一、雏半番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定（论文文献综述）
孔桂慧[1]（2021）在《鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究》文中进行了进一步梳理鸭新型呼肠孤病毒病是由鸭新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的一种鸭禽传染病,其典型病变特征为肝脏肿大出血、脾脏坏死、鸭只体重减轻。2017年11月,菏泽地区商品鸭场的10日龄樱桃谷鸭出现以肝脏肿大出血、脾脏坏死为特征的传染病,对养殖业造成了巨大损失。本研究为该病的有效防控提供了技术支持。主要内容包括:1.NDRV的分离鉴定无菌取菏泽地区10日龄商品代樱桃谷肉鸭的肝脏、脾脏并研磨,将病料过滤后分别接种SPF鸡胚、SPF鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,培养3～5 d后,收集死亡胚体尿囊液和病变细胞上清液使用NDRVσC基因特异性引物进行RT-PCR鉴定及测序分析。结果显示,分离到1株NDRV,命名为NDRV017株,该分离株与NCBI上9株NDRV参考毒株的相似性在95.3～99%之间。2.灭活疫苗的初步研制将病毒液接种到Vero细胞,待细胞病变程度达80%时,使用3‰甲醛灭活36h,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。3.灭活疫苗的免疫原性探究将种鸭二免后28 d的种蛋孵化出的1日龄雏鸭作为试验鸭,同时设同批次未免疫种鸭的后代作为阴性对照,人工感染用NDRV株为NDRV017E3株。阴性对照组腿肌接种灭菌PBS 0.8 m L,其余三组分别腿肌接种等体积8个ELD50的NDRV017E3株（病毒含量为4.50×105/羽）,攻毒10 d后处死动物并采集脾脏组织。以脾脏是否坏死作为判断指标,发现母源抗体对雏鸭的保护率为53.3%,卵黄抗体对雏鸭的保护率为40%,与阳性对照组相比,母源抗体可有效降低雏鸭感染NDRV风险（P<0.05）,对雏鸭具有较好地保护作用;统计各组体重的增重情况,结果显示,与阴性对照组相比,阳性对照组雏鸭体重降低16%（P<0.05）,母源抗体组、卵黄抗体组分别降低4.57%（P>0.05）、9.43%（P>0.05）。结果表明,樱桃谷种鸭免疫该疫苗28 d后,50%以上的后代雏鸭可通过携带的母源抗体获得保护,优于市场上商品疫苗的免疫保护效果。
罗丹[2]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立》文中认为新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的以雏鸭肝脾出血或坏死为主要特征的免疫抑制病。自2017年以来,该病在我国养鸭主产省份及地区相继暴发,其发病率和死亡率迅速上升并持续扩散,给水禽养殖业造成严重经济损失。目前,NDRV分离株较少,关于其分子生物学特性及致病性方面的研究鲜有报道。为了丰富NDRV毒株资源库,本研究利用鸡胚传代方法从病鸭组织内成功分离到9株纯净性良好的NDRV毒株。研究表明,9株分离病毒均能100%致死鸡胚,且在Vero细胞中良好增殖;除SD19/6202外,其余8株分离病毒均能在鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中产生明显细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。进一步σC基因遗传演化分析显示,9株分离病毒与已报道中国NDRVs均位于水禽呼肠孤病毒基因2型分支,该分支可分为2个不同的亚群;其中,SD19/6201和7株分离病毒与其他38株已报道中国流行NDRVs遗传距离较近,位于Ⅰ亚群,具有一定的代表性;而SD19/6202与DE150/China和HN5d/China-HN/2013则位于II亚群,与大多数已报道的中国NDRVs遗传距离较远。σC氨基酸序列比对发现,CEF适应病毒代表株SD19/6201和CEF非适应病毒SD19/6202之间共存在13个氨基酸差异位点。将SD19/6201和SD19/6202感染1日龄雏鸭后,呈现与临床自然发病鸭相似的病症,发病鸭脾脏出血/坏死,病毒载量最高,而其他脏器则无明显病变,病毒载量较低,脾脏出血/坏死可以作为NDRV感染雏鸭的发病指标。为进一步了解NDRV的基因组特征,我们测定了复制特性存在明显差异的两株病毒（SD19/6201和SD19/6202）的全基因组序列,结果显示,2株病毒具有典型NDRV基因组结构特点,均属于水禽呼肠孤病毒基因2型。随后,我们对流行代表毒株SD19/6201的体外增殖特性进行研究,结果显示该毒株在细胞（Vero和CEF）和禽胚（鸡胚和鸭胚）中均可良好增殖,且对鸡胚和鸭胚呈高致死性。同时,我们建立了NDRV在14日龄和21日龄雏鸭上的感染模型,确定了NDRV在14日龄雏鸭上的推荐感染剂量为105.0ELD50/0.1 m L,21日龄雏鸭推荐感染剂量为106.0 ELD50/0.1 m L,推荐剖检时间均为感染后第7 d,此时脾脏病变比率均为80%（8/10）。NDRV流行株增殖特性的明确和动物感染模型的建立,为NDRV疫苗研发及免疫效果评价提供了理论基础。σB蛋白是NDRV外衣壳蛋白的主要成分,其携带群特异型中和抗原决定簇,能够诱导机体产生群特异性中和抗体,可作为靶蛋白制备诊断试剂。鉴于目前国内尚无商品化的NDRV ELISA抗体检测试剂盒,本研究以原核表达系统表达的NDRVσB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV ELISA抗体检测方法。该方法与其他外源病毒阳性血清均无交叉反应,特异性良好;与IFA相比,本研究建立的NDRV检测方法具有更高的敏感性;使用该方法与IFA共检测368份临床血清,两者符合率为99.40%;该方法的成功建立,为我国NDRV的流行病学调查以及疫苗的评价提供了有效的技术手段。
张旭杰[3]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用》文中研究指明近几年来,我国多个省份广泛流行由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的以脾脏坏死为主要特征的传染性疾病。NDRV感染会对雏鸭脾脏和其他免疫器官造成损害,抑制免疫系统,导致雏鸭对其他病原体易感性增强,诱发混合感染。该病毒可感染多个品种的雏鸭,日龄越小,发病率和死亡率越高。患病雏鸭临床常表现为精神倦怠、喜卧、拉稀、发育受阻、生长缓慢,饲料返还率大幅降低。本研究使用鸡胚肝细胞对实验室保存的新型鸭呼肠孤病毒SDYC株进行病毒扩增,获得大量抗原液后制备灭活疫苗免疫开产蛋鸡,收集卵黄样品制备新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体,为NDRV的预防和治疗提供支持和保障。新型鸭呼肠孤病毒SDYC株接种鸡胚肝细胞,病毒感染36h后收取细胞病毒液,离心后取上清液作为制备灭活疫苗的抗原液。对抗原液进行毒力效价、纯净度检测和动物回归试验,均符合疫苗制备要求。选择终浓度为0.2%甲醛溶液37°C灭活抗原液24h,灭活后与Tween-80按94:6的比例混合配制疫苗水相。无菌操作加入2份水相、3份油相乳化疫苗,制成油乳剂灭活疫苗。对疫苗的安全性、剂型、物理性状、储存条件进行检测,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。灭活疫苗免疫开产蛋鸡,连续免疫4次,每次免疫间隔14d,4次免疫后每隔1周收集蛋黄样品进行ELISA抗体效价检测。结果显示免疫蛋卵黄抗体水平不断升高,至第三周达到最大值后抗体水平逐渐下降。收取免疫蛋经蛋壳消毒、蛋黄分离、一次灭活、醋酸酸化、辛酸萃取、二次灭活、粗滤、除菌细滤、超滤浓缩、三次灭活、除菌细滤后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。对卵黄抗体的物理性状、p H值、安全性、抗体效价进行检测,均符合抗体生产标准。进行动物免疫保护试验检验新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体对雏鸭的保护效力,结果显示雏鸭注射抗体后机体抗体水平迅速升高,第4d左右机体抗体水平达到最高峰。雏鸭注射1.0 m L卵黄抗体后第21d检测血清抗体效价仍呈阳性,卵黄抗体持续保护时间完全覆盖雏鸭整个易感期,可大大降低新型鸭呼肠孤病毒对雏鸭的感染率。健康雏鸭人工感染新型鸭呼肠孤病毒后当天开始排毒,临床表现反应迟缓、喜卧、扎堆、饮食量下降。剖检发病雏鸭,脾脏坏死、肝脏出血症状明显。患病雏鸭注射卵黄抗体后,排毒雏鸭数量不断减少直至患病雏鸭不再排毒,精神状态良好,采食量、饮水量恢复正常。剖检雏鸭发现肝脏出血和脾脏坏死症状明显减轻,部分雏鸭恢复正常。综上所述,新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体制作流程简单、成本较低、安全性好、保护效果明显、治愈率高,可以有效用于预防和治疗鸭群爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染,对新型鸭呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。
