一、大鼠骨髓细胞诱导分化神经细胞的形态学观察（论文文献综述）
李芳[1]（2021）在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs）移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2（procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2）表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备（mechanical injury,MI）150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔（0.25mM,0.5mM,1.0mM）作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1（浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL）作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1（0.31-2.5 ng/mL）促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子（MAP2、NSE、GAP43和 GFAP）和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子（MAP2、NSE、GAP43）表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
白广超,张文,高磊,李宽新[2]（2020）在《骨形态发生蛋白7体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元分化的研究》文中研究说明目的探索骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元的作用。方法 SPF级SD大鼠10只,雄性,4周龄,体重约110 g,以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）;成脂诱导、成骨分化检测BMSCs多向分化能力。将BMSCs随机分为对照组、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml及100 ng/ml BMP7组,MTT法检测BMP7对大鼠BMSCs增殖的影响;倒置相差显微镜下观察大鼠BMSCs诱导后形态学变化;qRT-PCR检测诱导得到的细胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP mRNA相对表达量;免疫荧光检测NSE蛋白表达情况。结果体外培养的第3代大鼠BMSCs呈长梭形,细胞聚集生长呈漩涡状。大鼠BMSCs成脂诱导后胞浆内出现脂滴,油红"O"染色呈阳性;大鼠BMSCs经成骨诱导后出现不透光团状矿物质结节,茜素红染色呈阳性。诱导1后第1天,各组细胞吸光度值比较差异无统计学意义;诱导后2～6 d,各组细胞吸光度值比较差异有统计学意义（均P< 0.05）,诱导后第6天时,对照组、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/ml BMP7组吸光度值分别为0.370±0.003、0.399±0.003、0.404±0.003、0.410±0.003、0.397±0.001,其中75 ng/ml BMP7组细胞吸光度值明显高于其余各组（均P< 0.05）。75 ng/ml BMP7组细胞形态学变化最为显着,细胞形态上类似神经元。75 ng/ml BMP7组NF200、SYN1、MAP2、GFAP mRNA相对表达量分别为5.47±0.59、1.48±0.38、2.86±1.65、4.41±0.13,均显着高于对照组（均P< 0.05）。75 ng/ml BMP7组NSE免疫荧光染色阳性率高于对照组（32.94%±1.62%比0）。结论 BMP7具有体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元的能力。
张晔[3]（2020）在《白藜芦醇对去卵巢大鼠骨质疏松及抑郁样行为的干预作用及机制研究》文中研究指明目的:去除大鼠双侧卵巢造成雌激素减退以建立大鼠骨质疏松及抑郁样行为模型;以不同剂量的白藜芦醇灌胃,观察其对于去卵巢后造成的大鼠骨质疏松以及抑郁样行为的改善作用,并对其产生改善绝经后骨质疏松及抑郁样行为的可能机制进行探讨。方法:体内实验:1.SPF级健康6月龄SD雌性大鼠60只,随机分为6组,每组10只,去除大鼠双侧卵巢建立模型:（1）假手术组;（2）模型组;（3）白藜芦醇低剂量组:白藜芦醇50mg/kg每天灌胃;（4）白藜芦醇中剂量组:白藜芦醇100 mg/kg每天灌胃;（5）白黎芦醇高剂量组:白藜芦醇200 mg/kg每天灌胃;（6）雌激素组:17β-雌二醇0.8mg/kg每天灌胃。药物干预12周后进行标本取材:比较体重及子宫重量;取长骨行显微CT、HE染色进行形态学比较;取大鼠血清,ELISA检测骨转化指标物;2.在药物干预前及干预结束后均进行动物行为学的检测;在药物干预结束后取血清、大脑各脑区行ELISA检测相关神经递质;体外实验:1.培养成骨前体细胞MC3T3-E1细胞,加入成骨诱导液进行诱导分化,以不同浓度的白藜芦醇进行干预,诱导分化培养21天,以茜素红染色比较钙结节数目;免疫印迹法检测细胞总蛋白中ERK/Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达;2.培养神经元样细胞PC12细胞,以皮质酮干预模拟抑郁细胞模型,以白藜芦醇不同浓度干预,流式凋亡试剂盒检测PC12细胞凋亡,免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达。结果:1.去除双侧卵巢12周后,去卵巢大鼠出现骨质疏松,白藜芦醇干预可减少去卵巢大鼠骨丢失,以低、中剂量组为明显。体外实验中,白藜芦醇可以增加MC3T3-E1细胞活性,可以促进其成骨分化;不同浓度白藜芦醇干预后,ERK1/2、β-catenin、BMP-2、p-ERK1/2 蛋白表达增加,其中以白藜芦醇 10μmol/L、20μmol/L组明显;同时白藜芦醇10μmol/L、20μmol/L组干预后LPL、GSK-3β和PPAR-γ蛋白表达下调。表明白藜芦醇改善骨质疏松的作用机制可能与白藜芦醇调控ERK/Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白以促进成骨细胞分化有关。2.去除双侧卵巢12周后大鼠表现出抑郁样行为,白藜芦醇干预对大鼠的抑郁样行为表现出改善作用;与模型组相比较,白藜芦醇干预后大鼠血清、海马脑区、前额叶脑区5-HT含量升高,海马、前额叶脑区GABA含量升高,Glu含量降低;细胞实验显示:白藜芦醇可提高皮质醇干预的神经元样细胞PC12抑郁细胞模型的细胞活性,减轻皮质醇造成的细胞凋亡;其作用机制可能与白藜芦醇调控凋亡相关蛋白减轻皮质醇造成的细胞损伤有关。结论:单纯的雌激素减退可以造成大鼠骨质疏松及抑郁样行为同时发生,而白藜芦醇的干预,可同时起到骨保护及抗抑郁作用,抗骨质疏松作用机制与其调控ERK/Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞生成有关:其抗抑郁作用与其提高脑内单胺类神经递质水平以及减轻高皮质醇水平造成的细胞凋亡损伤有关。
张文[4]（2020）在《BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究》文中提出研究目的:脊髓损伤目前尚无有效治疗方式,本研究以慢病毒载BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞,诱导其向神经元分化;并将慢病毒载BMP-7基因转染的BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤,探究对大鼠脊髓损伤神经元修复的影响,为促进脊髓功能修复提供新的靶点和策略。方法:体外培养大鼠BMSCs,随机分为空白对照组（常规培养）、LV-GFP组（转染LV-GFP）、LV-BMP7-GFP组（转染LV-BMP7-GFP）,采用倒置显微镜观察细胞形态,成脂诱导分化、成骨诱导分化检测细胞分化能力,MTT法检测细胞存活率,免疫细胞化学实验检测神经元标记物NF-200、SYN1表达情况,qRT-PCR检测NF-200、SYN1mRNA表达情况。采用Allen’s打击装置制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为假手术组（常规饲养）、模型组（脊髓蛛网膜腔内注射生理盐水）、BDNF组（脊髓蛛网膜腔内注射BDNF）、BMSCs组（脊髓蛛网膜腔内注射BMSCs）、LV-BMP7-BMSCs组（脊髓蛛网膜腔内注射LV-BMP7-BMSCs）;治疗后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d采用BBB评分评估大鼠后肢功能,采用免疫组织化学实验、qRT-PCR、WesternBlot检测神经元修复指标NF-200、GFAP表达情况。结果:1、慢病毒载BMP-7基因转染后,LV-GFP组和LV-BMP7-GFP组BMSCs存活率与转染前相比,无显着性差异（P>0.05）;LV-GFP转染后3 d,MOI=10组平均荧光强度最高（P<0.05）。2、细胞免疫组化结果显示:空白对照组和LV-GFP组NF-200、SYN1表达呈阴性;LV-BMP7-GFP组NF-200、SYN1表达呈阳性,胞体和轴突被染成亮棕黄色。3、细胞qRT-PCR结果显示:LV-BMP7-GFP组NF-200、SYN1 mRNA相对表达量高于对照组和LV-GFP组（P<0.05）。4、脊髓损伤治疗后14 d,BDNF组、LV-BMP7-BMSCs组大鼠BBB评分高于模型组和BMSCs组（P<0.05）;治疗21 d、28 d后,LV-BMP7-BMSCs组大鼠BBB评分高于模型组、BDNF组和BMSCs组（P<0.05）。5、与假手术组相比,BDNF组、BMSCs组和LV-BMP7-BMSCs组大鼠脊髓组织中NF-200表达水平升高（P<0.05）;BDNF组和LV-BMP7-BMSCs组NF-200表达水平高于模型组、BMSCs组（P<0.05）。6、与假手术组相比,其他各组大鼠脊髓损伤后GFAP表达水平升高（P<0.05）;模型组、BDNF组、BMSCs组和LV-BMP7-BMSCs组之间GFAP表达水平无统计学差异（P>0.05）。结论:1、慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs后得到的细胞形态与神经元样细胞相似,神经元标记物阳性表达,证明慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs,促进其向神经元分化。2、慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs移植治疗脊髓损伤,可促进脊髓损伤神经元修复,一定程度恢复神经功能,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。
