一、HCV体外感染正常成人肝细胞的初步研究（论文文献综述）
袁伦志[1]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
郑金伟[2]（2019）在《MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索》文中研究说明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的慢性感染仍是危害人类健康的公共卫生问题之一,尽管预防性疫苗的普及显着减少了乙型肝炎病毒新发感染,但目前全球仍有超过2.57亿慢性HBV感染者需要及时有效的治疗。由于目前现有的治疗策略只能控制病毒的复制而难以完全治愈慢乙肝,因此开发更为有效的新型药物是迫切而必要的。新药的研发有赖于对HBV生物学和HBV与宿主相互作用的深入认识,这些研究的实施都需要能模拟HBV完整生命周期的体外细胞模型和体内动物模型的构建和发展。其中细胞模型是最常用且方便的用于体外研究HBV的感染和复制、HBV与宿主之间的相互作用、筛选和评价抗HBV药物的重要平台。本团队之前构建了两株细胞模型:HepG2-N10和HepG2-hNTCP（2B1）。其中HepG2-N10是在HepG2细胞中稳定整合了1.1倍体A基因型的HBV基因组,可以支持HBV复制和用于药物筛选和评价。另外HepG2-hNTCP（2B1）可以支持HBV感染和cccDNA形成,但是感染所需病毒剂量高且感染阳性率低,仅为20%～30%,同时感染时依赖PEG。本研究对MAPK抑制剂库进行筛选,旨在优化HepG2-hNTCP细胞感染模型,提高其感染效率和摆脱PEG的约束。同时寻找限制鼠肝细胞不能支持HBV感染的因子,进而构建支持HBV感染且免疫功能健全的小鼠模型。本研究同时在复制模型HepG2-N10和感染模型HepG2-hNTCP上对140种MAPK抑制剂进行筛选,结果发现两种模型得到的结果差异显着。同时进行抗原水平相关性分析没有发现两种模型得到的结果有明显相关性。感染模型可以支持HBV感染,其病毒以类似自然感染状态进行复制,更符合HBV的生理。因此,可以说明复制模型用于药物筛选和评价的结果需要进一步验证。本研究在2B1细胞模型中对140种MAPK抑制剂进行初步筛选,结果发现了30种MAPK抑制剂在感染后第六天加药处理能够增强HBV复制。进一步分析这30种MAPK抑制剂在感染前加入并持续添加对HBV感染的影响,结果显示有12种促进HBV感染效果显着。同时仅在感染前处理24小时,发现SCH772984,Trametinib,PD184352和Cobimetinib这四种MAPK抑制剂就能非常显着的提升HBV感染水平,其中HBeAg均提高了5倍以上,HBsAg均提高了10倍以上。此外,本研究对这些MAPK抑制剂促进HBV感染的机制进行了初步探索。根据是否上调NTCP表达可将这些MAPK抑制剂分为NTCP途径依赖型和非NTCP依赖型。B-Raf IN1为NTCP途径依赖型的MAPK抑制剂,可以增强HBV的感染,特别是对cccDNA。对B-Raf IN1处理后的2B1细胞进行转录组测序,结果显示B-Raf IN1可增强NTCP的表达,另外与HBV感染和复制相关的宿主基因也有不同程度提高。目前己对上调的JunB基因进行了验证,发现过表达JunB可增强HBV在2B1细胞中的感染以及敲低后抑制HBV的感染,因此可以推出B-Raf IN1促进HBV感染与增强JunB的表达有关。但是JunB本身是一种转录因子,并不能直接作用于HBV。因此仍需寻找与HBV感染更关键的因子。其他与HBV感染相关的宿主基因仍在验证当中。此外,针对非NTCP依赖型的MAPK抑制剂,我们首先猜想是否2B1细胞表面存在其他能与HBV结合的受体。因此,我们进行了 HBsAg结合实验,结果显示B-Raf IN-1d,Pimasertib,Selumetinib,PD0325901,SCH772984,Trametinib,TAK632和Cobimetinib能够明显增强HBsAg阳性率,说明这些MAPK抑制剂诱导了细胞表面某种能与HBsAg结合的蛋白,从而促进HBV的感染。进一步我们筛选了其中几个进行转录组测序,涉及HBV感染相关的宿主基因正在验证中。综述所述,本研究在HepG2-hNTCP细胞模型中筛选出了几种能显着促进HBV感染了MAPK抑制剂并对其作用机制进行了初步探索。为构建更优的体外细胞感染模型提供了可能。
王明风[3]（2019）在《构建乙肝病毒体外复制的荧光报告系统的探索》文中提出乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）是一种带有包膜的DNA病毒,有嗜肝性,可以造成人类持续性病毒感染。慢性HBV感染是世界范围内最为严重的公共卫生问题之一,是导致肝硬化和原发性肝细胞癌的主要原因。尽管目前已有预防性疫苗可有效预防新发HBV感染,但在全世界范围内仍有约2.48亿慢性HBV感染者,且难以被现有治疗手段治愈。现有基于干扰素类和核苷/核苷酸类似物及其组合的临床治疗策略虽能控制病毒复制,缓解疾病进展,但并不能有效实现临床治愈（通常<5%）,停药后还存在复发的风险。大量研究表明作为HBV复制模板的cccDNA的持续存在是乙肝感染难以治愈的根本,而我们现有的药物并不能对cccDNA进行有效的清除,发展更为有效的治疗药物迫在眉睫。因此构建一个为高通量药物筛选服务的能快速检测或者指征HBV复制的体外细胞模型是很有必要的。本研究我们的目的就是试图构建一个用荧光来指示HBV复制的细胞模型,不需要任何额外的检测,只需通过荧光的变化来判断药物的作用。