田昂[4]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用》文中指出近年来,我国出现了一种以鸭脾脏坏死为特征的传染病,病鸭精神沉郁,出现软脚症状。该病发病日龄较小,病情发展迅速,引起脾脏坏死从而导致免疫力下降,容易造成其他病原微生物的继发感染,因此死亡率较高。新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus,NDRV）被认为是引起该病的病原。目前,确诊该病一般采用RT-PCR、荧光定量PCR等方法进行该病病原的快速检测,而间接酶联免疫吸附试验（Indirect Enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA）则可用于该病的大规模血清学调查。NDRV的σC蛋白是它的主要保护性抗原蛋白,本研究将原核表达的NDRVσC蛋白作为包被抗原,建立了检测NDRV血清抗体的iELISA方法,并对其进行了初步应用。本文研究内容分为以下两部分:第一部分:检测NDRV抗体iELISA方法的建立从脾脏坏死的鸭中分离得到一株NDRV,命名为SD19。设计引物,利用RT-PCR技术扩增编码σC蛋白的全基因,将扩增产物连接至p ET-32a（+）载体并在大肠杆菌BL21中表达。Western bolt分析后,将所表达的蛋白作为包被抗原建立检测鸭血清中NDRV抗体的iELISA方法。优化的最佳条件为:包被σC蛋白浓度5μg/m L 100μL/孔、包被时间4℃12h、37℃1.5h封闭、被检血清1:80稀释、血清孵育37℃1.5h、底物反应15min、临界值为0.34。用建立的iELISA检测方法对GPV、NGPV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3的单因子血清及NDRV阴阳性血清进行检测,结果发现除NDRV阳性血清以外其他血清检测数值均小于0.34,说明建立的检测NDRV血清抗体的iELISA方法特异性高,确定的临界值是合适的。对100份鸭血清分别用iELISA和Dot blot方法进行检测,结果发现两者的结果符合率为93%,说明建立的iELISA检测方法用来进行NDRV抗体的血清学调查是可行的。第二部分:运用建立的iELISA检测方法进行血清学调查运用建立的iELISA检测方法对来自山东和江苏两省20个场的1000份1-40日龄樱桃谷肉鸭血清进行NDRV抗体检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（20/20）,个体阳性率为53.3%（533/1000）;其中山东肉鸭个体阳性率为54%（270/500）,江苏肉鸭个体阳性率为52.6%（263/500）。1-10日龄、10-20日龄、20-30日龄和30-40日龄肉鸭个体阳性率分别为58%（145/250）、55%（165/300）、50.5%（101/200）和48.8%（122/250）。运用iELISA方法对来自山东和江苏两省10个场的500份14-61周龄父母代樱桃谷种母鸭的血清进行检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（10/10）,个体阳性率为60%（300/500）;其中山东父母代种母鸭个体阳性率为65.2%（163/250）,江苏父母代种母鸭个体阳性率为54.8%（137/250）。14-25周龄、26-35周龄、36-45周龄、46-61周龄父母代种母鸭个体阳性率分别为61%（122/200）、53%（53/100）、65%（65/100）、60%（60/100）。对江苏省某个祖代种鸭场种公鸭的检出阳性率为96%（48/50）。以上对樱桃谷鸭祖代种公鸭、父母代种母鸭和商品代肉鸭进行的血清学检测表明,NDRV在山东、江苏两省的鸭群中已普遍存在,对其感染必须引起高度重视。
谢碧林,林志敏,林彬彬,翁汉东,王秀祯[5]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒病研究进展》文中认为本文针对近年来新型鸭呼肠孤病毒病的研究报道,对该病的病原学、流行病学、病原学诊断、血清学诊断、防治措施及致病机制等方面进行总结,较全面地阐述该病的研究进展,为该病的深入研究和预防治疗提供参考。
李静[6]（2020）在《新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备》文中提出新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病,自2017年以来,发病率和死亡率相对较高,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从临床疑似样品中分离到NDRV,对分离株进行分离鉴定,构建病毒感染模型,制备油乳剂灭活疫苗,为NDRV的防控提供技术支持。本实验室在2017年2019年对来自山东、安徽等地送检的30份疑似患病样品进行RT-PCR检测,结果显示10份样品为阳性。对这10份阳性样品进行病毒分离,接种SPF鸡胚胚体明显出血,接种鸡胚肝细胞产生合胞体病变。分离株测序后对其进行同源性比对分析并绘制遗传进化树,同源性比对结果显示:10株分离株的同源性在97.4%99.4%之间,分离株与DRV经典毒株的同源性在94.6%96.5%之间,说明NDRV较DRV发生明显的变异。遗传进化树结果显示:分离株与水禽源呼肠孤病毒位于同一分支,说明NDRV与水禽源呼肠孤病毒的遗传关系相对较近。通过对分离株进行同源性比对及遗传进化树分析,SDYC株与DRV的同源性差异最大,并根据其致病性及免疫原性的分析,筛选出SDYC株作为疫苗株,对筛选株进行动物回归试验,通过腿部肌肉接种1日龄雏鸭,结果表明,接种0.2mL(TCD50为10-7.2)病毒液后雏鸭出现精神沉郁,食欲减退等临床症状,剖检可见脾脏出血、坏死,肝脏有坏死点等特征性病理变化。将SDYC株病毒液接种鸡胚肝细胞,病毒感染后48h72h收取细胞病毒液。本研究选用转瓶培养方式进行细胞培养和病毒增殖,该方法可快速扩增出大量的抗原液。选用甲醛将抗原液灭活后与吐温-80以94:6的比例混合制备疫苗水相。按照3:2的油水相比进行乳化,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。对该疫苗的理化性状,最佳免疫剂量,免疫保护效果及免疫后雏鸭血清中抗体水平变化进行检测。结果表明,最佳灭活条件为0.2%的甲醛溶液37°C灭活24h。疫苗的理化性状及安全性检测结果显示,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。对5日龄雏鸭颈部皮下注射1.0mL该灭活疫苗,未出现局部炎性反应及全身性不良反应,表明该疫苗安全性良好。免疫保护试验的结果显示该疫苗的最佳剂量为0.3mL/羽。ELISA OD450值达到0.508时,中和抗体水平达到24时,即可有效抵御NDRV的感染。攻毒保护试验中,非免疫组大部分样品检测结果为阳性,21d以内均检测到样品阳性,说明非免疫组雏鸭长期带毒且排毒。0.1mL免疫组也检测出部分阳性样品。0.3mL1.0mL免疫组仅检测出一个阳性样品,保护率在96%以上。综上所述,本研究制备的NDRV油乳剂灭活苗具有良好的免疫保护效果,能够有效抵抗NDRV的感染。
高斌[7]（2019）在《新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究》文中提出最近几年,在我国肉鸭养殖地区出现一种以脾脏坏死为特征的疾病,该病主要造成患鸭大群精神状态差,饮水、采食均出现下降并伴有死亡,脾脏坏死后机体免疫力下降容易继发感染造成更高的死亡率,耐过鸭发育受阻、生长缓慢,成为僵鸭。目前,大多数研究者认为新型鸭呼肠孤病毒（New type duck reovirus,NDRV）是造成该病的主要病原,针对该病发病日龄小、病情发展快、容易快速传播的特点,急需建立一种快速、精确、可靠的检测方法应用于该病早期定性与定量诊断。本研究从患鸭的坏死脾脏中分离到一株NDRV,对分离的毒株进行了序列分析及致病性研究。针对该病建立了TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并利用该方法对病毒在感染肉鸭不同组织器官中的分布、排毒规律及病毒血症情况进行了监测,为该病的防控提供了理论依据。根据NDRV S2基因序列设计一对引物和一条特异性探针,扩增长度85 bp。将扩增的片段连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、测序鉴定后,倍比稀释作为标准品,优化反应条件后构建标准曲线,建立检测NDRV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。