一、登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析（论文文献综述）
康棣[1]（2021）在《ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制》文中进行了进一步梳理蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的一种由库蠓传播的严重危害反刍动物的急性非接触性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须上报的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。BTV感染宿主细胞后被模式识别受体识别,继而激活Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）信号通路,诱导IFN-Ⅰ表达,IFN-Ⅰ能进一步激活多种信号通路的级联反应,最终导致数百种干扰素刺激基因（Interferon stimulated gene,ISG）的转录和表达,ISG与其他免疫细胞或细胞因子及抗菌肽等蛋白共同建立起宿主抗病毒免疫的第一道防线。本实验室前期的研究发现,ISG15和ISG20是BTV感染羊睾丸细胞前后表达差异较大的两种蛋白,推测其可能在BTV感染过程中发挥重要的调控作用。本研究首先发现BTV感染羊肾细胞MDOK后,ISG15的转录水平显着上调,并且呈BTV感染时间和感染复数（MOI）依赖性。提取BTV感染的MDOK细胞总RNA,RT-PCR扩增获得羊ISG15基因,构建带HA标签的ISG15基因真核表达质粒,转染MDOK细胞后接种BTV,检测不同时间点BTV的蛋白表达、转录水平和病毒滴度,结果表明,ISG15过表达能够显着促进BTV的复制,此外,利用si RNA技术敲低内源性ISG15基因的表达后,BTV复制水平显着降低。已有研究发现,ISG15能够通过C末端基序对底物蛋白进行ISG化修饰而阻止底物蛋白的泛素化和降解,本研究将ISG15 C末端序列由LRLRGG突变为LRLRAA,ISG15将无法共价结合底物蛋白完成ISG化,发现过表达突变型或野生型ISG15对BTV的复制水平的影响无显着差异,可见ISG15对BTV复制的促进作用由ISG15单体引起而不依赖ISG化。为了进一步阐明ISG15与BTV互作的机制,将ISG15分别与BTV的S1-S10基因共转染MDOK和HEK293T细胞,通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验,筛选到4个与ISG15互作的BTV蛋白,分别为VP3、VP4、VP5和NS1。同时发现,ISG15的过表达能够促进VP4和NS1蛋白的表达,且表达丰度与ISG15转染量呈正相关。此外,实验结果表明,VP4与NS1通过泛素蛋白酶和自噬溶酶体途径降解,由于ISG化与泛素途径中的部分酶能够通用,ISG15与泛素间存在竞争关系,说明ISG15的过表达可能导致病毒蛋白泛素化修饰水平降低,从而促进了BTV增殖。BTV感染MDOK细胞后ISG20 mRNA的表达水平显着上调,且呈BTV感染时间和MOI依赖性,利用RT-PCR方法克隆获得了羊ISG20基因,序列分析显示羊ISG20与其他物种ISG20同源性较高,且DEDD外切酶家族的关键序列在各物种间高度保守。构建ISG20基因的真核表达质粒并转染MDOK细胞,感染BTV后在不同时间点收样,结果显示,过表达羊ISG20使BTV蛋白表达量、基因转录水平和病毒滴度均明显下降,显着抑制了BTV的复制,相反,利用si RNA敲低内源性ISG20基因表达后,能够促进BTV的复制水平。利用激光共聚焦和免疫共沉淀方法,发现ISG20与BTV VP4能够发生相互作用。构建外切酶活性缺失的ISG20真核表达质粒,转染MDOK细胞并接种BTV,发现BTV NS1基因的转录、蛋白表达量和病毒滴度在感染后48 h均与转染野生型ISG20的细胞产生明显差异,而VP6的转录和蛋白水平则无显着差异,这说明ISG20的核酸外切酶活性作用于BTV NS1蛋白,同时发现,突变型ISG20与VP4相互作用明显减弱,说明ISG20的酶活性位点是其与VP4蛋白的结合关键位点之一,由此可见,ISG20与VP4互作是ISG20发挥抑制BTV复制作用的重要途径之一。
陈楠楠[2]（2021）在《宿主蛋白COPε在猪细小病毒感染过程中作用及机制研究》文中进行了进一步梳理猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,PPV感染母猪临床上主要表现为不发情、流产、产死胎等症状。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码病毒非结构蛋白NS1和NS2,ORF2编码病毒结构蛋白VP1和VP2。其中NS1是PPV最重要的非结构蛋白,对病毒DNA复制是不可或缺的,在病毒感染过程中主要参与诱导宿主细胞周期阻滞,进而引起细胞病变以及组织损伤。外被体蛋白I（Coater protein complex,COP I）是一种由α、β、β’、γ、δ、ε、ζ亚基组成的七聚体复合物,COP I的生理功能是介导蛋白质由内质网向高尔基体逆向转运,在保持内质网和高尔基体的完整性和维持细胞稳态中发挥重要作用。近年来的研究发现,COP I的不同亚基还参与了病毒的复制过程,COPβ能与肠病毒71型（Enterovirus 71,EV71）2C蛋白相互作用促进EV71的复制;COPε缺失会抑制水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）入侵细胞和基因表达从而影响VSV复制。还有研究发现,当COP I亚基COPα发生突变会影响细胞内I型干扰素的产生,进而影响病毒的复制。然而有关宿主蛋白COP I的亚基在PPV复制过程中的作用及机制迄今未见报道。本研究拟在筛选到与NS1发生互作的宿主蛋白COPε基础上,首先构建copε敲除和过表达细胞系,研究COPε对PPV复制的影响。然后,找到NS1与COPε的相互作用氨基酸基序,构建该基序突变的PPV毒株,研究PPV NS1与COPε互作位点突变对PPV自身复制的影响。最后,探讨COPε对细胞IFN-β产生的影响及机制。研究结果为进一步明确PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.以表达纯化后的NS1重组蛋白作为诱饵,收集PK-15细胞裂解液与NS1共孵育,以His琼脂糖珠子富集纯化之后切取差异条带进行质谱分析,筛选到与NS1互作的宿主蛋白COPε。将构建好的p GFP-copε转染至PK-15细胞,激光共聚焦结果显示,COPε主要定位于细胞质。将p CDNA-HA-copε和p CI-Flag-ns1共转染于HEK293T,分别用Flag和HA单克隆抗体富集NS1与COPε,Co-IP结果显示,NS1与COPε存在相互作用;激光共聚焦结果显示,NS1与COP在PK-15细胞核中存在明显共定位。用带有His标签的D-PPV感染PK-15细胞,利用His单克隆抗体富集细胞内源性COPε;Co-IP结果显示,NS1能与内源性COPε发生相互作用;激光共聚焦结果显示,D-PPV感染PK-15细胞后NS1与COPε在细胞核中存在明显共定位。2.copεsi RNA预处理PK-15细胞12 h后感染1 MOI PPV,荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,感染后12 h和24 h si RNA组的病毒基因组拷贝数均显着降低（P<0.05）。构建了copε敲除细胞系PK-15copε-/-,1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15,24 h后检测细胞上清病毒基因组拷贝数和TCID50,结果发现与对照组相比,PK-15copε-/-上清病毒基因组拷贝数和TCID50均显着降低（P<0.05）,同时,PPV NS1的表达也显着降低（P<0.05）。构建copε过表达细胞系PK-15COPε,1 MOI PPV感染PK-15COPε24 h后,检测细胞上清病毒基因组拷贝数和TCID50,结果显示与对照组比较,PK-15COPε上清病毒基因组拷贝数和TCID50显着升高（P<0.05）,同时,PPV NS1的表达也显着升高（P<0.05）。3.将p CDNA-HA-copε分别与p GFP-ns1（1-86 aa）和p GFP-ns1（87-662 aa）共转染至HEK293T后Co-IP结果显示,COPε与NS1（1-86 aa）存在相互作用;激光共聚焦结果也显示COPε与NS1（1-86 aa）在细胞核存在明显的共定位。将p CDNA-HA-copε分别和构建的突变载体p GFP-ns1ΔS1（25-31 aa）与p GFP-ns1ΔS2（36-42 aa）共转染至HEK293T,Co-IP结果显示COPε与NS1缺失N端25 aa～31 aa不能发生相互作用,激光共聚焦结果也显示COPε与NS1缺失N端25 aa～31 aa在PK-15细胞中不存在共定位。以上结果表明,NS1与COPε相互作用位点位于NS1 N端25 aa～31 aa。构建NS1N端25 aa～31 aa突变的感染性克隆质粒p PPVNC-,p PPVNC-转染PK-15细胞,连续盲传5代进行病毒拯救,拯救成功的病毒命名为PPVNC-。分别用1 MOI的PPV与PPVNC-感染PK-15细胞,荧光定量PCR结果显示,在感染24 h后PPVNC-组病毒基因组拷贝数显着高于PPV感染组（P<0.05）。4.1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15细胞8 h后,检测IFN-βm RNA水平,结果显示,与野生型PK-15细胞相比,PK-15copε-/-中IFN-βm RNA表达水平显着升高（P<0.05）。1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15细胞24 h后,western blotting检测TBK1、IRF3及其磷酸化水平,结果显示与野生型PK-15细胞相比,PK-15copε-/-中TBK1、IRF3无明显变化（P>0.05）,而p-TBK1、p-IRF3表达水平显着升高（P<0.05）。1 MOI PPV和PPVNC-感染野生型PK-15细胞8 h后,荧光定量PCR检测结果显示与野生毒株感染细胞相比,PPVNC-感染细胞IFN-βm RNA表达水平显着降低（P<0.05）。1MOI PPV和PPVNC-感染野生型PK-15细胞24 h后,western blotting结果显示与野生毒株感染组相比,PPVNC-组细胞内TBK1、IRF3无明显变化（P>0.05）,而p-TBK1、p-IRF3表达水平显着降低（P<0.05）。本研究成功筛选到与NS1发生互作的宿主蛋白COPε,干扰、敲除和过表达copε的细胞试验结果表明,COPε对PPV的复制有明显的影响。确定了NS1与COPε相互作用位点位于NS1 N端25 aa～31 aa,构建了该互作位点突变的PPV突变毒株并命名为PPVNC-,发现了PPVNC-感染对病毒自身复制有明显的影响。证实了COPε通过影响TBK1、IRF3磷酸化水平调控IFN-β的表达,进而影响PPV的复制。研究结果为进一步探索PPV致病机制提供理论依据。
李国华[3]（2020）在《西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究》文中提出西尼罗病毒病（West Nile virus disease,WND）是由西尼罗病毒（WNV）经蚊虫叮咬感染动物和人的、以西尼罗热（WNF）和西尼罗脑炎（WNE）为主要临床症状的人兽共患传染病。自1999年在美国纽约暴发以来,每年均有动物和人感染发病。据美国动植物卫生检验局（APHIS）统计,2002年美国确诊了12 527例马匹感染,为历史最高。针对传染性疾病,疫苗是最有效的防治手段之一。当前已有4株上市的马用西尼罗病毒疫苗。其中3株是灭活疫苗,1株为含有西尼罗病毒结构基因的金丝雀痘病毒活疫苗（该活疫苗在体内不能复制）。虽然4株疫苗经免疫后均具有良好的免疫保护效果,但是马匹均需要在首免后每年加强免疫一次,才能持续获得免疫保护,疫苗成本和人力成本随之增加。因此,急需研制一种免疫1～2次即可获得持久免疫力的西尼罗病毒活疫苗。流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株（JEV SA14-14-2）属于黄病毒科黄病毒属病毒,与WNV同科同属,是建立西尼罗病毒嵌合株活疫苗的优良载体。JEV SA14-14-2安全性高,自1989年JEV SA14-14-2上市以来,经过30余年的免疫接种,该疫苗未见明显的不良反应,有效控制了流行性乙型脑炎在我国的流行。其次,流行性乙型脑炎病毒和西尼罗病毒同科同属,基因组结构相似,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗容易构建成功。WNV NY99株导致的西尼罗脑炎（WNE）致死率高,严重威胁动物和人的生命健康。虽然我国在2011年从尖音库蚊体内分离到了西尼罗病毒,但还未有动物感染发病报道,因此选用危害较大的WNV NY99株进行疫苗研究。目的:建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,以JEV SA14-14-2为载体,构建含有西尼罗病毒pr MΔE基因的嵌合株病毒ChiVax-WN01,并验证其免疫原性,为研制经济高效的马用西尼罗病毒候选疫苗奠定基础。方法:（1）JEV SA14-14-2全基因组序列测定。本研究采用蚀斑纯化法,利用BHK-21细胞经3轮纯化获得JEV SA14-14-2蚀斑单克隆,并利用BHK-21细胞扩繁病毒。提取病毒RNA并反转录成c DNA,通过PCR方法分11段扩增病毒全长c DNA,分别连入p EASY-Blunt克隆载体测序。利用DNAStar和DNAMAN比对并拼接病毒全长基因组序列,获得JEV SA14-14-2全基因组c DNA序列。（2）建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统。利用DNAStar软件分析JEV SA14-14-2序列,选取4个单克隆酶切位点将病毒基因组全长分为5段（F1～F5）。利用分子生物学技术引入T7 promoter序列、HDVr序列、T7 terminator序列和内含子序列,分段连接5个片段,构建含有病毒全长c DNA的感染性克隆质粒p FLJEV。通过Lipofectamine 3000将p FLJEV转染BSR T7/5细胞拯救病毒。通过蚀斑形态、生长曲线和病毒核酸复制能力鉴定并比较拯救毒和母本毒的生物学特性。（3）西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01构建与鉴定。基于JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,将WNV NY99株（DQ211652）的prMΔE基因替换JEV SA14-14-2的pr MΔE基因,构建含有WNV NY99 pr MΔE基因的嵌合株感染性克隆质粒p ChiVax-WN01。利用Lipofectamine 3000将p ChiVax-WN01转染BSR T7/5细胞拯救病毒。鉴定并比较嵌合株病毒ChiVax-WN01的生物学特性。（4）西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01安全性与实验免疫研究。以BALB/c小鼠为动物模型,经腹腔分别注射105～101 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和JEV SA14-14-2母本毒,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠神经侵袭性。