詹吉恒[5]（2020）在《虎杖苷上调Nrf2/ARE促进神经分化在骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤中的应用》文中研究表明目的:1.分离、培养小鼠BMSCs,探讨虎杖苷对BMSCs向神经元样细胞定向分化潜能的影响,并筛选虎杖苷在体外实验的工作浓度,为进一步实验奠定基础。2.建立小鼠脊髓损伤动物模型,通过分组干预,探讨虎杖苷对移植BMSCs在体内脊髓伤区中向神经分化的作用。3.应用小鼠BMSCs神经诱导分化体系和脊髓损伤动物模型,探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制。4.对比虎杖苷灌胃、BMSCs定点移植、虎杖苷灌胃联合BMSCs移植在小鼠脊髓损伤模型中的治疗效果,通过行为学评价、神经功能检查、组织病理学检测等加以明确。方法:1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响（1）BMSCs的分离、培养、传代及鉴定从C57BL/6小鼠肱骨、股骨、胫骨中提取原代BMSCs,并进行培养、传代。通过成骨诱导、成软骨诱导及相关特异性染色检测细胞的多向分化潜能;流式细胞术检测小鼠BMSCs表面标记物。（2）虎杖苷对BMSCs活性及向神经分化潜能的影响CCK-8检测不同浓度虎杖苷对BMSCs活性的影响,筛选虎杖苷工作浓度用于神经诱导分化实验,并在镜下动态观察各组细胞形态变化。（3）虎杖苷对神经诱导分化BMSCs中神经标志物表达的影响①WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测对照组、标准诱导组和各虎杖苷组（3、10、30μmol/1）中 MAP-2、NeuN、NF-M 和 NSE 的蛋白、mRNA 及荧光表达;②WB检测对照组和30μmol/1虎杖苷组中DBH、ChAT、GAD65和TH的蛋白表达。2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响（1）BMSCs的标记复苏冻存的BMSCs,待细胞汇合度达70%时,加入BrdU标记48h,免疫荧光染色检测细胞标记率。（2）动物分组、造模、干预及取材①125只8周龄C57BL/6小鼠随机分为5组（每组25只）:假手术组（Sham组）、模型组（SCI组）、虎杖苷组（PD组）、干细胞移植组（BMSCs组）、虎杖苷联合干细胞移植组（PD+BMSCs组）;②建立T10节段脊髓损伤动物模型,根据分组情况进行干预:③分别在造模后第7、10及28天取下含损伤节段的新鲜脊髓组织,保存于-80℃备用;造模后第28天取脊髓组织,固定24h,梯度脱水后行冰冻切片。（3）脊髓组织样品检测①免疫荧光染色检测脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况,WB检测造模28天后脊髓伤区中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达;②WB检测造模7天后脊髓组织iNOS、NF-κB蛋白表达,采用ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达;③分别检测造模7、10天后脊髓组织中SOD、MDA含量。3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制（1）细胞实验①细胞分组干预;第一部分实验,分为5组:对照组、标准诱导组、虎杖苷组（3、10、30μmol/1）;第二部分实验,分为5组:对照组、标准诱导组、抑制剂组（100nmol/1鸦胆子苦醇）、虎杖苷组（30μmol/1）、虎杖苷+抑制剂组。②探讨虎杖苷促进BMSCs在体外向神经元样细胞分化的潜在调控通路;WB检测第一部分实验各组细胞PI3K-AKT、MAPK及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达,RT-qPCR检测Notch、Wnt、BMP/Smad及Nrf2/ARE信号通路相关基因的mRNA表达。③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体外向神经分化的影响。WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测中第二部分实验各组细胞MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白、mRNA及荧光表达。（2）动物实验①动物分组及干预;第一部分实验,共5组（每组7只）,分组情况同上述2.;第二部分实验,共4组（每组7只）:假手术组（Sham组）、模型组（SCI组）、虎杖苷联合干细胞移植组（PD+BMSCs组）、联合治疗+抑制剂组（PD+BMSCs+Bru组）。造模后根据分组情况进行干预,在造模28天后取材。②探讨不同干预方式对体内Nrf2/ARE通路表达的影响;免疫荧光染色检测第一部分实验各组脊髓组织中Nrf2的荧光表达,WB检测Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达。③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体内向神经分化的影响。免疫荧光染色检测PD+BMSCs组和PD+BMSCs+Bru组脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况,WB检测第二部分实验各组脊髓中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达。4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨（1）动物分组、造模、干预及取材参照上述2.进行动物分组、造模及干预,在造模28天后取材。（2）行为学评价通过BBB评分标准和斜板实验对各组小鼠后肢运动功能恢复情况进行评估。（3）神经电生理检查造模28天后,进行脊髓诱发电位检测,测量SCEP的波幅和潜伏期。（4）组织学评价①计算脊髓组织损伤表面积,通过HE染色和Nissl染色观察脊髓组织损伤程度;②免疫荧光染色、WB和RT-qPCR分别检测各组脊髓组织MAP-2的荧光、蛋白及mRNA表达,通过透射电镜观察脊髓轴突和髓鞘的超微结构;③GAP43/Tuj1免疫荧光双标记染色观察脊髓组织中轴突新生情况;④免疫荧光染色观察各组脊髓中胶质瘢痕形成情况,WB检测GFAP蛋白表达,GFAP/NF-200免疫荧光双标记染色观察胶质瘢痕和神经丝生长的关系。结果:1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响提取的BMSCs具有多向分化潜能,且纯度较高。根据CCK-8结果,虎杖苷在3、10、30μmol/1浓度时对细胞活性较好,故选取该浓度范围用于神经诱导分化实验。显微镜下观察发现,虎杖苷组细胞在诱导中后期的神经样细胞数目明显多于标准诱导组。WB和PCR结果显示,与标准诱导组相比,虎杖苷在体外呈浓度依赖性上调细胞中神经标志物MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白和mRNA表达（P<0.05）。且虎杖苷对NF-M和ChAT的荧光表达强度、MAP-2和NeuN的荧光阳性表达率也有促进作用（P<0.05）,在30μmol/1浓度时效果最为显着（P<0.05）。2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响本研究建立的脊髓损伤小鼠模型具有较高的稳定性和可复制性。免疫荧光染色结果显示,造模4周后可在体内检测到BrdU标记的外源性BMSCs,部分细胞同时共表达Nestin、NeuN或NSE。与BMSCs组相比,PD+BMSCs组小鼠脊髓中能检测到更多BrdU/神经标志物双阳性的移植细胞（P<0.05）。WB结果表明各种治疗方式均能上调脊髓中Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达,但PD+BMSCs组表达更高（P<0.05）,接近于Sham组水平。各治疗组小鼠脊髓中炎症相关因子表达量、氧化应激相关指标含量比较均无统计学差异（P>0.05）。3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制（1）细胞实验中,与标准诱导组相比,虎杖苷组细胞中PI3K-AKT和MAPK信号通路相关蛋白的表达及Notch、Wnt和BMP/Smad信号通路相关基因的mRNA表达差异均无统计学意义（P>0.05）。