该方法的标准曲线有良好的线性关系,线性回归方程为y=-3.3468x+41.681,相关系数R2为0.9988;敏感性良好,最小检出模板浓度为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;特异性良好,仅能检测NDRV,与其他病毒无交叉反应现象;批间和批内变异系数均在3%以下,重复性良好。以上试验表明,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高,特异性强、重复性好,可用于NDRV的临床检测。180只1日龄健康樱桃谷雏鸭随机分为3组,肌肉接种组、口服接种组和对照组各60只,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸭感染后的临床症状及剖检变化,每隔2d称重用来监测体重增长变化;采集各组泄殖腔棉拭子和抗凝血3份,检测肉鸭的排毒情况及病毒血症情况。于攻毒后12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d,每组随机抽取3只剖杀,将病变组织器官制备石蜡切片,观察其组织病理学变化,同时收取各组织进行病毒载量的测定。结果显示,试验组雏鸭均出现脾脏肿大、出血和坏死;试验组雏鸭体重增长缓慢,以口服接种组最为显着;棉拭子排毒规律结果显示,两组均在感染早期出现排毒;血液中病毒载量变化结果显示,两组均在感染早期检测到病毒存在,且含量变化与棉拭子排毒规律基本一致;组织病毒载量结果显示,人工感染SDYC株后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、十二指肠、胃、法氏囊、胸腺、脑中均能检测到病毒,两组病毒含量较高的器官为脾脏、胸腺和法氏囊,可作为检测该病的优选器官。1日龄健康罗斯308肉鸡和SPF鸡随机分为肌肉接种组、口服接种组和对照组,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸡感染后的临床症状及剖检变化。结果显示SPF雏鸡和肉鸡攻毒后肌肉接种组均出现精神沉郁和死亡,其中SPF雏鸡肌肉接种组死亡率高达100%,肉鸡肌肉接种组死亡率达到71.4%;口服接种组和对照组无明显变化。死亡雏鸡剖检病变大体一致,主要包括:腹腔有大量腹水;肝脏和脾脏肿大、出血、出现大面积坏死灶。说明NDRV在生产中有跨种传播感染鸡群的可能,要加强生物安全的防范。
梅敏敏[8]（2018）在《N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达》文中研究说明近年来在福建、广东、浙江等地皆有新致病型番鸭呼肠孤病毒（New pathotype of muscovy duck reovirus,N-MDRV）病的报道;该病俗称“番鸭新肝病”,主要剖检病变为肝脏不规则坏死、出血;患病鸭日龄愈小,病死率愈高,给养鸭业造成严重的经济损失。目前,有关广东省N-MDRV的致病性及遗传进化分析方面的研究较少。σB蛋白作为N-MDRV主要的外衣壳蛋白,有良好的免疫原性和反应原性。本研究旨在对广东省N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13流行毒株的致病性、全基因序列进行比较分析,同时对N-MDRV/DH13株σB蛋白的原核高效表达进行初步研究。本研究将N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均以104.00.00 ELD50的剂量经眼鼻、肌注、爪垫途径分别感染1日龄雏番鸭,N-MDRV/SH12攻毒组死亡率在10%20%之间,N-MDRV/DH13攻毒组死亡率均为30%。为进一步研究N-MDRV对雏番鸭和雏鸡的致病性差异,将N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株分别肌注感染1日龄雏番鸭和雏鸡。结果显示:2株病毒感染雏番鸭3 d后饮食能力下降,有轻微腹泻;感染7 d后临床症状明显,患病鸭剖检病变为肝脏大范围坏死、出血,脾脏肿大、坏死,法氏囊萎缩（N-MDRV/SH12组）或坏死出血（N-MDRV/DH13组）,N-MDRV/SH12组感染14 d后雏番鸭体重显着下降（P<0.01）。而N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏鸡,均不能致死,部分患病鸡感染3 d后饮食能力下降,被毛疏松,N-MDRV/SH12组感染14 d后雏鸡体重显着下降（P<0.05）;患病鸡剖检可见肝脏、脾脏病变类似于“番鸭新肝病”,但法氏囊眼观无明显病变。病理组织切片显示:雏番鸭感染7 d后,肝脏、脾脏、法氏囊坏死灶内有大量红细胞和单核细胞浸润,脾脏、法氏囊的淋巴细胞坏死、减少,感染后期脾脏可见肉芽肿结构。以上结果表明,N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏番鸭和雏鸡的致病性不同,但均可感染雏番鸭和雏鸡的肝脏、脾脏。为研究N-MDRV不同致病性毒株基因组结构特点及遗传进化关系,利用RT-PCR方法对N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株全基因组序列进行扩增和测序。结果显示:2株病毒间各基因片段核苷酸和氨基酸序列相似性较高,分别为97.1%99.8%和97.5%100.0%;与GenBank中N-MDRV、DRV、GRV参考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性亦较高,分别为86.3%99.6%和93.3%100%。σC蛋白基因序列相似性及遗传进化树的分析结果均显示,相邻地区的基因2型毒株其遗传关系更近。σA、σB、σNS、μA蛋白变异位点有一定规律性;有共同变异位点的病毒株,其蛋白基因序列相似性和遗传进化树分析的结果均显示,该类病毒株遗传关系更近。除μB蛋白基因外,其他9个蛋白基因片段序列相似性和遗传进化分析结果均显示,水禽源呼肠孤病毒间亲缘关系较近,与鸡源ARV亲缘关系较远;经SimPlot重组软件分析这可能是基因2型的μB蛋白基因片段来源于ARV和ARV-Md基因重组的结果。以上结果表明,N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均属于水禽呼肠孤病毒基因2型,且两者遗传演化关系较同分支的其他基因2型毒株更为相近。病毒株各蛋白氨基酸位点差异有可能会导致病毒致病性的不同。比较2株病毒和10株基因2型参考毒株各蛋白氨基酸变异位点及其潜在糖基化位点发现,除了λB蛋白外,其他蛋白的潜在糖基化位点因氨基酸位点变异有所变化;σNS蛋白109、270位点的变异使得N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株蛋白在pH 7.0时带不同电荷;2株病毒σC、σB蛋白单个氨基酸位点的变异对蛋白预测抗原表位几乎没有影响,但蛋白抗原表位不局限于疏水性。以上结果仅对N-MDRV各蛋白氨基酸位点进行了初步分析,其位点的变异是否与毒株致病性相关,还需得到毒株蛋白进一步验证。为探究N-MDRV中与致病性相关的σB蛋白原核高效表达,本研究选择优化致病性较强的N-MDRV/DH13σB蛋白基因密码子,构建的pET-32a（+）-σB-BL21（DE3）原核表达重组菌经IPTG诱导后表达出σB蛋白。在最佳的诱导条件下获得σB蛋白的表达量占细菌总蛋白量的32.3%,经SDS-PAGE分析发现σB重组蛋白主要以包涵体形式存在。再经Ni2+柱纯化获得高纯度可溶性的σB蛋白,Western blotting分析显示该蛋白具良好的反应原性。本研究为N-MDRVσB蛋白基因疫苗、诊断试剂盒的研制奠定基础。
张秉乾,刁有祥,于相龙,张欣,窦砚国[9]（2017）在《一株鹅源呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究》文中研究说明【目的】从疑似感染鹅呼肠孤病毒的病料中分离鉴定一株鹅源呼肠孤病毒JS-01,并对病毒分离株的致病性进行初步研究,为开展该病毒的进一步研究奠定基础。【方法】取病死鹅的肝、脾组织冻融3次后充分匀浆,8 000r/min离心15min取上清,接种10日龄鹅胚的卵黄囊,收集24144h死亡的鹅胚尿囊液,并提取病毒RNA。根据鹅呼肠孤病毒基因的保守序列设计特异性引物,利用该引物对所提取的病毒RNA进行RT-PCR,回收后与pMD18-T载体连接,将重组载体转化到DH5α大肠杆菌并在AMP+/LB培养基中培养,对阳性菌落测序,对测得的序列进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制系统遗传进化树。【结果】分离病毒JS-01的RT-PCR显示,其基因序列长度380bp,为鹅呼肠孤病毒σC基因片段;系统遗传进化分析表明,分离株JS-01与水禽源呼肠孤病毒处于同一分支,同源性为94.8%96.5%,而与鸡呼肠孤病毒的同源性仅为40.6%52.2%;在雏鹅上进行的动物回归试验表明,病毒JS-01可使雏鹅肝、脾、肾等器官发生病变。【结论】分离毒株为鹅呼肠孤病毒,该分离株对雏鹅有一定致病性,应注意本病的防控。