分别经颅内注射100 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和100 PFU JEV SA14-14-2,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠的神经毒性。为验证ChiVax-WN01免疫原性,以BALB/c小鼠为动物模型,分别腹腔接种100 PFU JEV SA14-14-2、100 PFU ChiVax-WN01和PBS,接种后1 d、3 d、5 d、7 d和9d分别取各组小鼠的血浆、脑、肝、脾、肺和肾,利用蚀斑法检测病毒在血液的增殖水平和内脏的分布。通过微量中和试验测定小鼠血清的中和抗体效价。通过ELISpot法测定脾淋巴细胞中分泌IFN-γ、IL-2和IL-4细胞的数量。结果:（1）获得JEV SA14-14-2全长序列,Gen Bank序列号为MK585066。（2）成功构建出JEV SA14-14-2感染性克隆质粒pFLJEV,转染拯救出在病毒滴度、生长动力学特征和蚀斑形态方面与母本病毒无明显差别的子代病毒,经电镜超薄切片可观察到完整病毒粒子。（3）成功构建出嵌合株病毒感染性克隆质粒p ChiVax-WN01,成功拯救出子代病毒ChiVax-WN01,电镜观察可见包装完整的病毒粒子。（4）神经侵袭性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率均为100%,与JEV SA14-14-2组和PBS组无差别。神经毒性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率为50%,有神经毒性,JEV SA14-14-2组和PBS组小鼠存活率100%。病毒在内脏分布情况表明,ChiVax-WN01接种后各个时间点内脏中均未检测到病毒滴度。嵌合株病毒ChiVax-WN01能诱导机体产生中和抗体,效价为1:90,并可显着提高IFN-γ和IL-2分泌细胞在脾淋巴细胞中的比例。以上结果表明,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01腹腔接种具有较高的安全性和良好的免疫原性。结论:成功建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,并基于该系统构建构建了ChiVax-WN01,且ChiVax-WN01在小鼠上具有较好的安全性和免疫原性。
何延华[4]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中认为牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
陈松彪[5]（2020）在《宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究》文中研究表明猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍性疾病重要病原,能够引起初孕母猪流产、产死胎、畸胎和木乃伊胎等,给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV基因组主要包括2个开放性阅读框（Open Reading Frame,ORF）ORF1和ORF2,ORF1主要编码非结构蛋白NS1和NS2,它们的功能是参与病毒复制及致细胞病变。NS2具有与NS1相同的N末端,且NS2-m RNA是由NS1-m RNA（pre-m RNA,NS2-m RNA的前体m RNA）经可变剪接之后产生。宿主蛋白Syncrip是核不均一核糖核蛋白（Heterogenous nuclear ribonucleo proteins,hn RNPs）家族成员之一,与宿主细胞m RNA的转录、外显子剪接以及剪接位点的选择等过程相关,此外还参与了某些肝炎病毒的复制。ORF2主要编码结构蛋白VP1和VP2,VP2是PPV最主要的衣壳蛋白,占衣壳成分的80%左右,在病毒感染过程中VP2参与了病毒基因组的入核和成熟病毒粒子的组装。宿主蛋白MCM3是解旋酶MCM家族成员之一,在宿主DNA复制过程中能够使双链DNA发生解旋从而促进宿主细胞DNA的复制。然而,在PPV复制过程中宿主蛋白Syncrip和MCM3有何作用及其作用机制,迄今尚未见报道。本论文首先构建编码NS1和NS2共有基因序列的大肠杆菌表达载体,制备能同时识别出NS1和NS2的多克隆抗体。通过无缝克隆技术（In-Fusion）构建稳定携带遗传标记的PPV全长感染性克隆株。然后,利用蛋白-蛋白免疫共沉淀（Co-IP）以及RNA-蛋白免疫共沉淀（RNA-pulldown）串联质谱技术分别筛选出NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3。最后,研究宿主互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步探索PPV致病机制奠定理论基础。研究取得以下结果。1.PCR扩增出编码NS1和NS2共有的ns基因,将扩增出的ns基因克隆入原核表达载体p ET-32a,PCR、酶切和测序鉴定结果显示,p ET-32a-NS原核表达载体构建成功。将p ET-32a-NS转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE和western blotting结果显示,重组质粒在大肠杆菌中成功表达出大小为35 k Da左右的NS重组蛋白,并且该重组蛋白在上清和包涵体中均有表达。对重组菌可溶性表达的最佳条件进行优化,结果显示,重组菌在37℃,0.8 m M诱导剂诱导6 h时的可溶性表达量最高。在最佳条件下大量诱导表达重组蛋白,通过His镍柱纯化出NS重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗NS蛋白血清抗体,ELISA检测抗体效价为1:12800,western blotting检测结果显示,该抗体能够特异性识别原核表达NS重组蛋白以及真核细胞表达的NS1和NS2。2.人工合成基因组两端的特殊回文序列F1和F2,构建含F1和F2序列的质粒p KQLL（F1+F2）。以提取的PPV DN A为模板,分别扩增F3和F4片段,与线性化处理的质粒p KQLL（F1+F2）进行无缝克隆（In-fusion）连接,构建携带遗传标记的PPV全长感染性克隆质粒p Y-PPV,将p Y-PPV质粒转染PK-15细胞,连续盲传进行病毒拯救。提取被感染细胞的DNA进行病毒核酸PCR检测呈阳性,在电镜下观察到了病毒粒子,western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测到病毒蛋白的表达,并且连续盲传至15代仍然能检测到病毒所携带的遗传标记。以上结果表明,成功拯救出稳定携带遗传标记的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。将Y-PPV和亲本毒株PPV按照相同MOI接种PK-15细胞,通过测定感染后不同时间点病毒DNA拷贝数和TCID50,检测Y-PPV和亲本毒株PPV的复制能力。同时通过AO-EB染色、流式细胞术及caspase活性检测Y-PPV和PPV诱导细胞凋亡的特性。结果显示,Y-PPV的复制能力与亲本毒株相比无显着差异（p>0.05）,同时具备与亲本毒株相似的诱导细胞凋亡特性。进一步将Y-PPV和PPV分别感染初孕母猪,ELISA检测到Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中PPV抗体水平变化趋势一致且各时间点的PPV抗体水平无明显差异（p>0.05）,放射免疫检测结果显示,Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中的孕酮水平变化趋势一致且各时间点的孕酮水平无明显差异（p>0.05）。通过Real-time PCR检测到Y-PPV和PPV感染的同一组织中病毒载量无明显差异（p>0.05）。病理组织学检查结果显示,Y-PPV和PPV感染均能够使子宫和卵巢组织出现明显病理学损伤。3.筛选鉴定NS1-m RNA的关键宿主互作蛋白。体外合成生物素标记NS1-m RNA,将其与PK-15细胞核抽提物共孵育,以链霉亲和素磁珠筛选共沉淀蛋白并进行质谱分析,筛选出与NS1-m RNA互作的关键宿主蛋白Syncrip。将生物素标记NS1-m RNA和PK-15细胞核抽提物共孵育,RNA-pulldown检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。用Syncrip抗体和PPV感染的PK-15细胞核抽提物共孵育进行蛋白质-RNA免疫共沉淀,结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。在PPV感染PK-15细胞后进行原位杂交,通过激光共聚焦检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在共定位。将生物素标记NS1-m RNA和纯化后原核表达的Syncrip进行体外互作试验,凝胶迁移结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在直接互作。4.明确Syncrip在PPV感染过程中的作用及机制。利用syncrip的si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50。结果显示,干扰syncrip的表达能够降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了syncrip敲除细胞株,检测结果显示,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。PPV感染syncrip敲除细胞后发现,syncrip的缺失能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）,并且也能够显着降低NS2的蛋白表达水平和m RNA水平（p<0.05）。同时在Y-PPV平台上构建ns2缺失型毒株,细胞试验结果显示,ns2缺失能够显着降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用Real-time PCR和western blotting检测到PPV在组织中的复制水平与Syncrip表达水平呈正相关。在体外共转染ns1和syncrip,western blotting和Real-time PCR结果显示,过表达Syncrip能够显着降低NS1的蛋白表达和m RNA表达水平（p<0.05）。在体外共转染ns1上ns2的3’末端的剪接位点突变的Flag-NS1（p C-Mut）和Syncrip,western blotting结果显示,过表达Syncrip对NS1的蛋白表达无明显影响（p>0.05）。5.筛选鉴定VP2的关键宿主互作蛋白。收集PPV感染PK-15细胞后的细胞蛋白,以PPV衣壳蛋白3C9抗体进行免疫共沉淀和质谱分析,筛选出VP2的关键宿主互作蛋白MCM3。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3共转至HEK293T细胞,Co-IP发现VP2和MCM3存在互作。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3质粒共转染或病毒感染PK-15细胞后进行免疫荧光染色分析,在激光共聚焦显微镜下观察到外源性及内源性的VP2和MCM3存在明显共定位现象。进一步在大肠杆菌中分别表达p ET-32a-VP2和p GEX-4T-MCM3蛋白并进行纯化,通过GST-pulldown及His-pulldown均能够检测到VP2和MCM3的互作,并且二者的互作不依赖于PPV感染或其它分子的参与。6.明确VP2及MCM3在PPV复制过程中的作用与机制。用vp2基因si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50,结果显示,干扰vp2的表达能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了mcm3敲除细胞株,检测发现,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。细胞感染试验结果显示,mcm3的缺失能够显着降低PPV感染后的DN A拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过Co-IP鉴定出VP2的115 aa231 aa是和MCM3互作的关键结构域。进一步通过原位杂交方法在激光共聚焦显微镜下观察到,在PPV感染后NS1、VP2、MCM3以及病毒基因组DNA存在互作。然后通过DNA-pulldown检测到VP2、NS1和病毒基因组DNA存在直接互作关系,而MCM3不能直接和病毒基因组DNA发生互作。通过Co-IP和激光共聚焦检测到NS1不能参与招募MCM3到病毒基因组DNA,而VP2能够直接招募MCM3到病毒基因组DNA。进一步的DNA-pulldown检测到基因组DNA的300nt356 nt是DNA与VP2互作的关键基序区域,突变该互作基序能够完全阻止PPV的复制。本研究制备了特异性强、且能够同时识别PPV非结构蛋白NS1和NS2的多克隆抗体。成功获得了一株具有遗传稳定性、能够与亲本毒株感染相区分,并且保留了和亲本毒株相似生物学特性的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。分别筛选到NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3,明确了NS1-m RNA和VP2与关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3的直接互作关系。发现了NS2和Syncrip能够参与PPV的复制过程,敲除syncrip显着降低PPV的复制以及NS2的表达,ns2的缺失同样会显着降低PPV的复制能力。Syncrip的过表达会显着降低NS1的表达,并且该作用位点位于ns1基因上ns2的3’末端的剪接位点。发现了VP2及其互作蛋白MCM3均参与了PPV的复制,PPV感染过程中通过VP2和病毒基因组DNA直接互作招募MCM3至病毒基因组的DNA促进PPV的复制,获得了VP2的115 aa231 aa是与MCM3发生互作的关键结构域。发现了病毒基因组300 nt356 nt是病毒基因组DNA和VP2发挥互作的关键基序,并且该关键基序对PPV复制是必需的。上述研究结果阐明了NS1-m RNA和VP2及其互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步深入探讨PPV致病机制提供理论依据。