但虎杖苷组中Nrf2、NQO-1和HO-1的蛋白和mRNA表达较标准诱导组显着上调（P<0.05）。在阻断Nrf2/ARE信号通路后,虎杖苷上调细胞中神经标志物蛋白及mRNA表达的作用被抑制,表达水平明显低于虎杖苷组（P<0.05）,免疫荧光实验结果的趋势与之相类似。（2）动物实验中,与SCI组相比,各治疗组中Nrf2的荧光表达强度及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达均显着提高（P<0.05）,PD+BMSCs组水平高于其余治疗组（P<0.05）。与 PD+BMSCs 组相比,在阻断 Nrf2/ARE 信号通路后,PD+BMSCs+Bru 组小鼠体内移植BMSCs向神经分化的效率显着降低（P<0.05）,且Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达亦明显下调（P<0.05）。4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨在造模后14～28天期间,与其余治疗组相比,PD+BMSCs组小鼠BBB评分及斜板实验临界角度更高（P<0.05）。神经电生理检查表明,治疗后小鼠的SCEP较SCI组有明显恢复（P<0.05）,而PD+BMSCs组波幅更大、潜伏期更短（P<0.05）。组织病理学实验中,PD+BMSCs组小鼠脊髓组织损伤表面积明显小于其余治疗组和SCI组（P<0.05）,HE染色和Niss1染色也表明该组脊髓损伤程度更轻（P<0.05）。与其余脊髓损伤小鼠相比,PD+BMSCs组轴突髓鞘修复及轴突新生相关的指标表达增高（P<0.05）,而胶质瘢痕形成相关的指标则表达降低（P<0.05）。结论:1.在神经诱导分化培养液基础上,虎杖苷呈浓度依赖性地促进BMSCs在体外分化为（胆碱能）神经元样细胞,其中30μmol/1浓度时效果最显着,并且虎杖苷还能促进移植BMSCs在体内向神经元样细胞分化。而上述效应可能是通过Nrf2/ARE通路的激活而实现的。2.虎杖苷灌胃联合BMSCs移植能有效改善脊髓损伤小鼠后肢运动功能障碍,并促进脊髓神经功能恢复,这可能是基于其促进脊髓伤区轴突髓鞘修复,加速轴突新生,并减缓胶质瘢痕对神经纤维生长的遮挡效应而发挥作用的。
刘湘琳[6]（2020）在《壮骨止痛胶囊调控Notch通路对去卵巢大鼠Notch1、Jagged1、HES蛋白的影响》文中研究表明目的:通过观察壮骨止痛胶囊对去卵巢大鼠Notch通路上Notch1、Jagged1、HES蛋白的表达差异,探讨壮骨止痛胶囊调控Notch通路干预绝经后骨质疏松症的机制研究。方法:SD雌性大鼠36只,随机选取6只摘除卵巢同等质量脂肪作为假手术组,6只不作任何处理为空白组,其余24只大鼠采用双侧去卵巢法制备骨质疏松模型,随机分为模型组、RAPA组、3-MA组和壮骨止痛胶囊组共4组,每组6只。术后6天开始给药,连续1个月。末次给药后第二天开始取材,经腹主动脉采血,制备相应组别血清。ELISA测定血清中Ⅰ型胶原氨基端延长肽（P1NP）含量;分离大鼠双侧股骨的骨髓间充质干细胞传至2代;HE染色观察、免疫组化测定骨组织和肾组织中Notch1、Jagged1、HES的表达水平。结果:（1）HE染色发现模型组大鼠骨髓腔扩大,骨小梁较稀疏,梁髓比下降,提示造模成功。（2）ELISA:与空白组比较,假手术组血清P1NP值表达无显着差异（P>0.05）。与假手术组相比,模型组血清P1NP值降低,且有显着差异（P<0.01）。与模型组相比,壮骨止痛胶囊组、RAPA组和3-MA组血清P1NP值表达升高,有显着差异（P<0.01）。（3）骨组织免疫组化:假手术组和空白组的HES、Jagged1、Notch1表达无明显差异（P>0.05）;与模型组比,壮骨止痛胶囊组和RAPA组HES、Jagged1、Notch1表达显着升高（P<0.01）,3-MA组Jagged1、Notch1表达显着升高（P<0.01）,HES表达显着降低（P<0.01）;与RAPA组相比,3-MA组HES、Notch1、Jagged1表达显着降低（P<0.01）。（4）肾组织免疫组化:假手术组和空白组的Notch1表达无明显差异（P>0.05）;与假手术比,空白组HES表达显着升高（P<0.01）,Jagged1表达显着降低（P<0.01）;与模型组相比,壮骨止痛胶囊组和RAPA组HES、Jagged1、Notch1表达显着升高（P<0.01）,3-MA组Jagged1、Notch1表达显着降低（P<0.01）,HES表达无显着差异（P>0.05）;与RAPA组相比,3-MA组HES、Notch1、Jagged1表达显着降低（P<0.01）。结论:1.壮骨止痛胶囊能调控去卵巢大鼠的Notch通路对Notch1、Jagged1、HES蛋白表达起正向调节作用并干预绝经后骨质疏松症;2.壮骨止痛胶囊和RAPA可以促进骨形成过程;3.壮骨止痛胶囊可以有效的改善PMOP的骨微结构。
吕颖[7]（2020）在《LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究》文中提出目的（1）建立hiPSCs向多巴胺（dopamine,DA）能神经元的诱导分化体系,系统分析诱导分化过程中lncRNAs的表达和功能变化,进一步筛选并探究关键lncRNA MIAT在hiPSCs及诱导分化中的作用。（2）探讨6-OHDA大鼠帕金森（Parkinson’s disease,PD）模型不同脑区基因表达的改变并筛选PD关键基因与通路,为研究PD的分子机制和防治提供新思路。（3）系统比较并评价神经干细胞、间充质干细胞及其诱导细胞、hiPSCs诱导分化细胞移植治疗PD的效果,为移植细胞的选择和时间点的确定提供实验基础。方法（1）单层贴壁培养法建立hiPSCs向DA能神经元的诱导分化体系,RT-qPCR和免疫荧光染色检测神经相关标记物划分细胞所处阶段。将诱导分化中不同阶段细胞进行lncRNAs转录组测序和生物信息学分析,包括基因表达分析、差异基因分析、lncRNAs靶基因预测和功能富集分析。筛选关键lncRNA MIAT进行RT-qPCR表达验证,Cas9转录激活慢病毒构建MIAT过表达稳转细胞系,RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色检测MIAT在hiPSCs及其向DA能神经元诱导分化中相关标记物的表达。（2）脑立体定位手术构建6-OHDA大鼠PD模型,阿扑吗啡诱导旋转测试筛选成功PD模型,免疫组化检测黑质DA能神经元的含量,高效液相色谱检测纹状体 DA、二羟苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量。分离5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）进行转录组测序、生物信息学分析和RT-qPCR验证。透射电镜观察超微结构改变。（3）移植细胞分组包括:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）、绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpcMSCs）、脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell,CB-MNC）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其诱导6天、12天、24天的细胞、hiPSCs诱导分化11天、18天和25天的细胞。新型氧化铁纳米颗粒（molday ion rhodamine B,MIRB）标记干细胞并通过脑立体定位手术进行细胞移植。阿扑吗啡诱导旋转测试、旷场试验和抓力测试对动物进行行为学评价。核磁观察细胞在活体脑内的情况,免疫荧光染色观察移植细胞的迁移、增殖、分化以及星形胶质细胞的改变。透射电镜观察脑组织超微结构变化。结果（1）建立了 hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系。细胞诱导分化至5-7天处于NSCs阶段,至第1 1天开始进入DA能神经元前体细胞阶段,至第25天TH+神经元的比例约为40%左右。诱导分化体系中存在普遍的lncRNAs差异表达和功能调控。在转录本水平和基因水平存在大量的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。差异lncRNAs靶基因和差异mRNAs功能富集结果总体相一致,主要参与轴突导向、（Wnt/TGF-β/Hedgehog/MAPK/p53）信号通路、神经退行性疾病（PD/AD/HD）、代谢途径和细胞周期等。iPSCd0 vs iPSCd7前20项显着富集的功能还包括神经元分化调节、中枢神经系统发育、Wnt信号和凋亡等,与诱导分化密切相关。MIAT及其靶基因MAPK10在iPSCd7组的表达量高于iPSCd0组（p<0.05）,与测序结果相一致。hiPSC-MIAT细胞呈克隆状增殖生长,多能性基因的表达水平与hiPSCs无统计学差异,碱性磷酸酶染色阳性且大量表达OCT4阳性细胞。hiPSC-MIAT诱导至第5天即可见大量细胞向外伸展生长呈分化状态,OCT4、EN1、NURR1基因表达水平高于对照组（p＜0.05）,SOX1和PAX6基因表达水平低于对照组（p<0.05）。（2）成功构建了 6-OHDA大鼠PD模型,黑质TH+神经元减少约90%以上,纹状体DA、DOPAC和HVA的含量分别为对照组的4.28%、8.40%、4.96%。模型大鼠5个脑区均发生了基因改变,GO和KEGG功能富集分析显示DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。韦恩分析5个脑区共有DEGs为Ephx2和Faml11a。PPI分析纹状体主要节点基因为Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh。DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的共有级联结构,即以Gi/o为中心的Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK。PD模型5个脑区均存在不同程度的线粒体形态异常。（3）阿扑吗啡诱导旋转测试显示,ADSCd12、iPSCd18和iPSCd25有效比例较高且有效时长到达观察终点32周,其中iPCSd18组有效比例最高。与对照组相比,干细胞移植各组大鼠肌力均有所提升（p<0.05）,移植各组之间无统计学差异。与对照组相比,移植大鼠的总活动路程和总运动时间均显着升高（p<0.05）,各移植组之间无统计学差异。与对照组相比,移植组大鼠的跨区域次数增加,其中ADSCd12组高于iPSCd25组（p<0.05）。MIRB标记的移植细胞能够在脑内生长,细胞移植后能够发生迁移,迁移方式包括局部迁移、向胼胝体迁移和跨脑区的远程迁移。细胞移植后8周,部分移植细胞PCNA染色阳性,移植后32周PCNA+细胞较少。iPSCd18组细胞移植后32周,部分分化为DA能神经元表达TH阳性。细胞移植后8周针道周围大量星形胶质细胞被激活,呈纤维束网状或胞体增大增厚,移植后32周表达减少。细胞移植后8周,大鼠5个脑区的线粒体形态异常均有不同程度的改善。结论（1）hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系中,细胞诱导5-7天处于NSCs阶段,11天进入DA能神经元前体细胞阶段,25天TH+细胞比例约为40%。（2）hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中存在广泛的lncRNAs表达和功能变化,部分功能调节与诱导分化关系密切。（3）LncRNA MIAT及其靶基因MAPK10在诱导第7天细胞中表达升高。过表达MIAT不影响hiPSCs的多能性,但在诱导分化过程中促进hiPSCs向中脑DA能神经元前体细胞分化。（4）6-OHDA大鼠PD模型在病理生化和基因水平都能够很好地模拟人类PD,5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）均发生了基因改变,DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。（5）5个脑区的共有DEGs（Ephx2和Faml11a）和纹状体的主要节点基因（Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh）可能是PD分子机制和治疗的关键靶点。（6）DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的以Gi/o为中心的共有级联结构（Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK）,可能是PD突触损伤的关键分子机制。（7）各类干细胞及其诱导细胞移植治疗PD大鼠均能在一定程度上改善动物行为障碍（转数、肌力、自主活动能力）,ADSCd12组、iPSCd18组和iPSCd25组的治疗效果相对较好且维持时间较长,其中iPSCd18组的行为学评价有效比例最高。（8）移植细胞能够在脑内生长并以不同方式迁移,初期具有增殖能力,促进大量星形胶质细胞的表达,后期有所降低,能够分化为DA能神经元,对脑区内线粒体超微结构损伤有一定的改善作用。干细胞功能的年龄依赖性下降在衰老中起着重要作用,但其分子机制尚不清楚。PTRF（polymerase I and transcript release factor）是胞膜窖形成和发挥功能的重要成分,参与调节细胞增殖、内吞作用、信号转导和衰老等生物学功能。本研究旨在通过PTRF转基因小鼠分析PTRF在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老中的作用。采用流式细胞术检测免疫细胞和造血干/祖细胞的比例;测定HSCs的细胞周期、衰老和ROS表型。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测衰老相关基因和蛋白的表达水平。结果表明,PTRF转基因小鼠骨髓中HSCs数量明显增多,并表现出G1期细胞周期停滞、SA-β-Gal阳性率增加和活性氧水平升高的衰老表型。PTRF过表达的HSCs在体内、体外的自我更新和造血重建能力也显着降低。PTRF通过 ROS-p38-p16 和 caveolin-1-p53-p21 途径诱导 HSCs 衰老。
高飞[8]（2020）在《AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用》文中进行了进一步梳理糖尿病及骨质疏松症都是发病率很高的慢性进展性疾病,二者均影响患者生活质量,是造成患者致残及致死的主要原因之一。晚期糖基化终末产物（AGEs）是体内各脏器蛋白质在非催化酶参与的Maillard反应中,形成的多种结构稳定而不可逆的化合物。高血糖时,晚期糖基化终末产物生成加速,是造成多种糖尿病慢性并发症及原发性骨质疏松症的主要成因。一定条件下,骨髓间充质干细胞（MSCs）可以诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。来源于链尿霉素诱导的糖尿病鼠的骨髓间充质干细胞更趋向于衰老,增殖及分化能力减弱。体外实验中,AGEs抑制MSCs的增殖、自我更新及分化。AGEs增加晚期糖基化终末产物受体（RAGE）表达,抑制MSCs的矿化及成熟。体内、外实验均证明AGEs-RAGE可从多个方面影响骨质量,是糖尿病致骨质疏松的主要成因之一。Wnt/β-catenin信号通路调节骨形成与骨分化,促进骨髓间充质干细胞成骨,抑制成脂。细胞外的Wnt糖化蛋白与细胞表面受体结刺激细胞内事件合后发生,最具代表性的Wnt信号通路是经典的Wnt/β–catenin信号通路。既往研究多集中于AGEs或RAGE作用于骨髓间充质干细胞株或成骨细胞系的机制研究,然而,AGEs在原代培养的骨髓间充质干细胞增殖中的作用及机制报道不多。本研究探讨晚期糖基化终末产物在原代培养骨髓间充质干细胞层面抑制成骨分化机制及甲状旁腺素（PTH）的干预作用及机制,为糖尿病致骨质疏松的防治提供理论基础。第一部分大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定目的:诱导、纯化BMSCs,观察BMSCs的成骨细胞、成脂细胞分化能力,进行BMSCs表面标记物的鉴定。方法:取4周龄健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠,脱颈处死后,分离双下肢,提取骨髓间充质干细胞,接种于培养瓶中,于37℃、5%CO2的孵育箱中孵育。采用1:2的比例传代培养,在倒置显微镜下观察第三代骨髓间充质干细胞贴壁细胞的形态改变以及生长变化;连续观察1周,通过血细胞计数板计数绘制细胞生长曲线;流氏细胞仪进行第三代BMSCs细胞表型鉴定;茜素红染色及油红O染色观察BMSCs成骨细胞、成脂细胞诱导分化能力。结果:原代BMSCs形态以梭形细胞为主,呈现放射状的集落细胞单位排列,伴随传代增加,细胞形态较前变短,且见伸出足突。细胞生长曲线提示传代培养的骨髓间充质干细胞符合正常细胞的生长特征且细胞生长能力良好。第三代骨髓间充质干细胞CD29,CD44,CD90表达为阳性,CD34,CD45表达隐阴性。骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后,茜素红染色、Von Kossa染色呈阳性。骨髓间充质干细胞经成脂诱导分化后,油红O染色呈阳性。结论:全骨髓贴壁培养法培养骨髓间充质干细胞,其操作步骤简单,且满足大量分离、纯化、扩增要求。培养成熟的细胞符合骨髓间充质干细胞的生物学特征,经诱导分化后具有成骨及成脂分化潜能。第二部分Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制BMSCs成骨分化目的:AGEs通过Wnt/β-catenin信号通路介导抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。方法:不同浓度AGEs（0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml）干预骨髓间充质干细胞细胞72小时,CKK-8法鉴定细胞增殖水平。选择0.2mg/ml AGEs和小牛血清白蛋白干预,细胞培养至3-7天CCK法测定细胞增殖情况,成骨液诱导第7天RT-PCR测定Col-Ⅰ及LRP5mRNA表达,Western-blot检测AGEs对BMSCs成骨分化过程中B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE表达量的影响,28天茜素红染色比较矿化结节形成差异。给予RAGE中和抗体阻断RAGE信号通路后观察AGEs对ALP、LRP5、RUNX2、OSX和RAGEmRNA及B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白表达的影响。给予Wnt/β-catenin通路促进剂Wnt3a后观察β-catenin、OSX、RAGE蛋白表达的影响。结果:在BMSCs培养基中分别加入不同浓度AGEs后与相应浓度的BSA组比较,BMSCs的OD值都有所降低,且在0.05mg/ml0.2mg/ml范围内（P<0.05）。0.2mg/ml的AGEs及相应浓度的BSA作用细胞3-7天,AGEs组较BSA组BMSCs的增殖情况有差异（P<0.05）。AGEs组作用于BMSCs28天后较对照组矿化结节的形成数量减少。选用含0.2mg/ml AGEs的成骨诱导液培养细胞7天后,Western-blot检测显示AGEs增加RAGE蛋白表达,抑制β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达（P<0.05）。