梁国智[10]（2017）在《NDRV可视化RT-LAMP及其核酸试纸条检测方法建立与初步应用》文中进行了进一步梳理新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）病为一种新发疫病,其病变特征主要表现为肝脏不规则坏死、斑块状出血和心肌、法氏囊出血等。该病发病率和病死率虽然差别较大,但患病鸭日龄愈小,发病率、病死率愈高。自2005年以来,该病由福建、广东及浙江等地向其它地域蔓延并传播迅速,导致养鸭业的经济发展严重受损。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型核酸扩增技术,该技术主要利用靶序列68个特定位点获得46种特异性引物,在Bst聚合酶参与及固定温度下,一般在3060 min内就能结束链置换扩增反应。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术在LAMP技术基础上加入反转录酶,一步完成全部反应。该技术具有强特异性、高敏感性、快速及所需仪器设备简单等优点。本论文针对NDRV检测技术进展及临床检测需要,以NDRV-QY为研究对象,根据GenBank中注册的NDRVσB蛋白基因序列,采用LAMP在线引物设计软件及Primer–BLAST、Oligo 7.0和Larsergene 7.0 PrimerSelect进行引物设计及筛选。采用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得σB蛋白基因序列,连接PMD18-T载体,成功构建重组阳性质粒,并测序得到全长1 104 bp。结合本研究设计的6种特异性引物,将RT-LAMP技术同钙黄绿素相结合,建立了NDRV可视化RT-LAMP快速检测方法,并对反应条件进行优化;同时,将RT-LAMP技术与核酸试纸条技术相结合,建立了NDRV RT-LAMP核酸试纸条快速检测方法。并采用两种方法对疑似新型鸭呼肠孤病临床病料进行检测。研究结果表明,所建两种RT-LAMP检测方法特异性强,且能在65℃条件下50 min内完成反应,能最低检测出200 fg的NDRV RNA及阳性质粒,比传统RT-PCR敏感100倍。对15份临床疑似混合病料的检测中,新建的两种检测方法与RT-PCR阳性检测率相同。对12份临床疑似病料进行检测中,新建的两种方法阳性检测率高于RT-PCR。对健康雏番鸭进行NDRV尿囊液攻毒后检测,结果显示两种RT-LAMP快速检测方法比常规RT-PCR方法的阳性检出率高10.71%,能从腹腔攻毒48 h后小鸭粪便中检测出NDRV。本研究针对NDRV建立的RT-LAMP钙黄绿素可视化方法及其核酸试纸条方法具有比常规RT-PCR方法更加特异敏感、快速简便等优势,为新型鸭呼肠孤病的早期诊断及疫情监测提供重要技术支持,适合于基层及现场的推广使用。
二、雏半番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、雏半番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究（论文提纲范文）
| 符号及缩略词说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 呼肠孤病毒发展 |
| 1.2 DRV的病原学特点 |
| 1.2.1 形态和结构 |
| 1.2.2 宿主 |
| 1.2.3 理化特性及血凝性 |
| 1.3 DRV的致病性 |
| 1.3.1 流行病学特点及临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 DRV的诊断 |
| 1.4.1 分离与鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学鉴定 |
| 1.4.3 血清学诊断 |
| 1.5 呼肠孤病毒病防控的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 其他生物制品 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料背景 |
| 2.1.2 试验用胚、试验动物 |
| 2.1.3 试验毒株 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的合成 |
| 2.2.2 分离与鉴定 |
| 2.2.3 RT-PCR检测及测序分析 |
| 2.2.4 生物学及理化特性研究 |
| 2.2.5 一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.6 灭活疫苗的研制 |
| 2.2.7 灭活疫苗的检验 |
| 2.2.8 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测 |
| 2.2.9 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 测序结果与分析 |
| 3.1.4 生物学及理化特性鉴定结果 |
| 3.1.5 一步生长曲线的绘制 |
| 3.2 灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 病毒液的制备 |
| 3.2.2 病毒液的纯净性检验 |
| 3.2.3 病毒含量(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.4 疫苗的制备 |
| 3.2.5 灭活疫苗的检验 |
| 3.3 疫苗的免疫原性探究 |
| 3.3.1 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测结果 |
| 3.3.2 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 灭活疫苗的免疫原性探究 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新型鸭呼肠孤病毒的病原学 |
| 1.1.1 NDRV的形态结构 |
| 1.1.2 NDRV的理化特性 |
| 1.2 新型鸭呼肠孤病毒的分子生物学特性 |
| 1.3 新型鸭呼肠孤病毒的流行病学 |
| 1.3.1 NDRV的流行情况 |
| 1.3.2 NDRV的致病性 |
| 1.4 新型鸭呼肠孤病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 病毒分离鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 |
| 1.4.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 新型鸭呼肠孤病毒的生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、鸡胚及实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 临床样品检测 |
| 2.2.2.1 临床病料及处理 |
| 2.2.2.2 样品RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.2.3 PCR |
| 2.2.3 NDRV的分离鉴定 |
| 2.2.3.1 NDRV的分离培养与传代 |
| 2.2.3.2 NDRV分离株的电镜观察 |
| 2.2.3.3 NDRV分离株的外源病毒检测 |
| 2.2.3.4 NDRV分离株的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.3.5 NDRV分离株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.2.3.6 动物回归实验 |
| 2.2.4 NDRV全基因组序列的扩增与遗传进化分析 |
| 2.2.5 NDRV流行株体外复制动力学研究 |
| 2.2.6 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定 |
| 2.2.7 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.2.7.1 试验分组与设计 |
| 2.2.7.2 脾脏指数统计 |
| 2.2.7.3 脾脏组织病理学观察 |
| 2.2.7.4 脾脏组织病毒载量检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDRV临床样品的检测结果 |
| 2.3.2 NDRV的分离鉴定结果 |
| 2.3.2.1 分离毒株鸡胚传代及细胞病变观察 |
| 2.3.2.2 分离毒株的电镜观察 |
| 2.3.2.3 分离毒株的外源病毒检测 |
| 2.3.2.4 分离毒株的IFA鉴定结果 |
| 2.3.2.5 分离毒株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.3.2.6 动物回归实验结果 |
| 2.3.3 NDRV全基因组序列及分析 |
| 2.3.4 NDRV流行株体外复制动力学研究结果 |