刘巧玲[6]（2020）在《JEV强、弱株prM/M、prM/E和NS1-NS2A基因真核表达及其免疫效果初探》文中研究说明日本乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的人兽共患病。本病主要表现为神经性症状和猪的繁殖障碍,对人与养猪业危害巨大。目前基于流行优势株的改变、流行范围与分布的扩大,疫苗依旧是预防本病最有力的保障。本研究对JEV GZ株和SA14-14-2株在细胞上进行适应性培养,并进行鼠脑接毒,经过特异性设计6对引物,扩增pr M/M、pr M/E和NS1-NS2A（NS1-2A）基因并进行克隆,构建真核表达载体,生物信息学的分析并进行动物免疫试验,研究蛋白pr M/M、pr M/E和NS1-2A真核表达和免疫效果差异,以期为研究JEV的相关蛋白功能和进一步的疫苗研发奠定基础。将JEV GZ株和SA14-14-2株在BHK-21与Vero细胞上连续适应性传30代,观察JEV强、弱毒株在不同细胞上的细胞病变效应（CPE）和第5、10、15、20、25、30代的病毒滴度,结果显示:JEV强、弱株感染BHK-21细胞后的细胞病变效应（CPE）有明显差异,JEV弱毒株出现明显的CPE现象的时间要晚于强毒株;在不同细胞上接种JEV强、弱毒株,随着时间的延长细胞病变的数量会逐渐増加,且Vero细胞的病变特征与BHK-21细胞类似,但Vero细胞的细胞病变没有BHK-21细胞明显,这表明BHK-21细胞比Vero细胞适合该病毒的培养;JEV强弱毒株在BHK-21和Vero细胞上15代以后,病毒滴度维持在一个比较稳定的范围内,病毒含量较为稳定;通过强弱毒株对乳鼠的毒力测定,结果显示强毒（GZ株）比弱毒（SA14-14-2株）的致病性更明显。针对JEV GZ株和SA14-14-2株设计并合成6对特异性引物,利用RT-PCR方法分别从JEV GZ株和SA14-14-2株的细胞培养物的总RNA中扩增出pr M/M、pr M/E和NS1-2A基因,预期大小分别为501 bp、2001 bp和1737 bp,并将其分别克隆至p MD19-T载体,转化至DH5α感受态细胞中,并进行菌液PCR检测、双酶切和测序鉴定,结果表明:乙型脑炎病毒强弱毒株pr M/M、pr M/E和NS1-2A基因的克隆质粒构建成功。将pr M/M、pr M/E和NS1-NS2A基因克隆到pc DNA3.1（+）载体上,得到的重组质粒DNA经酶切鉴定,筛选出符合阅读框的重组质粒,构建重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-r、pc DNA3.1-pr M/E-r、pc DNA3.1-NS1-2A-r、pc DNA3.1-pr M/M-q、pc DNA3.1-pr M/E-q和pc DNA3.1-NS1-2A-q（r表示弱毒SA14-14-2株,q表示强毒GZ株）。通过软件DNAstart（Meg Align）、Ex PASY（Protparam）、DNAstart（Edit Seq）、Prot Scale、DNAstart（Protean）程序和（http://smart.embl-heidelberg.de/）网站,分析目的基因片段序列与氨基酸的差异、蛋白氨基酸序列的理化性质、蛋白疏水性、蛋白的二级结构预测和蛋白跨膜情况。结果发现:弱毒株的pr M/E蛋白与强毒株相比在267-278位多形成一个低复杂区,氨基酸的改变没有影响蛋白结构域。将构建好的重组表达质粒进行转染,间接免疫荧光（IFA）和Western-boltting检测,发现转染24 h后的质粒能通过RT-PCR检测到相应的目的条带,通过间接免疫荧光技术检测到六种真核表达质粒在BHK-21中呈现出特异性绿色荧光,利用Western-boltting检测到约19KDa、72.4KDa和64.4KDa的特异性条带,结果证实真核表达质粒能在BHK-21细胞中表达并具有免疫学活性;将重组质粒对小鼠进行免疫,发现六种重组质粒均能诱导小鼠产生体液免疫,强毒组重组真核质粒在小鼠机体表达产生的免疫效果略优于弱毒组,其中免疫4周,重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-r免疫组和pc DNA3.1-pr M/M-q免疫组差异明显（P<0.05）,免疫6周,pc DNA3.1-pr M/E-q免疫组小鼠分泌的抗体水平极明显高于pc DNA3.1-pr M/E-r免疫组（P<0.01）,pc DNA3.1-NS1-2A-r比pc DNA3.1-NS1-2A-q免疫组小鼠分泌抗体高（P>0.05）。通过小鼠攻毒保护实验发现重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-q、pc DNA3.1-pr M/M-r和pc DNA3.1-pr M/E-r的保护率为30%,重组质粒pc DNA3.1-pr M/E-q和pc DNA3.1-NS1-2A-r的保护率为40%,重组质粒pc DNA3.1-NS1-2A-q的保护率为50%,减活疫苗的保护率为70%,这表明重组表达质粒针对JEV GZ毒株攻击能产生一定的保护效果。
李晨曦[7]（2020）在《基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制》文中提出日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属,能够引起人的中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍等疾病,在自然界中主要是通过蚊虫叮咬进行传播,蚊子是病毒的传播宿主,水禽和猪是病毒主要的扩增宿主。根据病毒E基因序列可将JEV分为五个基因型,即基因I、II、III、IV、V型（GI、II、III、IV、V）。从上世纪30年代到20世纪末,GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐渐替代GⅢ型成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株,而对于基因型转换的分子机制目前尚不清楚。最近研究发现,GⅠ型JEV相对于GⅢ型在水禽宿主中具有适应性的优势,能够引起雏鸭产生滴度更高、持续时间更长的病毒血症,而宿主适应性的差异被认为可能是引起JEV基因型转换的一个重要的原因。为解析GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子基础,本研究首先建立了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统。GⅠ型与GⅢ型JEV基因组全序列的同源性约为88.9%,存在12.3%的差异性,而基因组序列间的差异,限制了酶切位点的选择,为后期GⅠ型与GⅢ型JEV间嵌合病毒的构建带来了困难。为解决这一困难,我们根据GⅠ型与GⅢ型JEV基因组间的保守序列,设计了四对通用型引物,以GⅠ型毒株SH7与GⅢ型毒株SH15的cDNA为模板,分四段扩增出涵盖病毒基因组全长的DNA片段,并在第一段的5’端引入一T7启动子序列,随后将四个片段克隆在低拷贝质粒POK-12上。以构建的低拷贝质粒为模板,扩增出各自的四个片段,随后利用特异的通用型引物,通过两轮Fusion PCR方法分别获得了含有T7启动子序列的GⅠ型与GⅢ型病毒基因组的全长DNA序列,经体外转录并转染BHK细胞,拯救出了病毒粒子rGI与rGIII。经鉴定拯救出的病毒粒子与亲本毒具有相似的复制特性,且在BHK上能够形成大小、形态相似的病毒蚀斑。GI/Ⅲ型JEV PCR-Based反向遗传学系统具有很好的稳定性且易于操作,这为下一步嵌合病毒与定点突变病毒的构建提供了关键性的技术平台。在研究初期发现GⅠ型毒株SH7与SD12相对于GⅢ型毒株SH15与SH19在水禽宿主细胞DEF中能够诱导更低水平IFN-α与IFN-β的表达,使得SH7与SD12毒株在DEF中能够达到更高的病毒复制滴度,并且在雏鸭动物实验中也发现攻毒GI-SH7的雏鸭组相对于攻毒GIII-SH15组,其血清中IFN-α与IFN-β的含量更低,且其病毒血症的滴度更高、持续的时间也更长。但是,这种诱导Ⅰ型干扰素表达差异的现象具有宿主特异性,仅在禽类宿主中发现,而在其他两类宿主细胞ST与bEnd.3中并没有发现诱导IFN-α与IFN-β表达的差异,且不存在病毒复制上的差异,因此GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中特异性的诱导Ⅰ型干扰素表达的能力,决定其宿主适应性的差异。为解析在水禽宿主中诱导Ⅰ型干扰素表达差异的分子机制,我们比较了50株GⅠ型与GⅢ型JEV的全基因组序列,找到了53个具有高度替换率的差异性氨基酸位点,利用建立的PCR-Based反向遗传学系统构建了GⅠ型与GⅢ型JEV间结构蛋白和各个非结构蛋白相互替换的嵌合病毒,结果发现结构蛋白的相互替换并没有改变GⅠ型与GⅢ型病毒的特性,但当非结构蛋白NS5相互替换后,具有GI-NS5蛋白的嵌合病毒rGIII/SH7NS5与亲本毒rGI相似,能够诱导更低水平的IFN-α与IFN-β表达,并且具有复制动力学的优势,同时发现GI-NS5蛋白相对于GIII-NS5蛋白具有更强的拮抗Ⅰ型干扰素表达的能力。而GⅠ型与GⅢ型NS5蛋白间共存在11个氨基酸位点的差异且分布在三个结构域上,进一步构建了NS5蛋白各个结构域相互替换的嵌合病毒,发现NS5蛋白a-a RdRp区域决定着病毒诱导IFN-α与IFN-β的表达能力,具有该区域的嵌合病毒rGI/SH7b-aRdRp、rGIII/SH7a-aRdRp与亲本毒rGI相似,在DEF细胞中能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并且病毒的复制水平更高。NS5蛋白a-aRd Rp区域共存在V372A与H386Y两个氨基酸位点的差异,V372与H386氨基酸位点在GI毒株中高度保守,但A372与Y386氨基酸位点在GⅢ型毒株中保守性较差。为探究关键性的氨基酸位点,构建了V372A或H386Y氨基酸位点的突变病毒,最终发现只有当GⅠ型或GⅢ型JEV NS5蛋白同时存在氨基酸V372与H386时,才能在水禽宿主中具有诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力,并表现出宿主适应性的优势。NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点位于NLS区域,该区域属于一种核定位信号并与NS5蛋白拮抗Ⅰ型干扰素能力相关。而V372A与H386Y两个氨基酸位点决定着NS5蛋白的入核能力,通过实验发现GI-NS5蛋白具有与核转运受体蛋白du KPNA4更强的结合能力,但同时duKPNA4也可与Ⅰ型干扰素转录因子duIRF7结合,这使得GI-NS5蛋白与du IRF7竞争结合duKPNA4的能力更强,从而抑制duIRF7入核起始Ⅰ型干扰素的表达,这也就导致了具有NS5-V372-H386的突变病毒与亲本毒rGI能够诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力。那么,为什么两个氨基酸位点决定着NS5蛋白与duKPNA4的结合能力?利用生物信息学软件分析了两个氨基酸位点在NS5蛋白空间结构上的特点,发现V372A与H386Y各个氨基酸位点形成的氢键排布不同,这可能导致NS5蛋白的NLS柔韧性有所不同。为验证假设,将GⅠ型与GⅢ型NS5-372与-386氨基酸位点进行同性氨基酸替代,结果发现与亲本毒rGI的NS5-372-386位点具有相同氢键特性的突变病毒rGI/V372G-H386K,rGI/V372P-H386R,rGIII/A372G-Y386K和rGIII/A372P-Y386R,其NS5蛋白具有更强的入核能力,能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并表现出对水禽宿主适应性的优势。综上所述,本研究成功的构建了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统,并以此为基础构建了一系列的嵌合病毒与定点突变病毒,最终找到NS5-V372A-H386Y两个氨基酸位点决定着GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽宿主适应性的差异。进一步的研究发现NS5-V372A-H386Y位点决定着NS5蛋白与duIRF7竞争结合duKPNA4的能力,从而影响Ⅰ型干扰素的表达。同时,通过对GI-NS5与GIII-NS5蛋白进行结构模拟分析,发现NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点的氢键排布决定着宿主适应性的差异,并通过对V372A与H386Y位点进行同性氨基酸的替换得到了验证。因此,本研究中从病毒与宿主两个方面解释了GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽具有宿主适应性差异的原因,这为进一步揭示JEV基因型转换的分子机制奠定了理论基础。
王丽[8]（2020）在《BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究》文中提出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的呼吸道症状,腹泻,黏膜糜烂,流产或产出先天缺陷的犊牛等症状,还能引起白细胞减少和免疫抑制。Npro蛋白是ORF中编码的第一种蛋白质,在瘟病毒属中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及参与调控免疫抑制的机理。据报道BVDV Npro蛋白通过蛋白酶体途径降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;转录因子ELF4可形成二聚体入核激活I型IFN启动子,诱导I型IFN产生,并参与机体的抗病毒先天免疫反应。我们前期研究证明:BVDV非结构蛋白Npro通过蛋白酶体途径降解BoELF4,负调控I型干扰素的表达;但是Npro蛋白降解ELF4蛋白过程中的作用机制尚不完全清楚。由此,本研究探讨了BVDV Npro蛋白通过泛素化途径降解ELF4的分子机制,以及筛选了与Npro蛋白互作的蛋白,为深入了解Npro蛋白的功能、BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。首先,本研究构建了pcDNA3.1-Npro真核表达质粒,PCR扩增目的基因,胶回收后,对目的基因及表达载体进行双酶切鉴定,之后进行连接与转化,并将鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1-Npro转染至293T细胞中,通过Western blot验证。结果显示,在23KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致,证明BVDV Npro蛋白真核表达载体构建成功。其次,利用生物信息学软件预测了Npro蛋白与ELF4蛋白的互作及潜在泛素化位点;并利用Co-IP方法验证了两个蛋白的互作关系。结果显示,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4发生共沉淀;BVDV Npro蛋白通过泛素化降解ELF4,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4。以上结果表明,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4存在相互作用,并且BVDV Npro蛋白通过K48位多聚泛素化降解ELF4。最后,将pcDNA3.1-Npro真核表达质粒转染至MDBK细胞中,利用Co-IP方法验证,并将其送去做质谱,对鉴定结果进行GO分析。之后,我们从质谱结果中筛选出25种候选蛋白,重点对Hsp70蛋白进行验证。结果,成功构建了pcDNA3.0-Hsp70真核表达质粒;Co-IP结果显示,BVDV Npro蛋白与Hsp70蛋白发生共沉淀;Hsp70蛋白可以降解BoELF4,当加入Npro质粒时,降解ELF4更加明显。以上结果表明,Hsp70蛋白与Npro蛋白存在相互作用,并且二者可能协同降解ELF4。综上所述,本研究证明了BVDV Npro蛋白与ELF4有相互作用,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4;BVDV Npro蛋白与Hsp70有相互作用,并且二者均能协同降解ELF4;Hsp70在协同降解ELF4中的作用机制有待于进一步研究。本研究为深入了解BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。