首先,为了尽可能小的对HBV本身产生影响,且考虑到HBV基因组表达框的高度重叠性,我们插入HBV基因组precore区的片段是仅有16个氨基酸的GFP11,但荧光和HBV的复制都受到了较大程度的削弱;接着我们对该系统的荧光进行了优化,有报道split mNG系统有更强的荧光信号,更低的背景荧光,即更高的信噪比,于是我们对split GFP和split mNG系统进行了比较,并将split mNG作为后续改进的基础;考虑到多质粒转染的低效性,我们构建了Dox诱导型的“all in one”的荧光报告系统,在初步验证该系统的可行性后,我们对该系统的荧光和HBV复制效率进行了探索优化;在荧光方面,通过对不同N1l变体和不同数量N11串联的比较,以及用于多顺反子表达的2A自剪切肽和22-nt Rbm3 IRSE的比较,发现DN11-E2A的组合方式相对较佳;在HBV复制效率方面,通过将A1901G型突变（CM型）配对换成A1852T/T1902A型突变（XM型）配对,发现在XM型情况下插入外源基因对HBV复制效率影响较小;另外,我们构建了稳定整合细胞株,在细胞株上对该系统进行了初步的荧光与HBV复制相关性的分析;最后我们对不同基因型的34个HBV（主要是B、C、D型）做了比较,找到了比我们现用的C型S11复制水平和感染能力高的HBV-D型的Dtw;并在Dtw骨架上对荧光报告系统中外源基因插入位点对HBV复制的影响做了初步的研究,发现插入位点在距HBV poly（A）序列中类“TATAAA”的模块右侧7bp处有相对较强的复制水平。综上,我们构建了一个能在一定程度上用荧光指示HBV复制的体外细胞模型——“all in one”荧光报告系统,但目前该系统的荧光强度和复制水平都较弱,关于对提高HBV复制效率方面进行探索的结果,还有待后续与该系统的整合应用和验证,而在荧光方面,该系统还有待进一步的优化。
许雪琳[4]（2014）在《KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型的建立的研究》文中研究表明目的：本次研究主要完成了1.对40例健康汉族人群KIR, HLA-Cw位点基因分型,分析并分选出KIR2DL3+/HLA-Cl+个体；2.建立HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。本次研究的两部分内容为KIR2DL3/HLA-C1基因组合与NK细胞体外抑制HCV复制相关性研究的关键前提和基础。方法：第一部分：取随机抽取的40例健康汉族人群外周血样本,采用商用试剂盒严格按照说明书进行KIR、HLA-Cw位点的基因分型；采用直接计数法对分型结果进行综合分析。第二部分：采用脂质体转染法进行HCVRNA对Huh-7.5细胞的转染,RT-PCR检测转染后细胞内HCVRNA复制情况；Western blot检测转染后细胞内HCV NS3.NS5A蛋白的表达情况；免疫荧光法检测转染后细胞内NS5A蛋白的细胞定位。检测成功后,收集产生自上述HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒,与分离自抗HCV阴性个体的CD4+T细胞共同孵育,RT-PCR检测共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA复制情况；Western blot检测共孵育后CD4+T细胞内HCV NS3、NS5A蛋白的表达情况。结果：第一部分：40例样本中HLA-Cw位点HLA-C1基因出现频率较HLA-C2高,且HLA-C1C1出现的频率较HLA-C1C2高；KIR基因型中,以3DL1、2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1、2DS4出现频率较高,而3DS1、2DS1.2DS2、2DS3、2DS5、2DL2、2DL5出现频率较低；KIR2DL3+/HLA-C1C1例数较KIR2DL2+/HLA-C1C1多。以上可见,KIR2DL3+/HLA-Cl+基因型组合以KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1者较多,占总样本数52.5%。第二部分：在HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的构建中,RT-PCR检测到转染后Huh-7.5细胞内HCVRNA的复制；Western blot检测转染后Huh-7.5细胞内HCV NS3及NS5A蛋白的表达；免疫荧光法对转染后细胞内HCV NS5A蛋白成功进行了定位。产生自HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒与CD4+T细胞共同孵育,RT-PCR及Western blot技术分别检测到共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA的复制及HCV NS3及NS5A蛋白的表达。结论：第一部分：根据KIR.HLA-Cw分型结果进行分析,我们得到KIR2D L3+/HLA-Cl+（KIR2DL3-2DL3/HLA-CICl、KIR2DL3-2DL2/HLA-C1C1）.—/HLA-Cl+（KIR2DL2-2DL2/HLA-CICl）、KIR2DL3+/—（KIR2DL3-2DL2/C2-）4种基因组合个体。第二部分：我们成功建立了HCV（J6/JFH）Huh-7.5细胞体外培养系统,并产生具有感染作用的HCV病毒颗粒；利用上述病毒颗粒在体外成功进行了对人CD4+T细胞的感染,建立了HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。