| 2.3.5 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定结果 |
| 2.3.6 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.3.6.1 临床症状与剖检结果 |
| 2.3.6.2 脾脏指数 |
| 2.3.6.3 脾脏组织病理变化结果 |
| 2.3.6.4 脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 NDRV的分离鉴定 |
| 2.4.2 SD19/6201 和SD19/6202 基因组特征及遗传进化特点 |
| 2.4.3 SD19/6201 增殖特性及动物感染模型建立 |
| 第三章 新型鸭呼肠孤病毒ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与血清 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.2.1.1 引物设计与合成 |
| 3.2.1.2 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.2.1.3 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.2.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.2.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间试验 |
| 3.2.2.2 最佳封闭液和封闭时间试验 |
| 3.2.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.5 最佳底物反应条件试验 |
| 3.2.2.6 临界值确定试验 |
| 3.2.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.2.4 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 3.2.5 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 3.2.6 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 3.2.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.1.1 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.3.1.2 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.3.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.3.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间的确定 |
| 3.3.2.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.5 最佳底物反应条件的确定 |
| 3.3.2.6 间接ELISA反应程序的确定 |
| 3.3.2.7 临界值的确定 |
| 3.3.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.3.4 间接ELISA方法的特异性试验结果 |
| 3.3.5 间接ELISA方法的敏感性试验结果 |
| 3.3.6 间接ELISA方法的重复性试验结果 |
| 3.3.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒灭活疫苗 |
| 1.6 禽蛋的一般特性 |
| 1.6.1 卵黄的结构和组成 |
| 1.6.2 卵黄的乳化性 |
| 1.7 卵黄抗体 |
| 1.7.1 卵黄抗体技术发展简史 |
| 1.7.2 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的优势 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 细胞及雏鸭 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒的扩增与检测 |
| 2.2.2 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒灭活条件研究 |
| 2.2.2.2 油相的制备 |
| 2.2.2.3 水相的制备 |
| 2.2.2.4 乳化 |
| 2.2.3 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.2.3.1 剂型检验 |
| 2.2.3.2 离心稳定性检验 |
| 2.2.3.3 无菌检验 |
| 2.2.3.4 粘度检验 |
| 2.2.3.5 保存期检验 |
| 2.2.3.6 疫苗安全性检验 |
| 2.2.3.7 灭活疫苗对蛋鸡的免疫程序 |
| 2.2.3.8 ELISA抗体测定 |
| 2.3 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.1 卵黄抗体制造 |
| 2.3.2 卵黄抗体效价测定 |
| 2.3.3 卵黄抗体性状检验 |
| 2.3.4 卵黄抗体pH值检测 |
| 2.3.5 无菌检验和安全实验 |
| 2.3.5.1 无菌检验 |
| 2.3.5.2 安全检验 |
| 2.4 雏鸭免疫保护试验 |
| 2.4.1 雏鸭卵黄抗体保护试验 |
| 2.4.2 雏鸭卵黄抗体治疗试验 |
| 2.4.3 卵黄抗体消长规律试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒扩增与检测结果 |
| 3.1.1 病毒扩增结果 |
| 3.1.2 扩增病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.3 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 3.1.4 新型鸭呼肠孤病毒动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 确定抗原液最佳灭活条件 |
| 3.2.2 灭活疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 灭活疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 灭活疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 灭活疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 灭活疫苗无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 灭活疫苗安全性检验 |
| 3.2.2.7 免疫蛋卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.8 卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.9 卵黄抗体物理性状检验结果 |
| 3.2.2.10 卵黄抗体p H值检测结果 |
| 3.2.2.11 卵黄抗体无菌检验结果 |
| 3.2.2.12 卵黄抗体安全性检验结果 |
| 3.2.2.13 雏鸭卵黄抗体保护效果 |
| 3.2.2.14 雏鸭卵黄抗体治疗试验结果 |
| 3.2.2.15 抗体消长规律结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新型鸭呼肠孤病毒 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 卵黄抗体的制备 |
| 4.4 新型鸭呼肠孤卵黄抗体的保护效力检验 |
| 4.5 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒的研究进展与国内外现状 |
| 1.2 病原学特征与分子生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床特征 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 致病机理 |
| 1.7 诊断与防治 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒及血清 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 菌株、质粒及抗生素 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 引物设计及序列分析 |