张秀娟[9]（2020）在《猪细小病毒及其非结构蛋白NS1和NS2诱导猪胎盘滋养层细胞自噬作用与机制研究》文中进行了进一步梳理猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）主要引起初孕母猪繁殖障碍性疾病,临床表现为流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等特征。研究证实,猪胎盘滋养层细胞（porcine placental trophoblast cells,PTCs）是PPV致病的主要靶细胞,PTCs的功能异常和死亡与繁殖障碍密切相关。近年来,大量研究证实多种病毒的感染、致病与宿主细胞自噬密切相关,但PPV是否诱导宿主细胞自噬,以及PPV及其非结构蛋白在宿主细胞自噬过程中的作用及机制,迄今未见报道。本论文首先以PPV感染PTCs,检测了PPV感染后细胞自噬的水平和特征,进一步探讨了PPV诱导细胞自噬的信号转导通路,以及细胞自噬对PPV复制的影响,最后,系统研究了PPV非结构蛋白NS1和NS2及其宿主互作蛋白在细胞自噬过程中的作用和机制。研究取得以下结果:1. 以PPV感染PTCs,于感染后不同时间点检测细胞自噬水平,western blotting结果显示,与Mock组相比,PPV感染PTCs 12 h后自噬标志分子LC3Ⅱ开始增加,并在感染的24 h、36 h和48 h均显着高于Mock组（p<0.05）。荧光显微镜检测结果显示,PPV感染24 h的PTCs中存在大量代表自噬体的GFP-LC3荧光聚集点。透射电镜观察细胞超微结构显示,PPV感染24 h的PTCs中存在具有双层膜的自噬体囊泡结构。利用自噬流抑制剂CQ和BAF预处理细胞,然后用PPV感染细胞,western blotting结果显示,PPV感染组细胞中LC3Ⅱ水平显着高于Mock组（p<0.05）。对PPV感染48 h内细胞自噬特征进行检测,western blotting结果显示,随着PPV感染时间的延长,细胞中p62累积增加直至48 h开始下降。激光共聚焦检测结果显示,PPV感染24 h的PTCs中存在大量代表自噬体的RFP+GFP+-LC3黄色荧光聚集点,而阳性对照组（EBSS诱导细胞完全自噬）存在大量代表自噬溶酶体的RFP+GFP--LC3红色荧光聚集点,并且,PPV感染组PTCs中大量LC3不能与LAMP1共定位,而EBSS处理组LC3能与LAMP1共定位,证明PPV感染48 h内主要诱导细胞发生不完全自噬。进一步运用激光共聚焦检测PPV感染PTCs 24 h、48 h、72 h后自噬体和自噬溶酶体的形成情况,结果显示,在PPV感染24 h和48 h细胞中存在大量代表自噬体的RFP+GFP+-LC3黄色荧光聚集点,但是随着感染时间延长,在PPV感染72 h细胞中则存在大量代表自噬溶酶体的RFP+GFP--LC3红色荧光聚集点。以上研究结果表明,PPV感染诱导PTCs自噬,在感染的早期（24 h和48 h）主要诱导自噬体的形成,细胞发生了不完全自噬,在感染的后期（72 h）进一步诱导了自噬流的形成,细胞发生了完全自噬。2. 以PPV感染PTCs,western blotting检测细胞自噬相关信号分子,结果显示,PPV感染6 h、12 h、24 h细胞中p-m TOR表达水平均显着低于Mock组（p<0.05）,PPV感染PTCs 6 h后Beclin 1表达水平开始升高,并持续至感染24 h（p<0.01）,提示m TOR可能参与调控PPV诱导的细胞自噬。进一步检测结果显示,m TOR激活分子Rheb能够显着抑制PPV感染引起的自噬相关分子Beclin 1和LC3Ⅱ的表达量升高（p<0.01）。以m TOR上游各信号通路特异性抑制剂处理细胞,western blotting检测各抑制剂对PPV感染细胞中LC3Ⅱ的影响,结果显示,p53、PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2信号通路抑制剂对PPV感染细胞中LC3Ⅱ水平无明显影响（p>0.05）,而AMPK特异性抑制剂Compound C明显降低了PPV感染细胞中LC3Ⅱ水平（p<0.01）。进一步检测结果显示,PPV感染可引起PTCs中磷酸化Raptor水平升高,且AMPK特异性抑制剂Compound C处理能减弱由PPV引起的Raptor磷酸化水平升高。分别以PPV感染野生型和AMPK敲除(AMPK-/-)的PTCs,western blotting结果显示,AMPK-/-细胞中Raptor磷酸化水平降低,Beclin 1和LC3Ⅱ表达水平下降。研究结果表明,PPV感染通过激活AMPK/Raptor信号通路,抑制m TOR活化进而启动细胞自噬。3. 以PPV感染用自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）预处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,RAPA处理组细胞中LC3 II（0,12 h）表达水平、NS1表达水平和PPV DNA拷贝数高于对照DMSO组（p<0.01）。以PPV感染自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,3MA处理组细胞中LC3 II表达水平,NS1表达水平和PPV DNA拷贝数低于对照DMSO组（p<0.05）。以PPV感染用ATG5特异性干扰RNA（si ATG5）处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,si ATG5组细胞中LC3 II表达水平,NS1表达水平和PPV DNA拷贝数低于阴性干扰RNA对照组（si NC）（p<0.05）。研究结果表明利用自噬诱导剂诱导细胞自噬能增加PPV在细胞中的复制水平,利用自噬抑制剂或下调ATG5抑制细胞自噬能降低PPV在细胞中的复制水平。4. 利用紫外灭活的PPV（UVPPV,失去复制能力,但含有PPV结构蛋白）感染PTCs,western blotting结果显示,UVPPV感染细胞中随着感染剂量的增加和感染时间的延长LC3Ⅱ呈上升趋势,p62蛋白水平在感染24 h开始下降,并在36 h、48 h持续下降;自噬流抑制剂CQ和BAF处理组的UVPPV感染细胞中LC3Ⅱ和p62水平显着高于未处理组（p<0.05）;激光共聚焦结果显示,在24 h.p.i.,UVPPV感染细胞中有大量的RFP+GFP--LC3红色荧光聚集点,说明UVPPV能诱导自噬溶酶体形成。分别以PPV的非结构蛋白NS1、NS2转染PTCs后,再以UVPPV感染,western blotting结果显示,过表达NS1明显抑制了UVPPV感染细胞中p62的降解。NS1梯度转染后以UVPPV感染PTCs,western blotting和激光共聚焦检测结果显示,随着NS1转染量的增加,细胞内p62逐渐积累增多,细胞中自噬体（RFP+GFP+-LC3黄色荧光聚集点）增加,自噬溶酶体形成减少。上述结果表明,PPV NS1能够抑制UVPPV诱导的完全自噬,提示PPV NS1在PPV诱导PTCs不完全自噬中发挥关键作用。进一步在NS1定量转染的细胞中,以NS2梯度转染后再以UVPPV感染,激光共聚焦检测显示,在NS1单转染的细胞中,UVPPV感染后主要诱导自噬体（RFP+GFP+黄色荧光聚集点）的形成,但随着NS2转染量的增加,细胞内自噬溶酶体（RFP+GFP-红色荧光聚集点）形成逐步增加。以上研究结果表明,UVPPV感染诱导PTCs形成完全自噬,NS1在PPV诱导细胞形成不完全自噬中发挥重要作用,而NS2在诱导细胞不完全自噬向完全自噬转化过程中发挥关键作用。5. 通过IP串联质谱法筛选NS1的宿主互作蛋白,CO-IP和GST-pull down鉴定出RAB2A是NS1的直接互作蛋白。进一步鉴定RAB2A和NS1的互作方式,CO-IP和激光共聚焦鉴定结果显示,在PPV感染过程中NS1能与RAB2A互作,NS1和RAB2A存在共定位,NS1 N端1 aa～86 aa（NS1与NS2的共有区域）能与RAB2A共定位;等温滴定量热法检测结果显示,NS1 N端1 aa～86 aa能与RAB2A直接互作。对NS2与RAB2A的相互作用鉴定,激光共聚焦检测结果显示NS2和RAB2A存在共定位。通过IP串联质谱法筛选NS2的宿主互作蛋白,再通过CO-IP和GST-pull down鉴定出VAMP7是NS2的直接互作蛋白。进一步鉴定VAMP7和NS2的互作方式,CO-IP和激光共聚焦鉴定结果显示,在PPV感染过程中NS2能与VAMP7互作,NS2和VAMP7存在共定位,NS2 87 aa～161 aa与VAMP7存在共定位;等温滴定量热法检测结果显示,NS287 aa～161 aa能与VAMP7直接互作。6. 对RAB2A和VAMP7相互作用进行鉴定,CO-IP结果显示,UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7发生了互作,转染NS1抑制了RAB2A与VAMP7的互作;激光共聚焦检测结果显示,UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7存在共定位,转染NS1后RAB2A与VAMP7不能共定位。对PPV感染过程中RAB2A和VMP7的互作进行鉴定,激光共聚焦检测结果显示PPV感染早期（24 h）RAB2A不能与VAMP7共定位,PPV感染后期（72 h）RAB2A能与VAMP7共定位,虽然转染NS1抑制了UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7的共定位,但在此基础上转染NS2又使RAB2A能与VAMP7共定位。NS2能与RAB2A和VAMP7共定位。进一步通过CO-IP和激光共聚焦技术对NS1、NS2与RAB2A的互作区域进行筛选鉴定,结果显示,NS1、NS2的1aa～43 aa是其与RAB2A的互作区域,其中-10EVLK14-位点是相互作用所必需的。构建-10EVLK14-位点突变的突变毒株△NSPPV,real time Q-PCR检测结果显示,72 h.p.i.△NSPPV在PTCs中病毒拷贝数低于PPV野生型病毒（p<0.05）;western blotting和激光共聚焦检测结果显示,△NSPPV感染诱导细胞中LC3Ⅱ水平升高,感染早期和后期细胞中均形成大量自噬溶酶体。上述研究结果表明PPV NS1通过N端的1 aa～43 aa共有区域与宿主蛋白RAB2A直接互作,抑制RAB2A与VAMP7互作介导的自噬体与溶酶体融合,从而在PPV感染早期诱导细胞形成不完全自噬中发挥重要作用。PPV NS2既与RAB2A互作,也与VAMP7互作,促进RAB2A与VAMP7互作介导的自噬体与溶酶体融合,从而在PPV感染后期（72 h）诱导细胞由不完全自噬向完全自噬转化。本研究发现,PPV感染早期（24 h和48 h）主要诱导PTCs形成不完全自噬,后期（72 h）主要诱导细胞形成完全自噬。阐明了PPV通过激活AMPK/m TOR信号通路诱导PTCs自噬的分子机制。进一步研究发现PPV感染通过诱导细胞自噬促进其自身复制。本研究还发现,在PPV感染早期非结构蛋白NS1通过与宿主蛋白RAB2A互作进而阻止自噬体与溶酶体的融合,细胞发生不完全自噬。在感染后期非结构蛋白NS2通过与NS1、宿主蛋白RAB2A和VAMP7互作进而介导自噬体与溶酶体的融合,促进细胞发生完全自噬。鉴定出PPV非结构蛋白NS与RAB2A互作的关键位点（10EVLK14）,并获得了诱导细胞完全自噬、且复制能力和致病能力低于野生型PPV的突变毒株（△NSPPV）。本论文研究结果阐明了PPV及其非结构蛋白NS1、NS2在诱导PTCs自噬过程中的作用和调控机制,为进一步揭示PPV的致病机制提供依据。
赵彩权[10]（2019）在《日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究》文中研究说明黄病毒科病毒是一类单链正义RNA病毒,可引起多种重要的人和动物传染病。该家族的许多成员是虫媒病毒,通过蚊子和蜱等节肢动物作为载体进行传播。日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）、寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV）是对人类健康产生重大影响的黄病毒属病毒。有研究表明,真核生物miRNA在病毒的复制和传播中起重要作用。宿主miRNA的表达和靶向结合病毒基因组能够参与细胞的抗病毒免疫反应。很多时候,宿主miRNA在病毒的生命周期中通过复杂的调控途径来促进或抑制其对宿主的感染。miRNA也可以由病毒基因组编码并在宿主细胞中表达,病毒miRNA可以与宿主miRNA拥有共同的序列,或者具有完全不同的序列。因此,黄病毒科病毒调控宿主miRNA的表达和功能对疾病的发生具有极其重要的作用。黄病毒科病毒调控miRNA产生的研究报道已有很多,但通过其NS3的解旋酶功能对miRNA产生调控的研究还未见报道。在本研究中,首先我们通过高通量测序数据分析感染日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）的鼠脑组织和小鼠神经元细胞,发现JEV感染后导致宿主细胞中整体miRNA的表达水平发生下调。我们通过添加转录抑制剂Favipiravir（T-705）、α-鹅膏蕈碱（α-Amanitin）和翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）的实验发现,宿主miRNA表达下调是由于JEV感染后翻译的蛋白质所导致的。为了进一步确定哪种病毒蛋白调控宿主miRNA的降解,我们构建了表达JEV结构蛋白（E、C、PrM）和非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）的10种pcDNA3.1表达载体。将这10种载体分别转染NA细胞,待48 h后检测其对宿主细胞miR-466d-3p表达的影响,发现JEV的NS3能够显着下调miR-466d-3p的表达。随后构建了其他黄病毒科病毒NS3的表达载体,发现ZIKV、WNV、DENV1、CSFV和HCV都能够不同程度的下调miR-466d-3p的表达。通过NS3的siRNA抑制试验以及病毒NTPase和解旋酶化学抑制剂DRB（5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-1H-benzimidazole）和伊维菌素（Ivermectin,IVER）处理发现NS3的解旋酶活性能够下调宿主miRNA的表达。已有研究表明,阻碍RISC沉默复合体蛋白Dicer和Argonaute蛋白的活性会抑制miRNA的顺利产生。我们利用qRT-PCR的方法检测了RISC中主要组成蛋白基因的表达。结果显示组成RISC沉默复合体蛋白的表达在JEV感染后均发生了不同程度的上调,表明JEV NS3不是通过影响RISC沉默复合体的活性来抑制宿主神经元细胞miRNA的表达。其次,通过解旋酶阻断试验和miRNA体外双链解旋试验的结果表明,NS3可以导致pre-miR-466d的双链结构解开并导致成熟miRNA功能异常。通过建模和RNA免疫沉淀实验,我们发现NS3解旋酶区域的精氨酸富集结构域对premiRNA的结合和宿主miRNA的降解至关重要。对NS3解旋酶区域精氨酸富集结构域保守氨基酸位点定点突变的实验结果显示,R226G和R202W显着降低了与pre-miR-466d的结合和降解能力。综上所述,黄病毒属病毒NS3的解旋酶功能对宿主细胞miRNA的产生具有至关重要的调控作用,为揭示病毒和宿主miRNA的相互作用和抗病毒免疫反应提供了新的途径。