薛梅[5]（2010）在《丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究》文中认为丙型肝炎病毒是导致慢性丙型肝炎,肝硬化、肝纤维化甚至肝细胞癌的主要病原体。根据世界卫生组织1999年统计,全球约有1.7-2.0亿人感染HCV,我国丙型肝炎病毒的感染率为3.2%,属HCV中高度感染区。除人和黑猩猩是丙型肝炎病毒的自然宿主,至今尚未发现其他自然动物对HCV易感。理想的HCV小动物模型缺乏,严重制约了丙型肝炎相关致病机制的研究,也导致了尚无可完全治愈的临床药物和有效预防的疫苗。2005年高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,使得一次性得到背景一致、病毒滴度高的HCV病毒成为可能；其中Charles Rice所构建的J6/JFH1病毒株已经被证实对黑猩猩有较高的感染性。但由于黑猩猩购买、饲养成本较高,亟待发现、开发新的丙型肝炎小动物模型。树鼩是主要分布于我国云南地区,体型较小,繁殖较快的低等灵长类动物。已有研究提示,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染性未被最终证实。本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树晌原代肝细胞（PTH）,用含生长因子的特殊培养基,长期培养PTH。分离获得的PTH,经过2-3天的适应期,逐渐进入对数生长期,培养8-10天后,肝实质细胞开始出现衰老凋亡。培养12天后,肝实质细胞逐渐减少,混杂的纤维状细胞迅速生长。培养过程中的原代肝细胞,用MTT法检测细胞活力,绘制细胞生长曲线,并用倒置显微镜观察细胞形态。丙酮酸氧化酶法检测PTH培养上清中ALT变化水平,发现第2天后ALT水平明显下降,随后一直维持在低水平。较低的转氨酶水平等相关肝功代偿性指标,说明胶原酶消化及相关细胞处理过程对细胞造成的损伤较小。采用J6/JFH1-Huh7.5.1细胞病毒培养体系,培养获得了病毒载量为108IU/ml以上、病毒滴度为106ffu/ml以上的病毒,用于感染生长状态良好的PTH。荧光定量PCR检测培养上清中HCV病毒载量最高可达4×105IU/ml。利用逆转录巢式PCR法,可间歇性检测到培养上清中HCV RNA。利用间接免疫荧光法检测PTH内HCV蛋白的表达,可以观察到HCV感染的PTH发出特异性绿色荧光,证实HCV抗原可在感染细胞中表达。PTH产生的二代HCV感染Huh7.5.1细胞,可在培养上清中检测到较低水平的HCV RNA,说明被HCV感染的PTH所产生的HCV病毒具有感染性。PTH所产生的感染性HCV,可以在PTH中进行病毒传代,第二代病毒与第一代病毒载量水平相当。培养上清中HCV RNA经核酸序列测定,发现5’NCR-C区段、E1-E2区段与J6/JFH1嵌合病毒中的J6对应基因区段高度同源,NS5B区段与嵌合病毒J6/JFH1中JFH1对应基因区段同源,但该区段存在细胞适应性突变I2750M。综上所述,本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,利用二步灌流、胶原酶消化法,获得了生长状态良好的树鼩原代肝细胞,可以满足后续感染实验的要求。病毒核酸定量和定性检测,以及蛋白质水平检测均表明,树鼩原代肝细胞可被J6/JFH1病毒感染,并支持HCV病毒的培养传代,病毒增殖过程中存在HCV基因突变。这些实验结果为树鼩做丙型肝炎病毒小型动物模型,提供了实验依据,并且有助于研究HCV感染与复制的机制。
吕丽萍[6]（2009）在《hTERT修饰的成人肝细胞及其对肝炎病毒易感性的研究》文中研究说明由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等人嗜肝病毒感染所导致的急、慢性病毒性肝炎,以及由此发展成的肝硬化和肝癌是严重危害人类健康的重大传染性疾病。目前全球至少有3.6亿HBV慢性感染者和1.7亿HCV感染者,每年由于HBV和HCV感染导致死亡的人数达1500万。过去的十多年间,虽然在预防和治疗急、慢性病毒性肝炎方面取得了一定进展,但也带来了许多问题,其中比较突出的是缺乏特效治疗药物以及耐药性病毒株的出现,而制约这一工作进程的难题之一是没有适用于药物筛选的肝炎病毒体外感染细胞模型和实验动物评价模型。用肝炎病毒阳性血清直接感染原代培养的人肝细胞或胎肝细胞是研究嗜肝性病毒自然感染和复制的最佳方式,但由于胎肝细胞的分化程度影响着其对肝炎病毒的易感性,因此用原代人肝细胞研究肝炎病毒进入细胞的早期感染过程以及由此引起的细胞先天免疫等方面具有不可比拟的优势。人肝细胞属于高度分化的类上皮细胞。体外培养的人肝细胞生存期短,很快失去增值分化能力,细胞衰老、死亡。细胞的生存寿命与细胞内端粒的长度密切相关。端粒位于染色体末端,由核蛋白复合体构成,它起着稳定细胞染色体的重要作用。随着细胞分裂,端粒长度逐渐缩短,当缩短到一定长度时,细胞就会出现衰老或凋亡。端粒酶是一种能维持端粒长度的核酸蛋白酶,在胚胎干细胞、生殖细胞、永生化细胞和肿瘤细胞中有表达。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）是端粒酶的一种核心亚基单位,其表达量的高低对端粒酶活性起决定作用,与端粒酶活性高度一致。用人TERT （human TERT,hTERT）修饰人体细胞可激活端粒酶活性,抑制端粒的缩短,从而延长细胞的体外生长时间。鉴于人肝细胞来源的有限性和体外培养的困难性,本研究将编码hTERT的基因转入成人肝细胞,筛选出了经hTERT修饰后的成人肝细胞,可传代培养,并在此基础上研究了HBV对该细胞和移植鼠的自然感染性,为建立抗HBV药物筛选和疫苗评价平台奠定了一定基础,也为建立HCV自然感染细胞模型提供了新的思路。具体研究内容及结果如下:一、原代成人肝细胞的分离和培养。运用改进的两步灌流技术从成人正常小块肝组织分离肝细胞并进行体外培养,观察细胞形态特征并对其代谢特点进行评价。肝细胞培养7天时出现细胞克隆,细胞核浆比例大,色浅,具有单、双甚至多个细胞核,胞浆丰富,扩大培养后肝细胞形态未见明显改变。通过测定肝细胞特异性基因发现,分离的肝细胞中具有成熟肝细胞（即肝细胞晚期基因）的mRNA,未检测到甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）的mRNA,提示所分离培养的原代肝细胞是成熟、正常的肝细胞。肝细胞培养1至9天,其白蛋白的分泌量呈递增趋势,第9天的分泌量达到峰值,然后呈现下降趋势,这些结果与肝细胞的生长状态相一致。