| 2.1.7 试剂及溶液的配制 |
| 2.7.1.1 琼脂糖凝胶及TAE电泳液的配制 |
| 2.1.7.2 LB培养基的配制及固体平板的制备 |
| 2.1.7.3 IPTG诱导剂的配制 |
| 2.1.7.4 氨苄青霉素溶液的配制及Ca Cl2 的配制 |
| 2.1.7.5 包涵体分离纯化试剂 |
| 2.1.7.6 Western Blot及 SDS-PAGE试剂配制 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒培养增殖 |
| 2.2.2 NDRV在 DF1 细胞上的增值及IFA(间接免疫荧光)实验 |
| 2.2.3 新型鸭呼肠孤病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.2.4 新型鸭呼肠孤病毒σC片段的扩增 |
| 2.2.5 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 PCR产物(σC片段)的回收与p MD18-T载体的连接 |
| 2.2.7 质粒的转化与阳性克隆的筛选 |
| 2.2.8 重组质粒DNA(pMD18-T-σC)的提取与酶切验证 |
| 2.2.9 测序 |
| 2.2.10 双酶切 |
| 2.2.11 连接 |
| 2.2.12 BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.13 转化 |
| 2.2.14 重组表达载体的酶切鉴定 |
| 2.2.15 蛋白表达、提取及包涵体纯化 |
| 2.2.16 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot |
| 2.2.17 iELISA检测方法的初步建立 |
| 2.2.17.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 2.2.17.2 最佳包被时间的确立 |
| 2.2.17.3 最佳封闭时间的确立 |
| 2.2.17.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 2.2.17.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 2.2.17.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 2.2.17.7 临界值的确定 |
| 2.2.17.8 特异性试验 |
| 2.2.18 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.19 iELISA检测方法的测评 |
| 2.2.20 血清学调查 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 NDRV在 DF1 细胞上的增殖及IFA |
| 3.2 RT-PCR的结果分析及测序分析 |
| 3.3 重组质粒pMD18-T-σC酶切验证 |
| 3.4 重组表达载体p ET32a(+) -σC酶切验证 |
| 3.5 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot的结果分析 |
| 3.6 iELISA检测方法建立及条件优化结果分析 |
| 3.6.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 3.6.2 最佳包被时间的确立 |
| 3.6.3 最佳封闭时间的确立 |
| 3.6.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 3.6.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 3.6.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 3.6.7 临界值的确定 |
| 3.6.8 特异性试验 |
| 3.7 iELISA检测方法测评结果分析 |
| 3.8 血清学调查 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）新型鸭呼肠孤病毒病研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 1.1 病原特性 |
| 1.2 理化特性 |
| 1.3 致病性 |
| 2 流行病学 |
| 3 病原学诊断 |
| 3.1 RT-PCR方法 |
| 3.2 多重RT-PCR方法 |
| 3.3 荧光定量RT-PCR方法 |
| 3.4 环介导等温扩增技术 |
| 4 血清学诊断 |
| 5 防治措施 |
| 5.1 灭活疫苗 |
| 5.2 重组载体疫苗 |
| 5.3 重组亚单位疫苗 |
| 6 致病机制 |
| 7 小结与展望 |
（6）新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 鸭呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.1.1 琼脂扩散试验 |
| 1.4.1.2 中和试验 |
| 1.4.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.4.2.1 核酸探针技术 |
| 1.4.2.2 PCR技术 |
| 1.4.2.3 荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.4.2.4 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗的研究 |
| 1.5.2 灭活疫苗的研究 |
| 1.5.3 基因工程疫苗的研究 |
| 1.6 预防与治疗 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 用胚及动物 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.1.6.1 电泳试剂 |
| 2.1.6.2 ELISA试剂 |
| 2.1.6.3 其他试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计合成 |
| 2.2.1.2 病毒的分离与传代 |
| 2.2.1.3 血凝试验 |
| 2.2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化 |
| 2.2.1.7 连接与转化 |
| 2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 病毒纯净度检测 |
| 2.2.1.10 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.2.1.11 动物回归试验 |
| 2.3 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.3.1 细胞在转瓶中的培养 |
| 2.3.2 转瓶的清洗及消毒 |
| 2.3.3 种毒增殖 |
| 2.3.4 鸭呼肠孤病毒灭活工艺的研究 |
| 2.3.4.1 抗原液最佳灭活条件的筛选 |
| 2.3.5 疫苗制备 |
| 2.3.5.1 油相的制备 |
| 2.3.5.2 水相的制备 |
| 2.3.5.3 乳化 |
| 2.3.6 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.3.6.1 剂型检验 |
| 2.3.6.2 离心稳定性检验 |
| 2.3.6.3 粘度检验 |
| 2.3.6.4 无菌检验 |
| 2.3.6.5 保存期检验 |
| 2.3.6.6 疫苗安全性检验 |
| 2.3.7 最佳免疫剂量研究 |
| 2.3.8 免疫后抗体水平的监测 |
| 2.3.8.1 ELISA抗体测定 |
| 2.3.8.2 中和抗体测定 |
| 2.3.9 攻毒保护试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 血凝性结果 |
| 3.1.3 RT-PCR的检测结果 |
| 3.1.4 测序结果与分析 |
| 3.1.5 病毒的纯净性检测 |
| 3.1.6 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 抗原液最佳灭活条件筛选 |
| 3.2.2 疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 安全性检验 |
| 3.2.3 最佳免疫剂量的确定 |
| 3.2.3.1 间接ELISA抗体检测结果 |
| 3.2.3.2 中和抗体的检测结果 |
| 3.2.4 攻毒保护试验 |
| 3.2.4.1 免疫保护性试验结果 |