二、登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析（论文提纲范文）
（1）ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.2 蓝舌病病毒研究进展 |
| 1.2.1 BTV的结构特征 |
| 1.2.2 BTV编码蛋白的功能 |
| 1.2.3 BTV的复制过程 |
| 1.3 蓝舌病病毒与先天免疫 |
| 1.3.1 ISG概述 |
| 1.3.2 ISG对干扰素通路的调节 |
| 1.3.3 ISG对病毒增殖的影响 |
| 1.3.4 ISG15 与病毒感染研究进展 |
| 1.3.5 ISG20 与病毒感染研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 细胞与毒株 |
| 2.1.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.1.3 细胞培养相关材料 |
| 2.1.1.4 荧光定量PCR相关材料 |
| 2.1.1.5 质粒构建相关试剂及溶液配制 |
| 2.1.1.6 细胞转染及RNA干扰相关试剂 |
| 2.1.1.7 免疫印迹相关试剂及溶液配制 |
| 2.1.1.8 激光共聚焦相关试剂及溶液的配制 |
| 2.1.1.9 抗体 |
| 2.1.1.10 分子生物学软件及数据分析 |
| 2.1.1.11 其他试剂材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 细胞制备及培养相关实验 |
| 2.1.2.2 BTV感染细胞及总RNA提取 |
| 2.1.2.3 反转录及荧光定量PCR |
| 2.1.2.4 基因克隆 |
| 2.1.2.5 真核表达质粒的构建 |
| 2.1.2.6 基因的过表达及RNA干扰实验 |
| 2.1.2.7 免疫印迹 |
| 2.1.2.8 相对荧光定量PCR实验 |
| 2.1.2.9 噬斑试验 |
| 2.1.2.10 间接免疫荧光实验 |
| 2.1.2.11 免疫共沉淀 |
| 2.1.2.12 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 ISG15对BTV复制作用的机制研究 |
| 2.2.2.1 BTV感染刺激ISG15 转录水平升高 |
| 2.2.2.2 ISG15 单体过表达促进BTV复制 |
| 2.2.2.3 干扰内源性ISG15 抑制 BTV复制 |
| 2.2.2.4 ISG15 与病毒蛋白的共定位及相互作用 |
| 2.2.2.5 ISG15 促进VP4和NS1 蛋白的表达 |
| 2.2.2.6 过表达ISG15 提高VP4和NS1 蛋白的稳定性 |
| 2.2.2.7 泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径参与VP4 和NS1 的降解 |
| 2.2.3 ISG20对BTV复制作用的机制研究 |
| 2.2.3.1 BTV感染刺激ISG20 转录 |
| 2.2.3.2 ISG20 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.3.3 过表达ISG20 抑制BTV增殖 |
| 2.2.3.4 干扰内源性ISG20 促进BTV复制 |
| 2.2.3.5 ISG20 与病毒蛋白的共定位及互作分析 |
| 2.2.3.6 突变型ISG20对BTV复制的抑制作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ISG15对BTV复制作用及机制研究 |
| 2.3.2 ISG20 抑制BTV增殖及机制研究 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）宿主蛋白COPε在猪细小病毒感染过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪细小病毒宿主互作蛋白及外被体蛋白I研究进展 |
| 1.1 猪细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.1.1 唾液酸受体 |
| 1.1.2 自噬相关蛋白 |
| 1.1.3 微小染色体维持蛋白 |
| 1.1.4 核内不均一核糖核蛋白 |
| 1.2 宿主蛋白COP I研究进展 |
| 1.2.1 COP I的结构与功能 |
| 1.2.2 COP I在疾病发生发展过程中的作用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪细小病毒NS1 宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PPV NS1 宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 备选蛋白真核表达载体构建与鉴定 |
| 2.2.3 激光共聚焦检测备选蛋白与NS1 相互作用 |
| 2.2.4 免疫共沉淀、激光共聚焦鉴定NS1和COPε外源性互作 |
| 2.2.5 免疫共沉淀、激光共聚焦鉴定NS1和COPε内源性互作 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPV NS1 宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.3.2 备选蛋白真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 激光共聚焦检测备选蛋白与NS1 相互作用 |
| 2.3.4 免疫共沉淀、激光共聚焦鉴定NS1和COPε外源性互作 |
| 2.3.5 免疫共沉淀、激光共聚焦鉴定NS1和COPε内源性互作 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主蛋白COPε在猪细小病毒感染过程中作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 干扰copε表达对PPV复制的影响 |
| 3.2.2 copε敲除PK-15 细胞系构建 |
| 3.2.3 copε敲除对细胞生长活性以及PPV复制的影响 |
| 3.2.4 copε过表达PK-15 细胞系构建 |
| 3.2.5 copε过表达对细胞生长活性以及PPV复制的影响 |
| 3.2.6 COPε与 NS1 相互作用结构域检测 |
| 3.2.7 NS1 突变载体构建与鉴定 |
| 3.2.8 NS1与COPε互作氨基酸基序鉴定 |
| 3.2.9 NS1与COPε互作缺陷型病毒的拯救和鉴定 |
| 3.2.10 NS1与COPε互作位点突变对PPV复制的影响 |
| 3.3.11 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 干扰copε表达对PPV复制的影响 |
| 3.3.2 copε敲除PK-15 细胞系构建 |
| 3.3.3 copε敲除对细胞生长活性及PPV复制的影响 |
| 3.3.4 copε过表达PK-15 细胞系构建 |
| 3.3.5 copε过表达对细胞生长活性以及PPV复制的影响 |
| 3.3.6 COPε与 NS1 相互作用结构域检测 |
| 3.3.7 NS1 突变载体构建与鉴定 |
| 3.3.8 NS1与COPε互作氨基酸基序鉴定 |
| 3.3.9 NS1与COPε互作缺陷型病毒的拯救和鉴定 |
| 3.3.10 NS1与COPε互作位点突变对PPV复制的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主蛋白COPε在猪细小病毒感染过程中作用机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 copε敲除对PPV感染产生IFN-β的影响 |
| 4.2.2 PPV感染PK-15~(copε-/-)后调控IFN-β产生的关键信号分子表达的检测 |
| 4.2.3 NS1与COPε互作缺陷型病毒感染对PK-15 细胞IFN-β产生的影响 |
| 4 2.4 NS1与COPε互作缺陷型病毒感染PK-15 细胞后调控IFN-β产生的关键信号分子表达的检测 |
| 4.2.5 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 copε敲除对PPV感染PK-15 细胞IFN-β产生的影响 |
| 4.3.2 PPV感染PK-15~(copε-/-)后调控IFN-β产生的关键信号分子表达的检测 |
| 4.3.3 NS1与COPε互作缺陷型病毒感染对PK-15 细胞IFN-β产生的影响 |
| 4.3.4 NS1与COPε互作缺陷型病毒感染PK-15 细胞后调控IFN-β产生的关键信号分子表达的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 主要缩略词 |
| 第一篇 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 西尼罗病毒病概述 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 病理变化 |
| 2.5 致病机制 |
| 2.6 诊断 |
| 2.7 防治措施 |
| 3 西尼罗病毒病疫苗研究进展 |
| 4 黄病毒科病毒反向遗传学技术 |
| 4.1 黄病毒科病毒反向遗传系统的发展概述 |
| 4.2 黄病毒科病毒反向遗传系统的构建策略 |
| 4.3 黄病毒科病毒反向遗传操作系统构建的难点 |
| 4.4 黄病毒科病毒反向遗传操作系统的应用 |
| 5 主要研究内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 流行性乙型脑炎病毒全长序列测定与比对 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与细菌 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2单克隆制备 |
| 2.2 JEV SA14-14-2 cDNA制备 |
| 2.3 JEVSA14-14-2测序引物设计 |
| 2.4 目的基因扩增 |
| 2.5 重组质粒构建与鉴定 |
| 2.6 测序与比对序列 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒蚀斑筛选结果 |
| 3.2 目的基因扩增结果 |
| 3.3 重组质粒鉴定结果 |
| 3.4 全基因组序列比对结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 流行性乙型脑炎病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2反向遗传操作系统构建策略 |
| 2.2 pACYC177载体改造 |
| 2.3 JEVSA14-14-2引物设计 |
| 2.4 JEV cDNA各片段扩增 |
| 2.5 JEVSA14-14-2感染性克隆构建 |
| 2.6 病毒拯救 |
| 2.7 拯救病毒的生物学特性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 载体改造及各片段扩增结果 |
| 3.2 JEVSA14-14-2感染性克隆鉴定结果 |
| 3.3 拯救病毒生物学特性鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 感染性克隆构建过程中存在的问题 |
| 4.2 感染性克隆各元件作用 |
| 4.3 体外转录体系和体内转录体系比较 |
| 5 小结 |
| 第三章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的构建及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与感染性克隆 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 pChiVax-WN01感染性克隆构建 |
| 2.2 ChiVax-WN01病毒拯救 |
| 2.3 ChiVax-WN01生物学特性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 KLM片段扩增与鉴定 |
| 3.2 pACYC177-KLM和pChiVax-WN01构建与鉴定 |
| 3.3 ChiVax-WN01病毒拯救与生物学特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黄病毒多聚蛋白切割位点 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01生物学特性 |
| 4.3 内含子对病毒拯救的影响 |
| 4.4 体外转录系统和体内转录系统比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 器具 |
| 2 方法 |
| 2.1 神经侵袭性试验 |
| 2.2 神经毒性试验 |
| 2.3 体重及体温变化试验 |
| 2.4 病毒在小鼠体内分布试验 |
| 2.5 微量中和试验 |
| 2.6 ELISpot IFN-γ、IL-2和IL-4试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 神经侵袭性试验 |
| 3.2 神经毒性试验 |
| 3.3 体重和体温 |
| 3.4 病毒内脏分布 |
| 3.5 微量中和试验 |
| 3.6 IFN-γ、IL-2和IL-4酶联免疫斑点试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的安全性 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的免疫原性 |
| 4.3 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01神经毒性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 文献综述 |
| 第一章 宿主蛋白Syncrip和 MCM在病毒复制过程中作用及机制研究进展 |
| 1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接过程中作用及机制 |
| 1.1.2 可变剪接在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.3 Syncrip在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2 MCM在宿主细胞DNA复制和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2.1 MCM在宿主细胞DNA复制过程中作用及机制 |
| 1.2.2 MCM在病毒复制过程中作用及机制 |
| 第二章 细小病毒与宿主蛋白互作机制研究进展 |
| 2.1 细小病毒概述 |
| 2.2 细小病毒与宿主蛋白互作机制 |
| 2.2.1 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒粘附和侵入过程中作用 |
| 2.2.2 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用 |