二、hTERT修饰成人肝细胞株的建立。用脂质体介导法包装hTERT cDNA的重组逆转录病毒载体。将包装的重组逆转录病毒载体转入上述原代肝细胞,经G418加压筛选得到表达hTERT的原代肝细胞,即hTERT修饰的原代成人肝细胞,命名为HC-T（human hepatocytes transducted with gene encoding hTERT）。修饰后的肝细胞具有白蛋白（albumin,Alb）,谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）和转铁蛋白（transferrin,TF）的mRNA,未检测到原癌基因AFP的mRNA;免疫荧光结果显示,细胞角蛋白18（cytokeratin 18,CK18）均匀分布于细胞质内,而核内未见;糖原染色显示,hTERT修饰后的原代成人肝细胞糖原染色呈阳性。上述结果表明,经hTERT修饰的原代成人肝细胞仍具有正常肝细胞的形态和生理功能。该细胞株可连续传代培养。三、hTERT修饰的成人肝细胞对肝炎病毒的易感性。用HBV阳性血清直接感染HC-T细胞并采用ELISA法和Real-time PCR技术检测原代细胞上清、传代细胞上清和上清再感染细胞后的HBsAg和HBV DNA。与原代成人肝细胞相比,HC-T对HBV的易感性未见明显改变。HBV感染HC-T细胞2天后可在其上清液中检测到HBsAg和HBV DNA,这说明可能有病毒释放到细胞外。随着培养时间的延长,细胞上清液中的病毒量呈现波动,这可能是释放的病毒再次感染细胞所致,再感染的细胞包括分裂增殖子代细胞和尚未感染病毒的细胞。被HBV感染的HC-T经过传代,仍可在传代细胞上清液中检测到HBsAg和HBV DNA,但其含量较低,推测可能与HBV的慢性感染有关,病毒编码的某些蛋白可能抑制了细胞的凋亡,实现了HBV与细胞的共存状态。感染HBV的细胞上清液仍具有感染性,感染特点与HBV阳性血清相似,也呈现一定的波动性。上清中的病毒DNA水平和蛋白水平基本一致,HBcAg主要定位在胞浆内,核内偶见,这些都与HBV阳性血清感染原代肝细胞的结果相一致。四、hTERT修饰成人肝细胞移植鼠的探索。感染HBV的HC-T细胞经鼠的尾静脉输入裸鼠体内,观测其在裸鼠体内的生长状况,同时用ELISA和Real-time PCR技术测定裸鼠血清中HBsAg和HBV DNA的表达水平,用免疫组化技术分析鼠肝脏中人CK18定位和HBcAg的表达。结果表明,在移植HC-T细胞的裸鼠血清中可检测到HBsAg和HBV DNA,虽然含量较低,但两者出现和降低的时间相似,均在移植2周时达到高峰,随后逐渐下降,到第4周时含量最低。鼠的肝脏可见HBcAg表达,主要定位于胞浆和胞核内。通过尾静脉移植,HC-T细胞主要分布于肝脏的中央区和汇管区。上述实验为建立HC-T细胞移植的人肝嵌合鼠模型奠定了基础。总之,本研究建立了hTERT修饰的成人肝细胞,它可连续传代培养,且与正常肝细胞的形态和生理功能相似,可以自然感染HBV,这为建立和完善抗HBV和HCV药物以及疫苗筛选技术平台奠定了基础。
陈佳玉,陈佳琪,金显云[7]（2008）在《HCV细胞感染模型的建立》文中进行了进一步梳理目的研究人宫颈癌细胞（Hela）对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性,建立HCV细胞感染模型。方法将Hela细胞与慢性HCV患者血清共同温育8 h,收集不同时间点标本,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分别检测细胞培养上清液中正负链RNA,S-P法检测细胞内HCV NS1特异性抗原的表达情况。结果培养上清中可持续检测到HCV正链RNA,并可间断地检测到HCV负链RNA;HCV NS1特异性抗原能在感染细胞内稳定表达,阳性物质多位于胞浆中。结论Hela细胞不但对HCV易感,而且可以支持HCV体外复制表达。
冯悦[8]（2007）在《树鼩中HCV受体的初步研究》文中研究表明丙型肝炎全球流行,丙型肝炎病毒（HCV）感染人数约占总人口的3%。70～85%的HCV感染者发展成慢性感染,并有较大比例的病人发展成肝硬化和肝细胞肝癌,丙型肝炎已成为严重危害人类健康的传染病。由于缺乏高效的病毒体外培养体系和合适的小动物感染模型,严重限制了丙型肝炎的研究及药物、疫苗的研究与开发。HCV对细胞感染机制,如对靶细胞感染过程及肝细胞嗜性决定因素,及参与HCV识别、粘附、进入肝细胞的表面受体分子还不完全清楚。病毒与细胞表面受体结合是病毒感染过程中的始动环节,是决定病毒的宿主特异性、组织嗜性及致病性的主要因素之一。树鼩有着体积小、繁殖力高、价廉经济,而且其新陈代谢和肢体解剖与人类较为接近等特点。多项研究已初步证实树鼩可以被HCV感染,树鼩可能成为适合HCV感染的小动物模型。树鼩HCV受体的研究有助于阐明HCV致病机制,并可为基于阻断病毒囊膜蛋白-受体的抗病毒药物研究提供新的思路和理论依据。本研究以树鼩肝脏中提取的核酸为模板,利用RT-PCR方法,扩增了CD81、SR-BI、Claudin-1基因片断,扩增长度分别为711bp、1041bp、636bp。通过TA克隆方法,将其各自基因片断克隆至PMD-18T载体质粒中,构建了它们的基因重组质粒,并完成了其核苷酸序列测定。与人相比较,核苷酸序列同源性CD81、SR-BI、Claudin-1分别为91.4%、87.5%和90.9%;氨基酸序列同源性三个分子分别为96.2%、88.0%和93.4%。经HCV感染受体关键位点分析发现,CD81分子与人有9个差异性位点,6个在胞外大环区（LEL区）,HCV感染所需的关键位点与人基本一致;Claudin-1共有14氨基酸位点与人类有差异,胞外大环区有3个。SR-BI受体氨基酸序列与人有较大差异,61个差异位点中LEL区有44个。相比而言,所研究的树鼩的CD81和SR-BI受体更接近于灵长类动物而远于鼠类。