| 3.2.4.2 攻毒后排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 疫苗的保护效力检验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒病原学概述 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒的历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特征 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的基因组和主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 病原的分离与鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| 1.5 荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5.1 实时荧光定量PCR技术原理 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR技术的分类 |
| 1.5.2.1 DNA染料法 |
| 1.5.2.2 探针法 |
| 1.5.3 实时荧光定量PCR技术定量方法 |
| 1.5.4 荧光定量PCR检测方法的应用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 试验用胚及动物 |
| 2.1.3 试验种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验主要溶液及培养基的配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.2 病料样品的处理 |
| 2.2.1.3 病毒的分离与传代 |
| 2.2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化 |
| 2.2.1.7 连接与转化 |
| 2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 病毒纯净度检测 |
| 2.2.1.10 血凝试验 |
| 2.2.1.11 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.2.1.12 动物回归试验 |
| 2.2.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.2.1 引物、探针设计及合成 |
| 2.2.2.2 SDYC株病毒液总RNA的提取 |
| 2.2.2.3 目的基因的扩增及克隆测序 |
| 2.2.2.4 阳性质粒标准品的制备及鉴定 |
| 2.2.2.5 TaqMan探针荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2.2.6 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.2.7 特异性试验 |
| 2.2.2.8 敏感性试验 |
| 2.2.2.9 重复性试验 |
| 2.2.2.10 临床样本的检测 |
| 2.2.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究 |
| 2.2.3.1 种毒的增殖 |
| 2.2.3.2 试验分组与攻毒 |
| 2.2.3.3 攻毒后的体重变化 |
| 2.2.3.4 病理组织切片的制备和观察 |
| 2.2.3.5 攻毒后血液中排毒规律的测定 |
| 2.2.3.6 攻毒后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定 |
| 2.2.3.7 攻毒后各组织器官中病毒载量的变化 |
| 2.2.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡的致病性研究 |
| 2.2.5 鸭新型呼肠孤病毒对罗斯308 肉鸡的致病性研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭新型呼肠孤病毒分离与鉴定结果 |
| 3.1.1 呼肠孤病毒分离情况 |
| 3.1.2 呼肠孤病毒σC基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.3 NDRVσC基因遗传进化分析 |
| 3.1.4 病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.5 病毒的血凝试验结果 |
| 3.1.6 病毒毒力(TCID50)的测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立结果 |
| 3.2.1 NDRV-S2 基因扩增结果 |
| 3.2.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 3.2.3 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3.2.5 特异性试验结果 |
| 3.2.6 敏感性试验结果 |
| 3.2.7 重复性试验结果 |
| 3.2.8 临床样本检测结果 |
| 3.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究 |
| 3.3.1 人工感染肉鸭后的临床症状 |
| 3.3.2 人工感染肉鸭后的剖检变化 |
| 3.3.3 人工感染肉鸭后的体重变化 |
| 3.3.4 人工感染肉鸭后病理组织学变化 |
| 3.3.5 人工感染肉鸭后血液中排毒规律的测定 |
| 3.3.6 人工感染肉鸭后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定 |
| 3.3.7 人工感染肉鸭后各组织器官中病毒载量的变化情况 |
| 3.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡的致病性研究 |
| 3.5 鸭新型呼肠孤病毒对罗斯308 肉鸡的致病性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定分析 |
| 4.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立分析 |
| 4.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究分析 |
| 4.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡以及罗斯308 肉鸡的致病性研究分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文常用缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 水禽源呼肠孤病毒病介绍 |
| 1.1.1 番鸭“白点病” |
| 1.1.2 番鸭“新肝病” |
| 1.1.3 北京鸭“脾坏死病” |
| 1.1.4 鹅“白点病” |
| 1.1.5 鹅“出血性坏死性肝炎” |
| 1.2 N-MDRV病原的研究进展 |
| 1.2.1 病原分类地位的探讨 |
| 1.2.2 N-MDRV的生物学特性 |
| 1.2.3 N-MDRV的基因组蛋白的结构与功能 |
| 1.3 水禽源呼肠孤病毒σB蛋白的研究 |
| 1.4 N-MDRV病的防控 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、禽胚、雏禽、质粒及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性的研究 |
| 2.2.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列测定及分析 |
| 2.2.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白原核表达的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性研究结果 |
| 3.1.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株的鉴定 |
| 3.1.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株鸭胚半数致死量的测定 |
| 3.1.3 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏番鸭和雏鸡致病性结果 |
| 3.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列的测定及分析结果 |