| 2.2.3 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒出核过程中作用 |
| 2.3 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪细小病毒非结构蛋白NS多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.2.2 重组质粒p ET-32a-NS构建和鉴定 |
| 3.2.3 NS重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 NS重组蛋白的诱导表达条件优化 |
| 3.2.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.2.6 NS蛋白多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 NS蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 3.2.8 NS蛋白多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.3.2 重组质粒p ET-32a-NS的构建和鉴定 |
| 3.3.3 NS重组蛋白的诱导表达检测 |
| 3.3.4 NS重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 鼠抗NS血清抗体的效价测定 |
| 3.3.7 多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 稳定携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆构建及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPV的增殖及病毒滴度检测 |
| 4.2.2 p KQLL(F1+F2)质粒的构建 |
| 4.2.3 PPV全长感染性克隆质粒的构建 |
| 4.2.4 病毒拯救及鉴定 |
| 4.2.5 拯救病毒的遗传稳定性检测 |
| 4.2.6 拯救病毒的复制特性检测 |
| 4.2.7 拯救病毒诱导凋亡特性检测 |
| 4.2.8 动物试验验证 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV病毒滴度的测定 |
| 4.3.2 PPV全长感染性克隆质粒的构建和鉴定 |
| 4.3.3 拯救病毒的鉴定 |
| 4.3.4 拯救病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 4.3.5 拯救病毒的复制特性 |
| 4.3.6 拯救病毒诱导凋亡特性的鉴定 |
| 4.3.7 动物试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪细小病毒NS1-m RNA关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 NS1-m RNA的生物素化标记 |
| 5.2.2 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.2.3 syncrip基因的克隆、真核表达以及原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 RNA-pulldown检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.5 RIP检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.6 荧光原位杂交(Fish)检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.7 EMSA检测NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.3.3 RNA-pulldown鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.4 RIP鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.5 荧光原位杂交(Fish)鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.6 EMSA鉴定NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 宿主蛋白Syncrip在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 干扰syncrip基因的表达对PPV复制的影响 |
| 6.2.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.2.3 syncrip基因敲除对PPV复制的影响 |
| 6.2.4 syncrip基因敲除对NS2 表达的影响 |
| 6.2.5 PPV ns2 缺失型感染性克隆的构建及ns2 缺失对PPV复制的影响 |
| 6.2.6 PPV对 Syncrip表达的调控 |
| 6.2.7 检测Syncrip过表达对NS1 表达的影响 |
| 6.2.8 ns2剪接位点突变载体的构建 |
| 6.2.9 检测Syncrip调控NS1-m RNA表达的方式 |
| 6.2.10 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 干扰syncrip基因的表达显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.3.3 syncrip基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.4 syncrip基因敲除显着抑制NS2 的表达 |
| 6.3.5 PPVns2缺失型感染性克隆的鉴定 |
| 6.3.6 PPV的复制水平与Syncrip的表达水平呈正相关 |
| 6.3.7 Syncrip能够促进NS1 的剪切 |
| 6.3.8 ns2剪接位点突变载体的鉴定 |
| 6.3.9 Syncrip通过作用于ns1上ns2的3’末端调控ns2 剪接 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 猪细小病毒VP2关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 vp2基因的克隆、原核表达载体及真核表达载体的构建 |
| 7.2.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.2.3 mcm3基因的克隆、原核表达载体与真核表达载体的构建 |
| 7.2.4 免疫共沉淀(Co-IP)检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.2.5 间接免疫荧光检测VP2和MCM3的互作 |
| 7.2.6 GST-pulldown和 His-pulldown检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 VP2原核表达载体和真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.3.3 MCM3原核表达载体与真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.4 Co-IP鉴定VP2和MCM3 互作 |
| 7.3.5 间接免疫荧光鉴定VP2和MCM3互作 |
| 7.3.6 GST-pulldown和 His-pulldown鉴定VP2和MCM3 的互作 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 VP2及其互作蛋白MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器设备 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 干扰vp2基因表达对PPV复制的影响 |
| 8.2.2 mcm3基因敲除细胞系的构建 |
| 8.2.3 mcm3 基因敲除对PPV复制的影响 |
| 8.2.4 VP2截短体原核表达载体的构建 |
| 8.2.5 VP2和MCM3互作结构域的检测 |
| 8.2.6 NS1真核表达载体的构建 |
| 8.2.7 检测VP2/NS1/MCM3和PPV DNA互作 |
| 8.2.8 DNA-pulldown检测VP2、NS1、MCM3和PPV DNA的互作 |
| 8.2.9 NS1与MCM3互作的检测 |
| 8.2.10 VP2 与病毒DNA及 MCM3 之间互作的检测 |
| 8.2.11 VP2与PPV基因组DNA结合基序的检测 |
| 8.2.12 VP2结合基序突变型PPV的构建及对病毒复制的影响 |
| 8.2.13 数据分析 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 干扰vp2基因表达显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.2 mcm3 基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.3 VP2截短体原核表达载体的鉴定 |
| 8.3.4 VP2的115 aa~231 aa是其与宿主蛋白MCM3 发生互作的关键结构域 |
| 8.3.5 NS1真核表达载体的鉴定 |
| 8.3.6 在PPV复制过程中VP2/NS1/MCM3 与病毒DNA存在互作 |
| 8.3.7 VP2和NS1在PPV复制过程中与病毒DNA存在直接互作 |
| 8.3.8 NS1 不参与招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.9 VP2 负责招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.10 VP2 结合于PPV基因组DNA的300 nt~356 nt基序 |
| 8.3.11 突变PPV基因组DN A的 VP2 结合基序完全阻止病毒DNA的复制. |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）JEV强、弱株prM/M、prM/E和NS1-NS2A基因真核表达及其免疫效果初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 日本乙型脑炎的病原学 |
| 1.1 日本乙型脑炎的分类 |
| 1.2 日本乙型脑炎的形态、理化与生物特性 |
| 2 日本乙型脑炎的分子生物学特性 |
| 3 日本乙型脑炎的流行病学 |
| 4 日本乙型脑炎的致病机理 |
| 5 日本乙型脑炎的临床症状与诊断 |
| 5.1 日本乙型脑炎的临床症状 |
| 5.2 日本乙型脑炎的诊断 |
| 6 日本乙型脑炎疫苗研究进展 |
| 7 研究目的与意义 |
| 第二章 JEV强、弱株prM/M、prM/E和 NS1-NS2A基因的克隆 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、毒株、实验动物及菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 使用试剂的配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEV强弱毒株的增殖及其TCID50 测定 |
| 2.1.1 BHK-21 细胞与Vero细胞的培养 |
| 2.1.2 细胞接毒 |
| 2.1.3 乳鼠脑内接毒 |
| 2.1.4 JEV强弱毒株TCID50 测定 |
| 2.1.5 JEV强弱毒株不同代次在BHK-21 细胞上的増殖 |
| 2.1.6 JEV强弱毒株不同代次在Vero细胞上的増殖 |
| 2.2 JEV强弱毒株基因组的扩增与克隆 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.3 病毒的RT-PCR反应 |
| 2.2.4 目的基因纯化 |
| 2.2.5 pMD19-T载体与目的片段的连接与转化 |
| 2.2.6 菌液PCR |
| 2.2.7 质粒制备 |
| 2.2.8 重组克隆质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2.9 测序与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 JEV强弱毒株的增殖及其TCID50 测定结果 |
| 3.1.1 BHK-21和Vero细胞的接毒情况 |
| 3.1.2 乳鼠脑内接毒结果 |
| 3.1.3 JEV强弱毒株TCID50 测定结果 |
| 3.1.4 JEV强弱毒株不同代次在BHK-21 细胞上的増殖 |
| 3.1.5 JEV强弱毒株不同代次在Vero细胞上的増殖 |
| 3.2 RT-PCR产物扩增结果 |
| 3.2.1 prM/M基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.2 prM/E基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.3 NS1-2A基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.3 重组克隆质粒菌液检测结果 |
| 3.3.1 JEV强弱毒株重组质粒pMD19-T-prM/M菌液PCR结果 |
| 3.3.2 JEV强弱毒株重组质粒pMD19-T-prM/E菌液PCR结果 |
| 3.3.3 JEV强弱毒株重组质粒pMD19-T-NS1-2A菌液PCR结果 |
| 3.4 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.4.1 重组质粒pMD19-T-prM/M双酶切鉴定结果 |
| 3.4.2 重组质粒pMD19-T-prM/E双酶切鉴定结果 |
| 3.4.3 重组质粒pMD19-T-NS1-2A双酶切鉴定结果 |
| 3.5 重组质粒序列测序 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 JEV强、弱株prM/M、prM/E和 NS1-NS2A蛋白的真核表达及免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种、载体、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 真核表达载体的质粒提取 |
| 2.2 克隆质粒与真核表达载体的双酶切 |
| 2.3 目的基因与载体的连接 |
| 2.4 重组质粒转化 |
| 2.5 重组表达质粒的菌液检测 |
| 2.6 重组表达质粒的双酶切鉴定并进行序列分析 |
| 2.7 多克隆抗体制备 |
| 2.8 重组真核质粒的制备 |
| 2.9 重组表达质粒的转染 |
| 2.10 间接荧光免疫(IFA) |
| 2.11 重组蛋白的Western-boltting检测 |
| 2.11.1 细胞总蛋白提取 |
| 2.11.2 SDS-PAGE电泳 |
| 2.11.3 转膜 |