给予RAGE中和抗体阻断RAGE信号通路后减少RAGE表达,增加ALP、Runx2、OSXmRNA表达（P<0.05）。Western-blot结果显示AGEs增加RAGE蛋白表达,抑制β-catenin蛋白表达（P<0.05）。给予Wnt/β-catenin通路促进剂Wnt3a后增加了β-catenin、OSX蛋白表达,抑制了RAGE蛋白表达（P<0.05）。28天茜素红染色比较矿化结节提示AGEs组明显抑制了钙结节的形成,而间断加入Wnt3a后可以部分对抗AGEs的成骨分化抑制作用。结论:Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。抗RAGE中和性抗体阻断AGEs与RAGE的结合后,骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力增强。Wnt3a促进Wnt/β–catenin通路作用,部分拮抗AGEs的成骨分化抑制作用。第三部分AGEs对BMSCs增值、成骨分化影响及PTH干预作用目的:在给予AGEs刺激因素的基础上,加入外源性的PTH,检测细胞增殖及分化,观察PTH是否可拮抗AGEs的作用。方法:AGEs作用于BMSCs7天后,采用RT-PCR检测ALP、COL-ⅠmRNA;Western Blot检测β-catenin、OSX、RUNX2、RAGE蛋白;AGEs作用于BMSCs 28天后,茜素红染色和Von Kossa染色检测AGEs对于BMSCs矿化的影响。PTH预处理BMSCs,给予AGEs作为干预因素,RT-PCR法检测ALP、COL-ⅠmRNA,Western Blot技术检测B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白,第28天茜素红染色,观察矿化结节形成情况。结果:PTH干预后,抑制了AGEs的作用,与AGEs组相比RAGE蛋白表达减少,β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达增高（P<0.05）。10-8mmol/L PTH干预后部分逆转AGEs成骨分化,定量分析茜素红染色钙结节的形成表明在28天AGEs抑制88%细胞矿化（P<0.05）,PTH可以修复23%AGEs对骨髓间充质干细胞的负性作用（P<0.05）。结论:PTH通过Wnt/β–catenin信号通路部分逆转AGEs对BMSCs增殖、成骨分化的负性作用。
韩朝[9]（2020）在《丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究》文中研究表明背景来自实验动物疾病模型和早期临床试验的有力证据表明,神经干细胞移植是开发临床适用的外源性干细胞疗法的可行途径。基于目前在NSC生物学领域的进展和移植研究的积极成果,当代的观点是移植的NSC作为宿主本地“工厂”能够产生和分泌大量的免疫和神经营养因子,包括那些细胞外膜囊泡中包含因子,NSC移植物作为一种天然的生物制剂来源,能够调节和促进中枢神经系统（CNS）组织在急性或慢性组织损伤后的几个关键功能的恢复。但如何将NSC更为有效的定植于损伤器官组织,更加有效的让其分泌的因子作用于损伤微环境是神经组织工程亟待解决的问题。生物材料、细胞和刺激是神经组织工程的三个主要组成部分。组织工程神经材料已成为神经再生和功能恢复的一种潜在的替代自体神经移植物。各种材料的研究以改善特性和增强功能为出发点,生物可降解、生物相容、导电和免疫惰性的支架最终的目标是准确地模拟我们体内的细胞外基质,并通过各种聚合物、细胞和生长因子诱导出一种生物化学、地形学和电信号的组合,从而高效地进行神经定植及神经网络再生。选择合适的支架材料来促进神经细胞和非神经细胞的分化以及轴突的生长是神经组织工程整体设计策略的关键。在众多支架材料中,水凝胶已被证明是神经源性细胞培养和分化的良好选择。考虑到神经系统对再生的固有抗性,水凝胶已大量用于释放神经营养因子、神经生长抑制剂拮抗剂和其他神经生长促进剂。组内前期研究工作在静电力作用下获得的丝素蛋白水凝胶,电镜结果显示该凝胶具有纳米取向空隙,能够支持神经元的粘附生长。姜黄素广泛应用于各种疾病的防治。近年来,姜黄素作为神经源性和神经保护剂的应用受到越来越多的关注。姜黄素作为炎症条件因子,在神经干细胞的活力维持,神经向分化中的优势也得到了研究者的证实。目的本研究的目的分为三个方面:提取并稳定传代人胚胎来源神经干细胞,鉴定人神经干细胞的增殖能力、特异性标记物表达及分化能力,利用丝素蛋白水溶液来检验丝素蛋白是否影响神经干细胞的活力,增殖及分化能力,为后期利用丝素蛋白制备水凝胶支架结构奠定基础。通过静电场力作用丝素蛋白制备三维取向水凝胶,筛选适合的水凝胶浓度,结合NSC进行粘附培养、检测水凝胶结构对NSC的贴壁性,神经向分化能力的影响,尤其针对神经元轴突发育及伸展取向性进行研究。同步构建大鼠缺血缺氧性脑损伤模型,观察取向水凝胶及对照组无序水凝胶结合NSC移植治疗后的修复效果。探讨姜黄素作为炎症调控,多种信号激活的中药单体对NSC结合丝素水凝胶的神经组织工程组织的干预作用,为神经保护机制的研究和体外药物筛选提供新的思路。方法1.机械法消化提取人胚神经干细胞,无血清法悬浮培养法扩增神经球,CCK8检测NSC增殖能力,流式细胞仪及免疫荧光法检测神经干细胞干性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4表达。经分化培养基培养至14天,经形态学,免疫荧光检测神经元Tub3、少突胶质GFAP、小胶质细胞的特异性标记蛋白O4的表达,明确分化能力。验证提取方法获得的神经干细胞属性。利用丝素蛋白水溶液（SF）加入到神经干细胞的培养基中,观察形态学,利用CCK8及PI染色检测SF对神经干细胞增殖及死亡的影响。免疫荧光染色检测SF对NSC干性的影响。2.静电法制备0.5%、1%、2%丝素蛋白水溶液并筛选合适的水凝胶浓度,将NSC在三维取向丝素蛋白水凝胶中分化培养,并将自然形成的无序丝素蛋白水凝胶作为对照组,Calcein-AM活细胞染色观察细胞形态,检测轴突的伸展方向,分化后经Tub3及GFAP染色并量化计算NSC向神经元及神经胶质细胞的分化比例。利用Fluo-AM试剂染色经流式细胞仪检测钙离子在两种细胞中的变化,共聚焦检测轴突蛋白Bassoon在分化后神经元突触中的表达,RT-PCR检测轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp在两种细胞中的表达情况,分析有序水凝胶对轴突发育及轴突伸展的影响。3.构建大鼠缺血缺氧模型,选取三组损伤组（HI）、神经干细胞治疗组（NSC）及神经干细胞结合有序丝素蛋白水凝胶组（NSC+Silk）,每组10只。于出生后7天造模,10天治疗,28天行为学实验（圆柱筒、平衡木及水迷宫）,39天处死,固定、切片,进行GFAP免疫组化及Tub3、GFAP及Neu N的免疫荧光染色。获取海马区组织进行神经相关因子检测BDNF,NGF的ELISA检测。4.筛选1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml不同浓度的姜黄素作用于NSC,利用CCK8染色法检测NSC细胞活力。Ed U染色法检测不同浓度Cur对NSC增殖能力的影响。Annexin-V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡发生。检测不同浓度下Cur对NSC分化为神经细胞过程的影响,待分化培养12天,通过软件分析单位面积神经元数量及神经元轴突长度,收集分化培养6、12天的细胞样本检测GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达,分析姜黄素对神经向分化的作用。结果1.经机械法原代提取的神经干细胞经7-10天可以形成标准的神经球集落,海马区的NSC增殖速度快,大小均匀,形态规则,指数生长期为5-7天,P1,3,5代的NSC增殖能力一致,倍增时间无显着性差异。获取的海马区NSC表达神经干细胞特异性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4。能够在分化培养环境下分化为具有神经元形态细胞,并部分表达Tuj1、GFAP,神经元及神经胶质细胞特异性标记蛋白。2.对照组、两种浓度0.01%及0.1%的SF作用于NSC后倍增时间分别为:65.3h、76.2h及42.2h,检测SF对NSC细胞的死亡率影响,对照组,0.01%及0.1%分别为:31.5%,38.5%,40.6%,均不具有显着性差异。0.01%浓度的SF加入至培养基经免疫荧光染色检测Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2六个神经干细胞特异性标记物表达均为阳性。3.静电场力作用获得1%浓度的取向丝素蛋白水凝胶最适合于NSC悬浮及分化培养,对比无序水凝胶材料,分化后的神经细胞在有序水凝胶表面获得的轴突伸展方向一致性提高,有序丝素蛋白水凝胶能够提升神经元的分化比例为10.7±3.1个,照比无序材料的7.3±2.5个有显着性提高,神经元轴突长度统计分析无序凝胶为105.7±10.2nm,有序凝胶为400.3±25.3nm,神经元轴突长度进行量化并统计。能够显着提高神经元的轴突长度,并增高轴突内Bassoon蛋白及的表达,GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因的表达在分化12天时发生显着升高。4.成功建立大鼠缺血缺氧模型,经NSC及NSC+Silk治疗后,脑缺损区域减小,对比损伤组GFAP表达胶质细胞在皮层区、CA1区、DG区及CA3区表达下降,但NSC组与NSC+Silk组之间没有显着性变化。治疗后神经元细胞比例增高,海马区的GFAP比例下降,海马区Neu N的表达在治疗后升高,均据有统计学差异。平衡木试验结果及圆柱桶试验均发生治疗组有明显的修复效果,水迷宫试验结果显示NSC+Silk组有更好的修复效果。在治疗后1天海马组织内的BDNF及NGF因子含量即发生显着性升高,并在后期维持高表达状态。