为了对树鼩细胞CD81受体分子从mRNA的水平进行定量测定,研究建立了树鼩CD81荧光实时定量PCR技术。根据CD81核苷酸序列,设计并合成了引物和Taqman探针,并对其反应条件进行了优化,在25μl反应体系中,反应主要条件为退火温度60℃、引物浓度200nM、探针浓度100nM。经已知拷贝数标本（103、104、105、106、107拷贝）进行检测,绘制了标准曲线,CT值与拷贝数的对数值之间有很好的相关性（R2=0.9996）。通过批间、批内、组间、组内四个水平对该方法进行了重复性、稳定性评价,确定该方法具有较高的稳定性和可重复性,各项变异系数均小于5%。经检测灵敏性评价,该方法可以检测到每个反应相当于1×102copies CD81核酸分子。对HCV感染不同时间（8h、12h、16h、20h和24h）的树鼩原代肝细胞细胞（PTH）,进行了HCV-RNA检测,并用该方法检测了其CD81分子表达量,结果发现:在HCV感染不同时间的PTH中可以检测到HCV-RNA,随着HCV的感染和增殖,树鼩中CD81的表达量下降,下降曲线无规律性。综上所述,本研究对树鼩细胞中多种HCV受体进行了初步研究,进化关系上更接近于灵长类动物,HCV感染需要的氨基酸关键位点分析结果支持HCV感染。同时,建立了重复性好、灵敏度高、特异性强的树鼩CD81受体基因荧光实时定量PCR检测方法,初步发现HCV感染可导致细胞中CD81的表达量下降。以上结果为丙型肝炎树鼩动物模型的建立提供了新的依据,并为进行树鼩CD81受体分子进行定量研究提供了新技术方法。
许信刚[9]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中研究说明丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
罗新栋,聂青和[10]（2004）在《特殊人群的丙型肝炎特点及处理》文中指出1 儿童丙型肝炎1.1 流行病学我国健康体检儿童HCV感染率约为0.7%, 曾多次接受输血的患儿HCV感染率可达到22.9%.近年来根据国内存在的HCV基因型研究报道,发现常见的基因型为1-3型.目前认为感染我国人群的HCV主要是1b/Ⅱ型和2a/Ⅲ型,1a/Ⅰ型和2b/Ⅳ型少见.香港越南尚有基因6型发现. 台湾8例手术后发生的慢性丙型肝炎病儿中的4例呈现持续性的病毒复制,但没有肝炎的临床表现.另3 例有病毒血症和慢性肝炎.5例病儿的HCV基因型为2
二、HCV体外感染正常成人肝细胞的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCV体外感染正常成人肝细胞的初步研究（论文提纲范文）
（1）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（2）MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章: 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒生物学特征 |
| 1.1 病毒分类 |
| 1.2 HBV的血清型和基因型 |
| 1.3 HBV的病毒结构 |
| 1.4 HBV基因组及其功能 |
| 1.5 HBV生命周期 |
| 2 乙型肝炎病毒感染 |
| 2.1 HBV感染的全球地理分布情况 |
| 2.2 HBV的传播途径 |
| 2.3 乙型肝炎病毒感染的自然史 |
| 2.4 HBV感染的预防 |
| 2.5 HBV抗病毒治疗 |
| 3 乙型肝炎病毒研究模型 |
| 3.1 细胞培养模型 |
| 3.2 动物模型 |
| 4 MAPK通路与HBV的相关研究 |
| 5 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章: 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 菌株、质粒、cDNA和细胞株 |
| 1.4 常用试剂 |
| 1.5 实验室常规溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规细胞生物学实验 |
| 2.2 HBV感染实验 |
| 2.3 MAPK抑制剂筛选 |
| 2.4 HBV的DNA的提取与检测 |
| 2.5 HBV HBeAg、 HBsAg和HBcAg的检测 |
| 2.6 PreS1结合实验 |
| 2.7 HBsAg结合实验 |
| 2.8 细胞内蛋白水平的检测-Western Blot |
| 2.9 CCK-8细胞毒性检测 |
| 2.10 过表达和敲低宿主基因的慢病毒的构建及感染 |
| 2.11 转录组测序及分析 |
| 2.12 数据处理与统计学分析 |
| 第三章: 结果与分析 |
| 1 MAPK抑制剂的筛选 |
| 1.1 MAPK抑制剂在复制模型HepG2-N10细胞上的初步筛选 |
| 1.2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染水平的初步探索 |
| 1.3 MAPK抑制剂增强HBV的复制与表达 |
| 1.4 MAPK抑制剂增强HBV的感染与进入 |
| 2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染的机制探索 |
| 2.1 MAPK抑制剂促进HBsAg与肝细胞表面某宿主蛋白的结合 |
| 2.2 B-Raf IN1可通过上调JunB来增强HBV的复制 |
| 第四章: 讨论 |
| 1 HBV复制模型筛选和评价药物结果的可靠性需进一步验证 |
| 2 MAPK抑制剂不依赖NTCP途径促进HBV感染 |
| 3 B-Raf IN1促进cccDNA形成 |
| 第五章: 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）构建乙肝病毒体外复制的荧光报告系统的探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的基因型及分布 |