| 2.11.4 免疫印迹 |
| 2.12 动物免疫试验 |
| 2.12.1 免疫小鼠抗体水平检测 |
| 2.12.2 小鼠攻毒模型的建立 |
| 2.12.3 小鼠免疫攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒菌液PCR鉴定结果 |
| 3.1.1 重组表达质粒pcDNA3.1-prM/M菌液PCR鉴定结果 |
| 3.1.2 重组表达质粒pcDNA3.1-prM/E菌液PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 重组表达质粒pcDNA3.1-NS1-2A菌液PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组表达质粒双酶切鉴定结果 |
| 3.2.1 重组表达质粒pcDNA3.1-prM/M双酶切鉴定结果 |
| 3.2.2 重组表达质粒pcDNA3.1-prM/E双酶切鉴定结果 |
| 3.2.3 重组表达质粒pcDNA3.1-NS1-2A双酶切鉴定结果 |
| 3.3 JEV强弱毒株prM/M、prM/E和 NS1-2A基因的生物信息学分析结果 |
| 3.3.1 JEV强弱毒株prM/M、prM/E和 NS1-2A基因序列分析的结果 |
| 3.3.2 JEV强弱毒株prM/M、prM/E和 NS1-2A蛋白理化性质分析的结果 |
| 3.3.3 JEV强弱毒株prM/M、prM/E和 NS1-2A蛋白二级结构的分析结果 |
| 3.3.4 JEV强弱毒株prM/M、prM/E和 NS1-2A蛋白的蛋白结构域的预测结果 |
| 3.4 重组真核表达质粒在BHK-21细胞中的表达 |
| 3.5 重组蛋白的Western-Blotting分析 |
| 3.5.1 重组蛋白pcDNA3.1-prM/M的Western-Blotting |
| 3.5.2 重组蛋白pcDNA3.1-prM/E的Western-Blotting |
| 3.5.3 重组蛋白pcDNA3.1-NS1-2A的Western-Blotting |
| 3.6 免疫小白鼠血清IgG抗体检测结果 |
| 3.6.1 重组质粒pcDNA3.1-prM/M特异性抗体检测结果 |
| 3.6.2 重组质粒pcDNA3.1(+)-prM/E特异性抗体检测结果 |
| 3.6.3 重组质粒pcDNA3.1(+)-NS1-2A特异性抗体检测结果 |
| 3.6.4 小鼠的攻毒模型建立的结果 |
| 3.6.5 重组质粒免疫小鼠的攻毒保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（7）基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型脑炎概述 |
| 1.1.1 乙型脑炎流行病学特征 |
| 1.1.2 乙型脑炎的临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 乙型脑炎的防控措施 |
| 1.2 乙型脑炎病毒 |
| 1.2.1 乙型脑炎病毒的形态、理化及生物特性 |
| 1.2.2 乙型脑炎病毒基因组结构及其功能 |
| 1.2.3 乙型脑炎病毒复制周期 |
| 1.2.4 乙型脑炎病毒基因型分布及基因型转换 |
| 1.3 黄病毒感染性克隆研究进展 |
| 1.4 乙型脑炎病毒反向遗传学系统的应用 |
| 1.5 黄病毒逃逸天然免疫的分子机制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 GⅠ型与GⅢ型 JEV PCR-Based反向遗传学系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 病毒的扩增 |
| 2.1.5 病毒RNA的提取 |
| 2.1.6 GⅠ型与GⅢ型 JEV第一链c DNA合成 |
| 2.1.7 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组的分段克隆 |
| 2.1.8 GⅠ型与GⅢ型 JEV全长c DNA的克隆 |
| 2.1.9 病毒的拯救 |
| 2.1.10 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.1.11 拯救病毒的多步生长曲线 |
| 2.1.12 病毒蚀斑试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GI与 GⅢ型 JEV基因组序列的同源性分析及引物保守型分析 |
| 2.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组分段扩增与克隆 |
| 2.2.3 病毒全长cDNA扩增 |
| 2.2.4 rGI与rGIII JEV的拯救与鉴定 |
| 2.2.5 被拯救病毒与亲本毒生长特性的比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GI与 GⅢ型 JEV在水禽宿主中诱导IFN-I表达的差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 3.1.5 RNA提取与反转录 |
| 3.1.6 荧光定量PCR检测Ⅰ型干扰素表达 |
| 3.1.7 ELISA方法检测Ⅰ型干扰素的表达量 |
| 3.1.8 细胞上清中病毒滴度测定 |
| 3.1.9 细胞中病毒蛋白水平测定 |
| 3.1.10 雏鸭动物实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三种细胞感染JEV后间接免疫荧光验证 |
| 3.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导Ⅰ型干扰素表达的差异 |
| 3.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV在宿主细胞中病毒滴度的测定 |
| 3.2.5 GⅠ型与GⅢ型 JEV在雏鸭体内诱导干扰素表达的差异 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导水禽宿主IFN-I表达差异的分子基础 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV氨基酸序列的比对分析 |
| 4.1.5 嵌合病毒与定点突变病毒的构建 |
| 4.1.6 嵌合病毒与定点突变病毒在DEF中诱导IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.7 嵌合病毒与定点突变病毒复制动力学分析 |
| 4.1.8 嵌合病毒与定点突变病毒的空斑形成试验 |
| 4.1.9 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白拮抗IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.10 小鼠动物实验 |
| 4.1.11 雏鸭动物实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV差异性氨基酸位点分析 |
| 4.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV间结构蛋白相互替换嵌合病毒的构建及拯救 |
| 4.2.3 结构蛋白相互替换的嵌合病毒诱导Ⅰ型干扰素能力分析 |
| 4.2.4 结构蛋白相互替换的嵌合病毒复制动力学分析 |
| 4.2.5 非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B/NS3、NS4A/NS4B、NS5 相互替换的嵌合病毒构建 |
| 4.2.6 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.7 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型 JEV在 DEF细胞中的复制优势 |
| 4.2.8 NS5-a-a Rd Rp区域决定GI与 GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.9 NS5-a-a Rd Rp区域决定GⅠ型 JEV在 DEF中的复制优势 |
| 4.2.10 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中诱导IFN-表达的差异 |
| 4.2.11 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中复制差异. |
| 4.2.12 NS5-V372A-H386Y位点突变不改变病毒对小鼠的毒力 |
| 4.2.13 NS5-372V-386H位点决定GⅠ型 JEV在雏鸭宿主中适应性的优势 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 NS5-V372A-H386Y决定水禽宿主IFN-I表达差异的分子机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 细胞核与细胞质蛋白分离 |
| 5.1.5 鸭源核转运受体蛋白与鸭源IRF7分子的克隆表达 |
| 5.1.6 鸭源核转运受体蛋白与JEVNS5蛋白分子的互作 |
| 5.1.7 鸭源核转运受体蛋白与duIRF7分子的互作 |
| 5.1.8 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4与du IRF7 共定位实验 |
| 5.1.9 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4对Ⅰ型干扰素表达的作用 |
| 5.1.10 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5-372 与386 位点的同性氨基酸替代 |
| 5.1.11 NS5-372-386 位点突变病毒的诱导IFN-I表达能力分析 |
| 5.1.12 NS5-372-386位点突变病毒的复制动力学分析 |
| 5.1.13 NS5-372-386位点突变病毒的空斑形成试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白核定位能力分析 |
| 5.2.2 GⅠ型与GⅢ型 NS5 蛋白与du KPNA2、du KPNA3、du KPNA4 互作 |
| 5.2.3 鸭源IRF7 分子与核转运受体蛋白du KPNA4 互作 |
| 5.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白不与du IRF7 分子互作 |
| 5.2.5 du KPNA4 促进du IRF7 分子入核启始IFN-I表达 |
| 5.2.6 NS5-372-386 位点决定NS5 蛋白与du KPNA4 的结合能力 |
| 5.2.7 NS5-372-386 氢键排布决定GⅠ型与GⅢ型 JEV对水禽宿主适应性 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 流行病学 |
| 1.2.2 发病机理 |
| 1.2.3 诊断 |
| 1.2.4 病原学 |
| 1.2.5 BVDV结构与功能 |
| 1.2.6 BVDV引起的免疫反应 |
| 1.3 天然免疫中的泛素化修饰 |
| 1.3.1 泛素化修饰的简介 |
| 1.3.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫 |
| 1.4 转录因子ELF4 |
| 1.4.1 ETS家族的简介 |
| 1.4.2 ELF4的功能 |
| 1.5 热休克蛋白Hsp70 |
| 1.5.1 热休克蛋白Hsp70的简介 |
| 1.5.2 Hsp70系统在病毒生命周期中的功能 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 2 牛病毒性腹泻病毒N~(pro)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 病毒及细胞的RNA提取及反转录 |
| 2.2.3 BVDV N~(pro)基因的克隆及分析 |
| 2.2.4 BVDV N~(pro)蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 293T细胞的转染 |
| 2.2.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro) Western blot的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 N~(pro)基因PCR的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒p MD-18T-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.4 BVDV N~(pro)蛋白生物信息学分析 |
| 2.3.5 真核表达产物pcDNA3.1-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro)的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 BVDV非结构蛋白N~(pro)通过K48位多聚泛素化降解ELF4 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蛋白互作的预测 |
| 3.2.2 ELF4泛素化位点的预测 |
| 3.2.3 转化 |
| 3.2.4 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.6 免疫共沉淀试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 蛋白互作预测结果 |
| 3.3.2 ELF4泛素化位点的预测及分布 |
| 3.3.3 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鉴定 |
| 3.3.5 通过Co-IP试验分析N~(pro)和ELF4的相互作用 |
| 3.3.6 N~(pro)降解ELF4的K48位多聚泛素化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 筛选BVDV N~(pro)互作蛋白及对ELF4的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测N~(pro)在MDBK细胞中的表达 |
| 4.2.2 BCA试剂盒检测蛋白浓度 |
| 4.2.3 快速银染试验 |
| 4.2.4 免疫共沉淀试验 |
| 4.2.5 牛Hsp70基因引物的设计与合成 |
| 4.2.6 牛Hsp70基因的扩增 |
| 4.2.7 牛Hsp70基因真核表达载体的构建 |
| 4.2.8 磷酸钙沉淀转染 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 N~(pro)质粒在MDBK细胞中的表达情况 |
| 4.3.2 Co-IP中N~(pro)蛋白总量的测定 |
| 4.3.3 Co-IP试验结果 |
| 4.3.4 LC-MS/MS质谱技术鉴定SDS-PAGE胶中的所有蛋白 |
| 4.3.5 候选蛋白分析结果 |