5.1mg/ml姜黄素作用于神经干细胞,不影响NSC增殖,大于5mg/ml的Cur抑制NSC增殖。1mg/ml Cur作用后,Ed U标记率增大但无统计学差异。2.5mg/ml,5mg/ml Cur作用后阳性率降低,表明NSC的增殖率下降。1mg/ml Cur与Cont组相比较没有显着变化。表明高浓度Cur能显着诱导NSC细胞发生凋亡。0.5mg/ml,1mg/ml,2.5mg/ml浓度不影响神经干细胞的分化形态,但5mg/ml,10mg/ml浓度明显抑制神经干细胞分化后贴壁细胞的伸展。经Cur处理,单位面积的神经元数量显着高于对照组,神经元轴突的长度也在分化12天时显着高于对照组。轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达检测的表达在12天时照比对照组有所升高。结论1.本实验部分成功提取了人胚胎来源的海马区原代NSCs,能够稳定进行扩增培养及特异性标记物鉴定,NSC能成功分化为神经元、胶质细胞,符合NSCs的基本属性和生物学特性;2.检测了丝素蛋白水溶液作为支架材料的生物安全性,评价了其对NSCs形态学、增殖能力及干性能力均无影响,体现了其良好的生物相容性。可作为后续的神经组织工程材料进行深入研究。1%浓度的丝素蛋白水凝胶能够支持神经干细胞增殖。静电作用获得的有序丝素蛋白水凝胶能够提高神经干细胞向神经元分化比例。有序丝素蛋白水凝胶在向神经细胞分化中能够增强神经元轴突GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因表达,促进神经突触的发育及迁移。有序丝素蛋白水凝胶结合NSC治疗大鼠脑缺血缺氧模型,对运动行为及学习记忆有修复功效。3.高浓度（>2.5mg/ml）姜黄素导致NSC细胞死亡,低浓度（<1mg/ml）促进NSC细胞增殖。1mg/ml姜黄素能够促进人神经干细胞向神经元分化,提高分化效率,提高分化后神经元突触长度及突触相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp表达。
陈翰林[10]（2020）在《IL-17A促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的体外机制研究》文中认为目的这项研究旨在探讨白细胞介素17A（IL-17A）是否可能具有促进间充质干细胞（MSCs）体外进行神经向分化的能力,并研究相关的分子机制。方法首先使用全骨髓贴壁法体外培养大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）,然后在神经分化诱导培养基模拟神经源性分化的过程中,将不同浓度的IL-17A（浓度范围设置为5 ng/ml,10 ng/ml,20 ng/ml,30 ng/ml,40 ng/ml）应用于大鼠的骨髓MSCs中。采用RT-q PCT和形态学分析的方法确定IL-17A促进骨髓间充质干细胞向神经向分化的最佳浓度。随后,我们在BMSCs神经源性分化的基础上用最佳浓度的IL-17A继续诱导其进行神经分化。通过RT-q PCR和WB的方法检测成神经相关基因和蛋白Tubulin、Hes-1和Thy-1的表达,并通过吉姆萨染色法和免疫荧光染色法探究细胞的形态学变化和成神经特异性标记物Thy-1表达的情况。此外,我们仍然通过RT-q PCR和WB的方法检测与成神经有关的信号通路相关基因和蛋白Jagged-1、Notch-1、Wnt3a和β-catenin的表达。并紧接着仍然通过吉姆萨染色法和免疫荧光染色法探究细胞的形态学变化和成神经特异性标记物Thy-1和CD24表达的情况。使用Graph Pad Prism 6.01软件对图像和数据进行处理和分析,所有数据均表示为平均值±SE。我们获得的P值小于0.05,被认为具有统计学意义。结果采用RT-q PCT和形态学分析的方法确定IL-17A促进骨髓间充质干细胞向神经向分化的最佳浓度为20 ng/ml。我们使用RT-q PCR、WB、吉姆萨染色法和免疫荧光染色法等方法确定了20 ng/ml的IL-17A对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化具有较好的促进效果。在机制上,我们使用上述同样的方法发现,在细胞神经分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路的传导途径被激活并且Notch信号通路的传导途径被抑制。此外,这两条信号通路在调节IL-17A诱导BMSCs神经源性分化过程中具有一定的拮抗作用。结论最佳浓度为20 ng/ml的IL-17A具有较强的促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的能力。在机制上,Wnt/β-catenin信号通路被激活并且Notch信号通路被抑制与这个分化过程相关。
二、大鼠骨髓细胞诱导分化神经细胞的形态学观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠骨髓细胞诱导分化神经细胞的形态学观察（论文提纲范文）
（1）ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、总论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（3）白藜芦醇对去卵巢大鼠骨质疏松及抑郁样行为的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 白藜芦醇对去卵巢大鼠骨形态学及骨转化指标的影响 |
| 第一节 实验材料及方法 |
| 1. 实验材料、试剂与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. 白藜芦醇干预后对大鼠体重及子宫重量的影响 |
| 2. 白藜芦醇干预后对大鼠骨形态的影响 |
| 3. 白藜芦醇干预后对大鼠血清骨转化标志物的影响 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 白藜芦醇对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响 |
| 第一节 实验材料及方法 |
| 1. 实验材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. 白藜芦醇对MC3T3-E1细胞活性的影响 |
| 2. 白藜芦醇对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响 |
| 3. 白藜芦醇对MC3T3-E1细胞ERK/Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 白藜芦醇对去卵巢大鼠抑郁样行为及神经递质的影响 |
| 第一节 实验材料及方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. 白藜芦醇可改善去卵巢大鼠抑郁样行为 |
| 2. 白藜芦醇可升高血清5-HT、脑内5-HT和GABA含量,降低Glu的含量 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 白藜芦醇对皮质酮诱导神经元样细胞PC12细胞细胞损伤的影响 |
| 第一节 实验材料及方法 |
| 1. 实验材料、试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3. 数据统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. 白藜芦醇可增加皮质酮处理的PC12细胞活性 |
| 2. 白藜芦醇可减少皮质嗣处理后的PC12细胞凋亡 |
| 3.白藜芦醇对皮质酮处理的PC12细胞Bcl-2、BAX及Caspase-3蛋白表达的影响 |
| 第三节 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 贡献和创新点 |
| 不足和展望 |
| 博士研究生期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词汇表 |
| 前言 |
| 第一章 慢病毒载BMP-7 基因转染大鼠BMSCs诱导其向神经元样细胞分化的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 骨髓间充质干细胞的分离培养[22] |
| 1.1.5 骨髓间充质干细胞鉴定 |
| 1.1.6 最佳感染复数(MOI)检测 |
| 1.1.7 慢病毒转染后骨髓间充质干细胞存活情况 |
| 1.1.8 免疫组化检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 表达情况 |
| 1.1.9 qRT-PCR检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 mRNA表达情况 |
| 1.1.10 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 骨髓间充质干细胞培养形态特点 |
| 1.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定结果 |
| 1.2.3 慢病毒转染情况 |
| 1.2.4 不同时间点骨髓间充质干细胞存活率 |
| 1.2.5 转染后细胞形态学变化 |
| 1.2.6 免疫组化检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 表达情况 |
| 1.2.7 qRT-PCR检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 mRNA表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 慢病毒载BMP-7 基因转染大鼠BMSCs移植治疗脊髓损伤的修复作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 制作脊髓损伤动物模型 |