| 1.2 HBV的基因组结构及编码蛋白 |
| 1.3 HBV病毒颗粒的形态结构 |
| 1.4 HBV的生命周期 |
| 2 乙肝病毒的感染传播、预防与治疗 |
| 2.1 乙肝病毒的感染传播 |
| 2.2 乙肝病毒的预防 |
| 2.3 慢性乙肝病毒感染的治疗 |
| 3 HBV体外研究的细胞模型 |
| 3.1 HBV体外感染的细胞模型 |
| 3.2 HBV体外复制的细胞模型 |
| 4 绿色荧光蛋白 |
| 5 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验涉及到的主要仪器设备 |
| 1.2 主要实验耗材 |
| 1.3 实验所用质粒、菌株和细胞株 |
| 1.4 分子克隆和细胞实验相关常用试剂 |
| 1.5 主要实验相关溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 克隆质粒的构建 |
| 2.2 细胞相关实验的基本操作 |
| 2.3 HBV病毒感染实验 |
| 2.4 病毒蛋白的检测—CLEIA和ELISA |
| 2.5 细胞内HBV DNA的提取 |
| 2.6 DNA印迹—Southern Blot |
| 2.7 蛋白印迹—Western blot |
| 2.8 数据分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 Split GFP在可视化的HBV体外复制中的运用 |
| 2 Split GFP与Split mNeonGreen荧光系统的比较 |
| 3 Split mNeonGreen在可视化的HBV体外复制中的运用 |
| 3.1 “All in one”荧光报告系统的构建 |
| 3.2 “All in one”荧光报告系统的优化—不同数量的N11串联 |
| 3.3 “All in one”系统中荧光与HBV复制相关性的分析 |
| 4 荧光报告系统的优化—epsilon颈环配对方式的改变 |
| 5 不同基因型HBV的比较 |
| 6 报告基因插入位点对HBV复制的影响的初步探索 |
| 第四章 讨论 |
| 1 关于HBV基因组插入的荧光报告基因方面 |
| 2 关于荧光报告系统的HBV复制方面 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型的建立的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 缩略语表 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 材料方法 |
| 样本及材料 |
| 方法 |
| 1 人外周血基因组DNA的纯化 |
| 2 HLA-Cw位点基因分型 |
| 3 KIR基因分型 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 40例样本HLA-Cw位点分型结果及等位基因检测结果(见表1) |
| 2 40例样本KIR分型结果及不同角度分析(见表2、3、4) |
| 3 40例样本中HLA-C1及KIR2DL3、KIR2DL2基因组合及其等位基因组合分析(RL表 5、6)- |
| 讨论 |
| 第二部分 |
| 材料方法 |
| 材料 |
| 方法 |
| 1 质粒的处理 |
| 1.1 提取质粒 |
| 1.2 酶切鉴定 |
| 2 HCVRNA的转录、纯化制备 |
| 2.1 转录模板的制备 |
| 2.2 HCVRNA的转录 |
| 2.3 HCVRNA的纯化及转录体浓度的检测 |
| 3 HCV Huh-7.5 cell体外培养系统的建立 |
| 3.1 Huh-7.5细胞株的培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 转染细胞内的HCVRNA检测 |
| 3.4 Western blot检测转染细胞内HCV蛋白表达 |
| 3.5 免疫荧光染色法(Immunofluorescence assay,IFA)检测转染细胞内HCV蛋白的表达 |
| 4 HCV感染人CD4+ T细胞体外培养模型的建立 |
| 4.1 HCV病毒颗粒的收集及滴度检测 |
| 4.2 CD4+ T细胞的分选与培养 |
| 4.3 感染后CD4+ T细胞内HCVRNA检测 |
| 4.4 Western blot检测转染细胞内HCV蛋白表达 |
| 结果 |
| 1 质粒的提取、保存与鉴定 |
| 2 HCVRNA的转录、纯化制备 |
| 3 HCV RNA对Huh-7.5细胞株的转染 |
| 4 HCV对人CD4+ T细胞的体外感染 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 综述 |
| 参考文献 |
| 附录二：在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附录三：受试者知情同意书 |
（5）丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图与附表清单 |
| 英文缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎病毒与丙型肝炎 |
| 1.1.1 HCV生物学特性 |
| 1.1.2 HCV基因的变异与分型 |
| 1.1.3 HCV的流行与传播 |
| 1.1.4 丙型肝炎的预防和治疗 |
| 1.1.5 HCV检测方法 |
| 1.2 HCV细胞培养体系 |
| 1.2.1 HCV感染细胞培养体系 |
| 1.2.2 HCV亚基因组转染细胞培养体系 |
| 1.2.3 HCV细胞适应性突变 |
| 1.2.4 HCV全基因组转染细胞培养体系 |
