一、粘附分子CD44v6和p53基因在乳腺癌组织中的表达及其与DNA倍体的关系（论文文献综述）
马晓丽[1]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中认为目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
李彦军[2]（2020）在《CUL4B在结直肠癌干细胞调控中的作用及其分子机制》文中研究表明CUL4B作为骨架蛋白参与构成Cullin4B-RING E3连接酶复合物（Cullin 4B-ring ubiquitinligases,CRL4Bs）,通过催化组蛋白H2AK119单泛素化或底物多泛素化而介导蛋白降解,参与调控细胞周期、信号传导、DNA损伤修复、染色质重塑和胚胎发育等生物学过程。另一方面,CUL4B在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌和膀胱癌等多种实体瘤中高表达,通过转录抑制多种抑癌基因和miRNAs而在肿瘤发生发展中发挥重要作用。但是CUL4B在调控结直肠癌肿瘤干细胞（Colorectal cancer stem cells,CCSCs）中的作用及其机制目前尚不清楚。结直肠癌是世界发病率和死亡率最高的癌症之一,其死亡率高的主要原因是肿瘤转移性和耐药性强,而肿瘤耐药、转移和复发等特性都与肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）相关。CSCs是存在于肿瘤组织中的一小部分具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。CCSCs在调控结直肠癌发生发展、治疗抵抗和复发转移中发挥重要作用,但其调控机制仍不完全清楚。近年来发展起来的病人来源的肿瘤类器官（Patient-derived tumor organoids;PDOs）由于高度模拟了肿瘤的异质性,再现了原位肿瘤组织学、基因组学及蛋白组学等特征,是更加接近于体内真实情形的癌症研究模型。该模型可以用于癌症的各方面研究,例如药物筛选、药物毒性测试和个性化医疗等,具有广泛的应用前景。此外PDOs的形成与CSCs的存在密切相关,因此结直肠癌患者肿瘤组织分离和培养的肿瘤类器官是CCSCs研究的良好模型。本论文主要利用结直肠癌细胞、结直肠癌肿瘤类器官和结直肠癌组织样本等为模型探讨CUL4B在调控CCSCs中的作用及具体分子机制。第一部分CUL4B促进CCSCs的形成、自我更新和转移我们的前期研究证实CUL4B在多种实体瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力。但是,CUL4B是否通过调控CCSCs而促进结直肠癌恶性行为呢?本部分分析CUL4B在结直肠癌中的作用,取得了如下结果下:（1）CUL4B在结直肠癌肿瘤组织及肿瘤干细胞中高表达:首先利用组织芯片检测了 75例结直肠癌肿瘤患者肿瘤组织及配对癌旁组织中CUL4B的表达,结果显示CUL4B在肿瘤组织中的表达水平显着高于癌旁组织。（2）CUL4B的表达水平与患者的生存期及淋巴转移显着相关:我们利用生存期组织芯片检测了肿瘤患者肿瘤组织中CUL4B的表达,结果发现CUL4B的表达水平与肿瘤患者的生存期显着负相关,即CUL4B的表达越高患者的生存期越短,CUL4B的表达越低患者的生存期越长。我们进一步分析了 CUL4B表达水平与肿瘤大小、分期分级及转移等病理特征的相关性,发现患者的年龄、性别、肿瘤大小及分期分级与患者肿瘤组织中CUL4B的表达水平无明显相关,但是CUL4B的表达水平和患者的淋巴转移呈显着正相关。（3）CUL4B在结直肠癌肿瘤干细胞中高表达,促进其成球能力:我们利用Western blotting 和 RT-PCR 检测 CUL4B 在 HCT116CSCs、HT29CSCs 和对应的分化细胞的表达,发现CUL4B在结直肠癌肿瘤干细胞的表达明显高于分化的肿瘤细胞。通过免疫荧光分析显示CUL4B与肿瘤干细胞标记物ALDH1在HCT116CSCs和HT29CSCs中共表达比例显着高于异表达比例。同时,我们在HCT116、HT29和PDOs中干扰或者过表达CUL4B,发现干扰CUL4B可以降低CCSCs成球能力和PDOs的形成能力,过表达CUL4B可以增加PDOs形成能力。（4）CUL4B促进CCSCs的自我更新能力:我们在已经富集的HCT116CSCs和HT29CSCs中干扰或者过表达CUL4B,发现干扰CUL4B显着降低HCT116CSCs和HT29CSCs的自我更新能力,过表达CUL4B显着增加HCT116CSCs的自我更新能力。（5）CUL4B促进CCSCs的裸鼠成瘤能力:利用裸鼠（BALB/c nude mice）成瘤实验,发现干扰CUL4B显着降低HCT116CSCs和HT29CSCs裸鼠的皮下成瘤能力。（6）CUL4B促进肿瘤转移能力:我们将过表达CUL4B PDOs及其对照PDOs消化成单细胞,通过脾脏注射重度免疫缺陷型小鼠（NOD-Prkdcem26I12rgem26/Nju mice,NCG）观察肝转移和肺转移情况。