| 2.1.5 慢病毒载BMP-7 基因转染BMSCs |
| 2.1.6 动物分组及治疗 |
| 2.1.7 行为学评估 |
| 2.1.8 脊髓组织标本获取 |
| 2.1.9 免疫组化检测脊髓NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.1.10 qRT-PCR检测脊髓组织NF-200、GFAP mRNA表达情况 |
| 2.1.11 Western Blot检测脊髓组织NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.1.12 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 BBB评分 |
| 2.2.2 免疫组化检测脊髓组织NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测脊髓组织NF-200、GFAP mRNA表达情况 |
| 2.2.4 Western Blot检测脊髓组织NF-200、GFAP表达情况 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（5）虎杖苷上调Nrf2/ARE促进神经分化在骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 脊髓损伤的中西医治疗进展 |
| 一、脊髓损伤的概述、流行病学及病理机制 |
| 二、脊髓损伤的治疗进展 |
| 三、中医对脊髓损伤的认识 |
| 四、中医药在脊髓损伤的治疗进展 |
| 五、中医药联合BMSCs移植在脊髓损伤的治疗进展 |
| 第二节 Nrf2/ARE信号通路在脊髓损伤中的研究进展 |
| 一、Nrf2/ARE信号通路的起源及其调控 |
| 二、Nrf2/ARE信号通路在脊髓损伤中的调控作用 |
| 三、Nrf2/ARE信号通路在BMSCs向神经分化及脊髓损伤治疗中的应用前景 |
| 第二章 虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、细胞形态观察与鉴定 |
| 二、CCK-8检测细胞活性结果 |
| 三、神经诱导分化后细胞形态观察 |
| 四、Western blot检测结果 |
| 五、RT-qPCR检测结果 |
| 六、细胞免疫荧光检测结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、BrdU标记BMSCs |
| 二、脊髓损伤模型造模后小鼠的一般情况 |
| 三、脊髓组织免疫荧光检测结果 |
| 四、Wetern blot检测结果 |
| 五、ELISA检测结果 |
| 六、氧化应激指标检测结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、细胞实验结果 |
| 二、动物实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、行为学评价 |
| 二、神经电生理检测结果 |
| 三、组织形态学结果 |
| 四、脊髓组织神经结构恢复结果 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）壮骨止痛胶囊调控Notch通路对去卵巢大鼠Notch1、Jagged1、HES蛋白的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文索引 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分组造模 |
| 1.2.2 给药观察 |
| 1.2.3 处死取材 |
| 1.2.4 骨髓间充质干细胞的培养与传代 |
| 1.2.5 流式细胞仪单染检测 |
| 1.2.6 HE染色 |
| 1.2.7 免疫组化测定骨组织与肾组织的Notch1、Jagged1、HES表达水平 |
| 1.2.8 ELISA检测血清中P1NP含量 |
| 1.2.9 统计学处理 |
| 二、结果与分析 |
| 2.1 骨髓间充质干细胞流式单染检测结果 |
| 2.2 ELISA检测血清中P1NP含量 |
| 2.3 HE染色 |
| 2.4 免疫组化检测肾组织中Notch1、Jagged1、HES的表达水平 |
| 2.5 免疫组化检测骨组织中Notch1、Jagged1、HES的表达水平 |
| 三、讨论 |
| 3.1 中医与PMOP |
| 3.2 PMOP与 Notch通路 |
| 3.3 壮骨止痛胶囊成分分析 |
| 3.4 壮骨止痛胶囊通过Notch通路干预PMOP的机制 |
| 四、结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Notch信号通路与骨髓间充质干细胞分化的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
（7）LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠模型的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化中lncRNAs的差异表达及lncRNA MIAT的调节作用 |
| 前言 |
| 第一节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. hiPSCs的细胞培养与多能性鉴定 |
| 2. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程和细胞形态 |
| 3. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关基因表达 |
| 4. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关标志物的免疫荧光染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化过程中lncRNAs的表达变化和功能分析 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 测序样本总RNA的质量检测 |
| 2. LncRNAs测序数据质量评估 |
| 3. 比对分析结果 |
| 4. 表达量分析结果 |
| 5. 差异基因表达与验证 |
| 6. 差异基因聚类 |
| 7. 差异表达mRNAs的富集分析结果 |
| 8. LncRNAs co-expression靶基因预测与功能分析 |
| 9. LncRNAs co-location靶基因预测与功能分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 LncRNA MIAT调节hiPSCs的神经分化 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA MIAT与共表达靶基因KEGG通路分析与验证 |
| 2. 成功构建转录激活过表达lncRNA MIAT的hiPSCs细胞系 |
| 3. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs多能性的影响 |
| 4. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs向DA能神经元诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 6-OHDA大鼠帕金森模型的建立和不同脑区的转录组分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 6-OHDA大鼠PD模型的损伤程度 |
| 2. 测序样本总RNAs的质量检测 |
| 3. mRNAs测序数据质量评估 |
| 4. 比对分析结果 |
| 5. 5个脑区的表达量分析结果 |
| 6. 5个脑区的差异表达基因(DEGs)与验证 |
| 7. 5个脑区的差异基因聚类分析与韦恩分析 |
| 8. 5个脑区的差异基因富集分析 |
| 9. 5个脑区的PPI分析与验证 |
| 10. KEGG分析关键信号通路的验证 |
| 11. 6-OHDA大鼠PD模型5个脑区的线粒体超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 干细胞移植治疗6-OHDA大鼠帕金森模型的效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 干细胞鉴定 |
| 2. APO诱导旋转测试不同类型干细胞移植治疗的行为学效果评价 |
| 3. 旷场试验和抓力测试 |
| 4. 移植细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化 |
| 5. 细胞移植后星形胶质细胞的表达 |
| 6. 细胞移植后超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 PTRF转基因小鼠中造血干细胞的功能受损 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. PTRF的表达随年龄增长而增加并促进髓系分化 |
| 2. PTRF过表达耗损HSCs |
| 3. PTRF过表达损伤HSCs的功能 |
| 4. PTRF诱导HSCs衰老 |
| 5. PTRF通过Cav-1激活了HSCs的衰老通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在神经发育和帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 hiPSCs质检报告(赛贝公司) |