| 1.3 HCV动物模型 |
| 1.3.1 HCV动物模型研究现状 |
| 1.3.2 树鼩 |
| 1.3.3 HCV感染树鼩原代肝细胞模型 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 1.5 实验技术路线图 |
| 第二章 幼年树鼩原代肝细胞生长状况评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂(试剂盒) |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 幼年树鼩原代肝细胞产量、活力及纯度 |
| 2.3.2 幼年树鼩与成年树鼩胞原代肝细胞比较 |
| 2.3.3 幼年树鼩原代肝细胞生长曲线 |
| 2.3.4 幼年树鼩原代肝细胞形态观察 |
| 2.3.5 幼年树鼩原代肝细胞培养上清中ALT水平 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 幼年树鼩原代肝细胞的分离获得 |
| 2.4.2 幼年树鼩与成年树鼩原代肝细胞的差异 |
| 2.4.3 幼年树鼩原代肝细胞生长曲线与形态观察 |
| 2.4.4 幼年树鼩原代肝细胞损伤 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 J6/JFH1对树鼩原代肝细胞的感染性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂(试剂盒) |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 PCR引物 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 J6/JFH1感染成年树鼩原代肝细胞定量PCR结果 |
| 3.3.2 J6/JFH1感染幼年树鼩原代肝细胞定量PCR结果 |
| 3.3.3 逆转录巢氏PCR检测培养上清液结果 |
| 3.3.4 间接免疫荧光检测Huh7.5.1和PTH中HCV蛋白表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 J6/JFH1感染树鼩原代肝细胞定量结果分析 |
| 3.4.2 J6/JFH1感染树鼩原代肝细胞定性结果分析 |
| 3.4.3 Huh7.5.1和PTH中HCV蛋白表达 |
| 3.4.4 J6/JFH1对幼年PTH和成年PTH的感染性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 J6/JFH1对树鼩原代肝细胞感染性的确定与突变分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂(试剂盒) |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 幼年PTH起源的HCV感染Huh7.5.1定量PCR结果 |
| 4.3.2 幼年PTH起源的HCV感染PTH定量PCR结果 |
| 4.3.3 成年PTH培养上清中HCV突变分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 幼年PTH起源的HCV对Huh7.5.1感染性分析 |
| 4.4.2 幼年PTH起源的HCV对PTH感染性分析 |
| 4.4.3 HCV突变分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）hTERT修饰的成人肝细胞及其对肝炎病毒易感性的研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 原代成人肝细胞的分离和培养 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 hTERT 修饰成人肝细胞株的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 hTERT 修饰成人肝细胞对肝炎病毒易感性的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 hTERT 修饰成人肝细胞移植鼠的初步探索 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）HCV细胞感染模型的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 HCV体外感染Hela细胞 |
| 1.2 标本的收集 |
| 1.3 检测 |
| 1.3.1 培养上清中HCV正、负链RNA的检测 |
| ①正链检测 |
| ②负链检测 |
| 1.3.2 细胞内抗原表达的检测 (S-P法) |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（8）树鼩中HCV受体的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 丙型肝炎简介 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒的简介 |
| 1.2 HCV感染动物模型 |
| 1.2.1 HCV感染动物模型的意义 |
| 1.2.2 不同类型HCV感染动物模型 |
| 1.3 丙型肝炎病毒受体 |
| 1.3.1 CD81 |
| 1.3.2 低密度脂蛋白受体(LDLr) |
| 1.3.3 B族I型清道夫受体(SR-BI) |
| 1.3.4 DC-SiGN/L-SiGN |
| 1.3.5 Claudin |
| 1.3.6 受体表达与发病机制 |
| 1.4 荧光定量PCR技术及其应用 |
| 1.4.1 荧光实时定量RT-PCR技术的原理 |