| 3.2.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株各段基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株基因组结构分析 |
| 3.2.3 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株序列分析 |
| 3.2.4 2株病毒基因组系统进化及重组分析 |
| 3.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白基因密码子优化研究的结果 |
| 3.3.1 优化σB蛋白基因序列及合成鉴定 |
| 3.3.2 σB蛋白基因原核表达质粒的鉴定 |
| 3.3.3 σB重组蛋白诱导表达条件的优化及可溶性分析 |
| 3.3.4 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性研究 |
| 4.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列分析 |
| 4.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白基因密码子优化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和录用的论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）一株鹅源呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 病料 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 病毒的分离 |
| 1.6 病毒分离株半数致死量的测定 |
| 1.7 病毒的理化特性 |
| 1.7.1 耐酸性试验 |
| 1.7.2 耐热性试验 |
| 1.7.3 乙醚敏感试验 |
| 1.7.4 氯仿敏感试验 |
| 1.7.5 胰蛋白酶敏感试验 |
| 1.7.6 病毒的血凝性 |
| 1.8 病毒RNA提取 |
| 1.9 PCR扩增和测序 |
| 1.10动物回归试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 呼肠孤病毒分离株的分离 |
| 2.2 呼肠孤病毒分离株的半数致死量测定 |
| 2.3 呼肠孤病毒分离株的理化特性 |
| 2.4 呼肠孤病毒分离株的鉴定 |
| 2.5 呼肠孤病毒分离株的序列测定与分析 |
| 2.6 动物回归试验 |
| 3 讨论 |
（10）NDRV可视化RT-LAMP及其核酸试纸条检测方法建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文常用缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 新型鸭呼肠孤病毒的研究进展 |
| 1.1.1 病原学特点 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 病理表现 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 LAMP技术研究进展 |
| 1.2.1 RT-LAMP技术的概述 |
| 1.2.2 RT-LAMP技术原理 |
| 1.2.3 RT-LAMP产物的检测方法 |
| 1.2.4 RT-LAMP技术优点 |
| 1.2.5 RT-LAMP检测技术的应用 |
| 1.3 核酸试纸条技术研究进展 |
| 1.3.1 核酸试纸条检测原理 |
| 1.3.2 核酸试纸条技术的优点 |
| 1.3.3 核酸试纸条技术的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与筛选 |
| 2.2.2 NDRV阳性质粒的构建 |
| 2.2.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的建立 |
| 2.2.4 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的建立 |
| 2.2.5 可视化RT-LAMP及核酸试纸条检测方法临床应用研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 引物设计和筛选 |
| 3.1.1 引物保守性 |
| 3.1.2 引物特异性 |
| 3.1.3 引物的比对及筛选 |
| 3.1.4 NDRV RT-LAMP反应的最佳引物 |
| 3.2 NDRV阳性质粒构建结果及分析 |
| 3.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的建立及分析 |
| 3.3.1 NDRV RT-LAMP反应条件的优化 |
| 3.3.2 NDRV RT-LAMP反应体系优化 |
| 3.3.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP反应最佳反应体系和反应条件 |
| 3.3.4 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法产物的酶切鉴定 |
| 3.3.5 NDRV RT-LAMP方法的特异性分析 |
| 3.3.6 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的敏感性测定及对比分析 |
| 3.4 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的建立及分析 |
| 3.4.1 建立NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法反应体系和反应条件 |
| 3.4.2 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的敏感性分析 |
| 3.5 两种NDRV RT-LAMP检测方法的临床应用研究结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的诊断方法应用现状 |
| 4.2 两种RT-LAMP检测方法的特点及评价 |
| 4.3 靶基因的选择 |
| 4.4 RT-LAMP引物的设计及筛选 |
| 4.5 RT-LAMP反应条件的优化 |
| 4.5.1 反应温度 |
| 4.5.2 反应时间 |
| 4.5.3 钙黄绿素和锰离子比例优化 |
| 4.5.4 Mg~(2+)浓度优化 |
| 4.5.5 甜菜碱浓度优化 |
| 4.5.6 dNTPs浓度优化 |
| 4.5.7 Bst DNA聚合酶浓度优化 |
| 4.5.8 环引物 |
| 4.5.9 内外引物比例的优化 |
| 4.6 RT-LAMP特异性分析 |
| 4.7 RT-LAMP方法的灵敏度分析 |
| 4.8 两种RT-LAMP检测方法的临床应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和录用的论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、雏半番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究[D]. 孔桂慧. 山东农业大学, 2021
- [2]新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 罗丹. 中国农业科学院, 2021
- [3]新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用[D]. 张旭杰. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 田昂. 山东农业大学, 2021
- [5]新型鸭呼肠孤病毒病研究进展[J]. 谢碧林,林志敏,林彬彬,翁汉东,王秀祯. 福建畜牧兽医, 2021(01)
- [6]新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备[D]. 李静. 山东农业大学, 2020(12)
- [7]新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究[D]. 高斌. 山东农业大学, 2019(01)
- [8]N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达[D]. 梅敏敏. 佛山科学技术学院, 2018(03)
- [9]一株鹅源呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究[J]. 张秉乾,刁有祥,于相龙,张欣,窦砚国. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2017(08)
- [10]NDRV可视化RT-LAMP及其核酸试纸条检测方法建立与初步应用[D]. 梁国智. 佛山科学技术学院, 2017(01)