| 附件2 表5-1 iPSCd0组与iPSCd7组转录本水平差异显着的lncRNAs |
| 附件3 表5-2 iPSCd0组与iPSCd7组基因水平差异显着的mRNAs |
| 附件4 表5-3模型组与对照组在OB区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件5 表5-4模型组与对照组在SVZ区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件6 表5-5模型组与对照组在Str区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件7 表5-6模型组与对照组在SN区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件8 表5-7模型组与对照组在Hippo区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定 |
| 前言 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 观测 BMSCs 的形态学 |
| 2.2 BMSCs的细胞生长曲线 |
| 2.3 BMSCs表面标记物的表达 |
| 2.4 BMSCs 成骨诱导分化鉴定 |
| 2.5 成脂诱导分化鉴定 BMSCs |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制BMSCs成骨分化 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 AGEs对 BMSCs增殖的影响 |
| 2.2 AGEs对 BMSCs成骨分化过程中矿化(钙结节的形成)的影响 |
| 2.3 AGEs对 Col-ⅠmRNA、LRP5 mRNA表达的影响 |
| 2.4 AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白表达影响 |
| 2.5 促进B-cateninm信号通路观察AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及矿化的影响 |
| 2.6 抑制RAGE表达后AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 AGEs对 BMSCs增殖、成骨分化影响及PTH的干预作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同实验组对细胞ALP、COL-1mRNA表达水平影响 |
| 2.2 Western-blot检测B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE的表达量 |
| 2.3 茜素红染色,观察PTH预处理后AGEs对 MSCs成骨分化过程中矿化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.AGEs |
| 1.1 AGEs的来源 |
| 1.2 AGE的受体 |
| 2.RAGE |
| 3.AGE和 RAGE不利的影响: |
| 3.1 非受体介导途径 |
| 3.2 受体介导的机制 |
| 4.AGEs 与骨质疏松症的关系 |
| 4.1 AGEs介导骨胶原蛋白交联 |
| 4.2 AGEs与成骨细胞 |
| 4.3 AGEs与破骨细胞 |
| 4.4 AGEs与骨髓间充质干细胞 |
| 5.RAGE异变体的产生 |
| 6.预防 AGE-RAGE 的相互作用 |
| 7.预防AGE对骨的不利影响 |
| 8.小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人神经干细胞原代提取及丝素蛋白作为神经组织工程材料安全性分析 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基配置 |
| 2.方法 |
| 2.1 人神经干细胞(hNSC)的原代培养、传代、冷冻、复苏 |
| 2.2 NSC分化实验 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 神经干细胞免疫荧光鉴定 |
| 2.5 流式细胞仪检测NSC死亡率 |
| 2.6 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同脑区神经干细胞原代提取形态学 |
| 2.海马区神经干细胞形态学 |
| 3.神经干细胞增殖能力 |
| 4.神经干细胞特异性标记物表达 |
| 5.分化后神经细胞形态及标记物表达 |
| 6.丝素蛋白水溶液对神经干细胞形态及生长活力的影响 |
| 7.丝素蛋白水溶液对NSC死亡率的影响 |
| 8.丝素蛋白水溶液对NSC干性的影响 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第二部分 丝素蛋白水凝胶通过影响NSC的轴突发育治疗大鼠缺血缺氧性脑损伤 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 丝素蛋白水凝胶制备及细胞结合培养 |
| 2.2 分化后神经细胞轴突长度及相关基因检测 |
| 2.3 NSC结合水凝胶对缺血缺氧模型的治疗 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度丝蛋白凝胶材料对神经干细胞悬浮生长状态的影响 |
| 2.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的形态学 |
| 3.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的神经元与神经胶质比例 |
| 4.丝素蛋白水凝胶培养后神经元轴突长度 |
| 5.丝素蛋白水凝胶培养后Bassoon蛋白表达 |
| 6.有序丝素蛋白水凝胶对NSC突触可塑性的影响 |
| 7.SD大鼠缺血缺氧模型构建及NSC治疗 |
| 8.NSC+Silk治疗对Tub-3及GFAP表达的影响 |
| 9.NSC+Silk治疗对Neu N蛋白表达的影响 |
| 10.鼠缺血缺氧模型经治疗后运动受损情况 |
| 11.鼠缺血缺氧模型治疗后学习记忆功能改善 |
| 12.海马组织内神经相关因子表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第三部分 姜黄素对神经组织工程组织的作用及机制研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 姜黄素的配制 |
| 2.2 EdU标记率测定 |
| 2.3 细胞凋亡实验 |
| 2.4 轴突数据处理 |
| 2.5 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度Cur对 NSC细胞毒性检测 |
| 2.不同浓度Cur对 NSC增殖能力的影响 |
| 3.不同浓度Cur对 NSC凋亡的影响 |
| 4.不同浓度Cur对 NSC分化形态的影响 |
| 5.姜黄素影响分化神经元轴突长度 |
| 6.姜黄素对分化后神经元轴突相关基因表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 综述 神经组织工程(NTE)研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）IL-17A促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的体外机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 IL-17A 在缺血性卒中患者中的炎症机制研究 |
| 参考文献 |
四、大鼠骨髓细胞诱导分化神经细胞的形态学观察（论文参考文献）
- [1]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [2]骨形态发生蛋白7体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元分化的研究[J]. 白广超,张文,高磊,李宽新. 中华骨科杂志, 2020(12)
- [3]白藜芦醇对去卵巢大鼠骨质疏松及抑郁样行为的干预作用及机制研究[D]. 张晔. 南方医科大学, 2020(01)
- [4]BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究[D]. 张文. 石河子大学, 2020(08)
- [5]虎杖苷上调Nrf2/ARE促进神经分化在骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤中的应用[D]. 詹吉恒. 广州中医药大学, 2020
- [6]壮骨止痛胶囊调控Notch通路对去卵巢大鼠Notch1、Jagged1、HES蛋白的影响[D]. 刘湘琳. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [7]LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究[D]. 吕颖. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用[D]. 高飞. 山西医科大学, 2020(11)
- [9]丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究[D]. 韩朝. 大连医科大学, 2020(03)
- [10]IL-17A促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的体外机制研究[D]. 陈翰林. 安徽医科大学, 2020(02)