝仪. 北京协和医学院, 2021
- [4]CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究[D]. 白玲. 吉林大学, 2021(01)
- [5]二氯喹啉酸和苄嘧磺隆免疫分析方法研究[D]. 李亚琪. 中国农业科学院, 2021
- [6]绝经后妇女骨量丢失阶段证候分析及绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的机制研究[D]. 李健阳. 福建中医药大学, 2021(01)
- [7]犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用[D]. 吕海峰. 扬州大学, 2021
- [8]沙利度胺介导鼠C6胶质瘤细胞程序性坏死的机制研究[D]. 王洪顺. 福建医科大学, 2021
- [9]血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究[D]. 周东蕊. 北京中医药大学, 2021(01)
- [10]非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA以及阻断ELISA检测方法的建立[D]. 杨永. 华中农业大学, 2021