| 4.3.6 牛源Hsp70基因的扩增 |
| 4.3.7 真核表达产物pcDNA3.0-Hsp70双酶切鉴定 |
| 4.3.8 牛源Hsp70质粒的表达 |
| 4.3.9 BVDV N~(pro)蛋白与Hsp70的相互作用 |
| 4.3.10 转染Hsp70质粒对BoELF4蛋白水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（9）猪细小病毒及其非结构蛋白NS1和NS2诱导猪胎盘滋养层细胞自噬作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 细胞自噬及其在病毒致病过程中作用与机制研究进展 |
| 1.1 细胞自噬概述 |
| 1.2 细胞自噬的分子机制 |
| 1.2.1 细胞自噬起始的信号调控 |
| 1.2.2 自噬体形成的信号调控 |
| 1.2.3 自噬溶酶体形成的信号调控 |
| 1.3 细胞自噬的研究方法 |
| 1.3.1 自噬体形成检测 |
| 1.3.2 自噬体降解检测 |
| 1.4 细胞自噬在病毒致病过程中的作用与机制 |
| 1.4.1 细胞自噬抗病毒机制 |
| 1.4.2 细胞自噬促进病毒复制 |
| 第二章 猪细小病毒致母猪繁殖障碍性疾病研究进展 |
| 2.1 猪细小病毒 |
| 2.2 猪细小病毒致母猪繁殖障碍性疾病 |
| 2.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒种和细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞的培养 |
| 3.2.2 PPV的增殖 |
| 3.2.3 重组质粒GFP-LC3的构建 |
| 3.2.4 病毒感染和药物处理 |
| 3.2.5 western blotting检测 |
| 3.2.6 激光共聚焦检测细胞中LC3分布 |
| 3.2.7 透射电镜检测细胞中自噬体结构 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒GFP-LC3的构建及鉴定 |
| 3.3.2 PPV感染诱导细胞中自噬标志分子LC3 II水平增加 |
| 3.3.3 PPV感染诱导PTCs中自噬体积累 |
| 3.3.4 PPV诱导感染的PTCs启动细胞自噬 |
| 3.3.5 PPV感染早期主要诱导PTCs形成不完全自噬 |
| 3.3.6 PPV感染后期诱导PTCs完全自噬 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬信号转导通路 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒种、载体和细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 p CI-neo-Rheb重组载体的构建 |
| 4.2.2 western blotting检测AMPK-m TOR通路中关键信号分子变化 |
| 4.2.3 相关信号通路的抑制 |
| 4.2.4 MTT法检测抑制剂处理细胞生存情况 |
| 4.2.5 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组质粒p CI-neo-Rheb的构建及鉴定 |
| 4.3.2 PPV感染经m TOR诱导PTCs自噬 |
| 4.3.3 AMPK参与调控PPV诱导的PTCs自噬 |
| 4.3.4 PPV经 AMPK信号通路诱导PTCs中 Raptor发生磷酸化 |
| 4.3.5 AMPK/Raptor通路调控PPV感染引起的PTCs自噬 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪胎盘滋养层细胞自噬对猪细小病毒复制影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒种和细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 药物诱导或抑制细胞自噬 |
| 5.2.2特异性siATG5 |
| 5.2.3 MTT法检测药物处理细胞生存情况 |
| 5.2.4 Q-PCR检测病毒拷贝数 |
| 5.2.5 激光共聚焦检测细胞中LC3分布 |
| 5.2.6 western blotting检测 |
| 5.2.7 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 自噬调节药物对细胞活性影响 |
| 5.3.2 自噬诱导剂雷帕霉素诱导细胞自噬促进PPV复制 |
| 5.3.3 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬抑制PPV复制 |
| 5.3.4 siATG5阻断细胞自噬抑制PPV复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 猪细小病毒非结构蛋白NS1和NS2在诱导细胞自噬过程中作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 毒种和细胞株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PPV的UV灭活 |
| 6.2.2 细胞转染 |
| 6.2.3 western blotting检测 |
| 6.2.4 激光共聚焦检测细胞中LC3分布 |
| 6.2.5 荧光定量PCR检测病毒拷贝数 |
| 6.2.6 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 UVPPV诱导PTCs完全自噬 |
| 6.3.2 PPV NS1在PPV诱导PTCs不完全自噬中发挥关键作用 |
| 6.3.3 PPV NS2在PPV诱导不完全自噬向完全自噬转换过程中发挥关键作用 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 NS1和NS2互作蛋白在猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬过程中作用及机制 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 毒种、载体和细胞株 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 NS1和NS2 及其截短体、RAB2A和VAMP7 表达载体的构建及鉴定 |
| 7.2.2 Rab2A、VAMP7、NS-1~86和NS2-87~161 的原核表达及纯化鉴定 |
| 7.2.3 NS1、NS2 与宿主蛋白免疫沉淀(IP)及质谱分析 |
| 7.2.4 免疫共沉淀(CO-IP)检测蛋白互作 |
| 7.2.5 GST-pull-down验证NS1、NS2与Rab2A、VAMP7 的直接互作 |
| 7.2.6 western blotting检测 |
| 7.2.7 激光共聚焦检测相关蛋白亚细胞定位 |
| 7.2.8 PPV突变毒株构建 |
| 7.2.9 荧光定量PCR检测病毒拷贝数 |
| 7.2.10 统计学分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 NS1、NS2表达载体构建及鉴定 |
| 7.3.2 NS1、NS2截短体表达载体的构建及鉴定 |
| 7.3.3 PPVNS1关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.3.4 PPV NS1 关键宿主互作蛋白RAB2A的鉴定 |
| 7.3.5 PPV NS1 氨基末端的1 aa~86 aa是其与RAB2A互作的关键区域 |
| 7.3.6 PPV NS2与RAB2A存在互作 |
| 7.3.7 PPVNS2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.3.8 PPV NS2 关键宿主互作蛋白VAMP7 的鉴定 |
| 7.3.9 PPV NS2的87 aa~161 aa是其与VAMP互作的关键区域 |
| 7.3.10 PPV NS1 抑制RAB2A与 VAMP7 互作 |
| 7.3.11 NS1 抑制PPV感染早期细胞内RAB2A与 VAMP7 的共定位而NS2 促进PPV感染后期RAB2A与 VAMP7 的共定位 |
| 7.3.12 PPV NS2与NS1、RAB2A和 VAMP7 形成复合体 |
| 7.3.13 PPV非结构蛋白共有区-10EVLK14-是其与RAB2A相互作用位点 |
| 7.3.14 -10EVLK14-突变的PPV突变毒株诱导细胞完全自噬且病毒复制能力降低 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 病毒与宿主miRNA相互作用的研究进展 |
| 1 miRNA的研究进展 |
| 1.1 miRNA的发现 |
| 1.2 miRNA产生的基因结构 |
| 1.3 miRNA产生的经典途径 |
| 1.4 miRNA产生的非经典途径 |
| 1.4.1 不依赖“微处理器”的miRNA产生途径 |
| 1.4.2 不依赖于Dicer的 miRNA产生途径 |
| 1.5 miRNA产生的分子机制 |
| 1.5.1 pri-miRNA转录本的序列和结构特征 |
| 1.5.2 微处理器 |
| 1.5.3 RNA III型聚合酶Dicer及其结合蛋白 |
| 1.5.4 RNA诱导沉默复合物的形成 |
| 1.6 isomiRNAs产生机制 |
| 1.6.1 5'末端加工产生isomiRNA的机制 |
| 1.6.2 3'isomiRNA的产生机制 |
| 1.6.3 3'末端加尾修饰 |
| 1.6.4 序列突变产生isomiRNA的机制 |
| 2 病毒与宿主miRNA的相互作用 |
| 2.1 宿主miRNA与病毒相互作用的影响因素 |
| 2.2 宿主miRNA与病毒基因组的相互作用 |
| 2.3 病毒感染对宿主miRNA表达水平的调节 |
| 3 黄病毒与miRNA的相互作用 |
| 3.1 黄病毒简介 |
| 3.2 miRNA介导的黄病毒基因组的稳定转录 |
| 3.3 黄病毒感染对宿主miRNA表达水平的调节 |
| 第二章 JEV编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验动物、细胞及病毒 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 主要试验方法 |
| 3.1 JEV滴度测定 |
| 3.2 JEV感染细胞 |
| 3.3 细胞RNA的提取 |
| 3.4 细胞RNA的反转录和实时定量PCR |
| 3.5 免疫印迹 |
| 3.6 miRNA模拟物或抑制剂转染细胞 |
| 3.7 RNA免疫共沉淀 |
| 3.8 液相色谱、质谱串联系统分析方法 |
| 3.9 miRNA测序数据分析 |
| 3.10 miRNA测序reads分析 |
| 3.11 miRNA实时定量PCR |
| 4 结果 |
| 4.1 JEV介导小鼠神经细胞miRNA表达分析 |
| 4.1.1 测序数据质控 |
| 4.1.2 miRNA表达分析 |
| 4.1.3 miRNA表达下调 |
| 4.2 JEV NS3 介导神经元细胞中miRNA的降解 |
| 4.2.1 转录抑制剂对JEV调控miRNA表达的影响 |
| 4.2.2 JEV NS3 对神经元细胞中miRNA表达的调控 |
| 4.2.3 RNA-seq分析JEV NS3 对神经元细胞miRNA表达调控 |
| 4.2.4 干扰JEV NS3 对宿主细胞miRNA表达的影响 |
| 4.2.5 JEV NS3 对宿主细胞RISC的影响 |
| 4.2.6 miR-466d-3p调控宿主细胞JEV的复制 |
| 4.3 JEV感染诱导宿主细胞isomiRNA的产生 |
| 4.4 JEV对pri-、pre-、mature-miRNA表达的调控 |
| 4.4.1 体内检测感染JEV后 pri-、pre-、mature-miRNA的表达 |
| 4.4.2 体外检测JEV对 miRNA的降解 |
| 4.5 JEV NS3 降解宿主miRNA的表达 |
| 4.5.1 解旋酶抑制剂阻断NS3 导致的miRNA降解 |
| 4.5.2 JEV NS3对miR-466d-3p的体外解旋 |
| 4.6 JEV NS3与miRNA的结合情况 |
| 4.6.1 RPISeq软件分析NS3与pre-miRNA和 miRNA的结合情况 |
| 4.6.2 RIP分析JEV NS3与miRNA的结合情况 |
| 4.6.3 免疫荧光技术分析与miRNA的结合情况 |
| 4.7 JEV NS3与miRNA结合位点突变对miRNA表达的影响 |
| 4.7.1 JEV NS3与miRNA结合氨基酸位点分析 |
| 4.7.2 JEV NS3与miRNA结合氨基酸位点突变分析 |
| 4.8 黄病毒科病毒NS3对miRNA表达的调控 |
| 4.8.1 不同黄病毒科病毒NS3对miRNA的降解 |
| 4.8.2 系统进化树分析黄病毒科病毒NS3与miRNA结合的氨基酸位点 |
| 4.8.3 miRNA与 JEV NS3 结合的结构域 |
| 5 讨论 |
| 5.1 病毒感染对宿主miRNA表达的调控方式 |
| 5.2 黄病毒属病毒解旋酶对miRNA表达的调控 |
| 5.3 RNA结合蛋白对miRNA表达的影响 |
| 5.4 pre-miRNA高通量测序分析黄病毒属病毒NS3对miRNA表达的调控 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
四、登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析（论文参考文献）
- [1]ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制[D]. 康棣. 中国农业科学院, 2021
- [2]宿主蛋白COPε在猪细小病毒感染过程中作用及机制研究[D]. 陈楠楠. 西北农林科技大学, 2021
- [3]西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究[D]. 李国华. 石河子大学, 2020(04)
- [4]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [5]宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究[D]. 陈松彪. 西北农林科技大学, 2020
- [6]JEV强、弱株prM/M、prM/E和NS1-NS2A基因真核表达及其免疫效果初探[D]. 刘巧玲. 贵州大学, 2020
- [7]基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制[D]. 李晨曦. 中国农业科学院, 2020(01)
- [8]BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究[D]. 王丽. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [9]猪细小病毒及其非结构蛋白NS1和NS2诱导猪胎盘滋养层细胞自噬作用与机制研究[D]. 张秀娟. 西北农林科技大学, 2020
- [10]日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究[D]. 赵彩权. 内蒙古大学, 2019(05)