| 1.4.2 荧光定量PCR的荧光材料 |
| 1.4.3 荧光定量PCR的应用 |
| 1.5 本论文研究的目的意义和研究策略 |
| 1.5.1 本论文研究目的和意义 |
| 1.5.2 本论文研究策略 |
| 第二章 树鼩中HCV受体基因片段的克隆测序及其分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 实验材料和方法 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 核酸序列同源性比较与引物设计 |
| 2.4.2 树鼩重要受体RT-PCR扩增 |
| 2.4.3 树鼩重要受体克隆与鉴定 |
| 2.4.4 树鼩HCV重要受体核酸测序序列结果 |
| 2.4.5 树鼩中HCV受体核苷酸序列比对与同源性分析 |
| 2.4.6 树鼩中HCV受体氨基酸序列比对与差异性分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 树鼩中CD81受体与HCV作用的位点分析 |
| 2.5.2 树鼩中SR-BI受体与HCV作用的位点分析 |
| 2.5.3 树鼩中Claudin-1受体与HCV作用的位点分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 树鼩中CD81受体基因荧光定量PCR检测方的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验技术路线图 |
| 3.3 实验材料和方法 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Taqman探针荧光定量PCR探针和引物 |
| 3.4.2 Taqman探针荧光定量PCR检测方法最佳条件的确定 |
| 3.4.3 检测方法标准曲线的建立 |
| 3.4.4 检测方法重复性和稳定性的验证 |
| 3.4.5 检测体系灵敏性检测结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 实时定量PCR方法的选择 |
| 3.5.2 检测方法的标准曲线 |
| 3.5.3 本方法重复性问题 |
| 3.5.4 本检测体系的灵敏性 |
| 3.5.5 本检测体系的特异性 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 树鼩原代肝细胞的HCV的感染与CD81受体的检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验技术路线 |
| 4.3 实验材料和实验方法 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 感染24小时，不同时间收集细胞HCV负链情况的检测 |
| 4.4.2 感染24小时,不同时间收集细胞CD81分子的检测 |
| 4.4.3 感染8、12、16、20小时,不同时间收集细胞检测HCV正负链结果 |
| 4.4.4 感染8、12、16、20小时,不同时间收集细胞检测CD81分子的检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 Taqman探针荧光定量PCR检测模板的问题 |
| 4.5.2 用于感染PTH的细胞培养病毒HCVcc |
| 4.5.3 CD81的变化与树鼩的体外感染 |
| 4.5.4 存在的问题 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 成功扩增了树鼩中HCV重要受体，并完成了体外克隆与测序 |
| 5.2 完成了树鼩中HCV受体核苷酸序列比对与同源性分析 |
| 5.3 完成了树鼩中HCV受体氨基酸序列比对与差异性分析 |
| 5.4 建立了树鼩中CD81分子Taqman探针荧光定量PCR检测方法 |
| 5.5 树鼩原代肝细胞感染与CD81表达量的关系 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
（9）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
四、HCV体外感染正常成人肝细胞的初步研究（论文参考文献）
- [1]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [2]MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索[D]. 郑金伟. 厦门大学, 2019(09)
- [3]构建乙肝病毒体外复制的荧光报告系统的探索[D]. 王明风. 厦门大学, 2019(09)
- [4]KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型的建立的研究[D]. 许雪琳. 成都中医药大学, 2014(06)
- [5]丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究[D]. 薛梅. 昆明理工大学, 2010(03)
- [6]hTERT修饰的成人肝细胞及其对肝炎病毒易感性的研究[D]. 吕丽萍. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(09)
- [7]HCV细胞感染模型的建立[J]. 陈佳玉,陈佳琪,金显云. 中国实验诊断学, 2008(12)
- [8]树鼩中HCV受体的初步研究[D]. 冯悦. 昆明理工大学, 2007(09)
- [9]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [10]特殊人群的丙型肝炎特点及处理[J]. 罗新栋,聂青和. 世界华人消化杂志, 2004(10)