结果显示过表达CUL4B可以显着增加PDOs的肝转移及肺转移。类似,利用干扰CUL4B及其对照HCT116和HT29,通过尾静脉注射裸鼠观察肺转移能力,结果显示干扰CUL4B可以显着降低HCT116和HT29的肺转移。（7）CUL4B增强PDOs的耐药能力:我们选取了舍曲林（Sertraline）和氟西汀（Fluoxetine）进行耐药实验。结果显示干扰CUL4B的#16 PDOs和#02 PDOs与其对照相比,可以显着增加对Sertraline和Fluoxetine的敏感性,而过表达CUL4B的#16 PDOs与其对照相比,可以显着增强对Sertraline和Fluoxetine的耐药性。第二部分CRL4B协同PRC2抑制miR34a转录进而促进其靶基因表达上部分分析显示CUL4B通过调控结直肠癌肿瘤干细胞而调控肿瘤恶性行为。为了探究CUL4B促进结直肠癌的分子机制,本部分利用转录组测序（RNA-seq）、miRNA测序（miRNA-seq）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等对CUL4B调控CCSCs的机制进行探究。得出如下的结果:（1）RNA-seq筛选出CUL4B调控CCSC的候选基因:我们首先对3对干扰CUL4B及其对照PDOs进行测序,发现8个基因（CUL4B,NRCAM,EDAR,UPK3A,FAM3D,CYP2T3P,LCNN2 和 MYCN）在干扰CUL4B的PDOs 中都显着下调。对这8个基因和13个在其中2个PDOs中表达显着下调的基因进行验证,显示其中7个基因（ID1、UPK3A、CYP2T3P、FAM3D、NPTX2、AGR3和MYCN）在 CUL4B 敲低的 PDOs 和 HCT116CSCs 与 HT29CSCs 共同下调。（2）CUL4B正调控MYCN表达:对上面筛选出的MYCN基因在PDOs和CCSCs中进行验证,发现CUL4B正调控MYCN表达。（3）CUL4B通过抑制miR34a促进MYCN表达:我们对CUL4B高表达及其对照PDOs进行了 miRNA测序,对发现的差异表达的miRNAs与TargetScan预测的靶向MYCN的miRNAs叠加分析筛选出2个候选miRNAs（miR34a和let7e）。RT-PCR验证证实CUL4B负调控miR34a,但不调控let7e。报告基因分析和拯救实验显示CUL4B通过抑制miR34a而促进MYCN表达。（4）CRL4B协同PRC2复合物抑制miR34a的表达:分析显示CUL4B调控miR34a不依赖于p53和miR34a启动子区域CpG岛的甲基化状态。ChIP实验证实CUL4B、DDB1、EZH2结合到miR34a的启动子区域,干扰CUL4B表达导致CRL4B和PRC2复合物及其产物在miR34a启动子区域的富集减少,证实CRL4B协同PRC2复合物抑制miR34a的转录。拯救实验显示由于干扰CUL4B导致结直肠癌细胞的成球和转移能力的减少可以通过抑制miR34a得以拯救。以上结果说明CUL4B促进肿瘤细胞干性是通过调控miR34a转录实现的。（5）CUL4B参与调控miR34a靶基因网络:我们分析了miR34a的其他靶基因——CD44、NOTCH1及NUMB的表达,发现CUL4B正调控这些靶基因。荧光素酶实验进一步证实CUL4B通过抑制miR34a促进NOTCH1表达。（6）CUL4B与miR34a及其靶基因在肿瘤组织中的表达及其相关性分析:我们收集了 38例结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织,结果发现miR34a在61%（23/38）的肿瘤样本中低表达,CUL4B在68%（26/38）的肿瘤样本中高表达,MYCN在71%（27/38）的肿瘤样本中高表达,CUL4B、MYCN和miR34a呈现表达负相关,CD44、MYCN和CUL4B呈现表达正相关。
王喜菊[3]（2020）在《MSI2介导Notch1信号通路维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”的机制研究》文中认为背景与目的:肝细胞肝癌是世界上第六大肿瘤,在肿瘤致死性疾病中居第三位。肝癌干细胞与肝癌的复发转移及治疗抵抗密切相关。Musashi2（MSI2）是正常干细胞和肿瘤干细胞中“干性”促进和维持的关键基因。Notch1信号通路是调控肿瘤干细胞的核心信号通路之一。MSI2及Notch1通路在肝癌干细胞的“干性”促进和维持中均扮演重要角色。然而,MSI2及Notch1通路在CD44v6+肝癌干细胞“干性”维持中的作用及机制尚不清楚。因此,本研究旨在探究MSI2及Notch1通路在CD44v6+肝癌干细胞“干性”维持中的作用及其分子机制。方法:第一部分Western blot检测28对新鲜肝癌组织和癌旁组织中MSI2及CD44v6的蛋白表达情况。接着免疫组织化学分析法检测82对肝癌组织与癌旁组织中MSI2、CD44v6的表达情况并进行临床病理相关性分析,再进一步分析二者的相关性;第二部分免疫磁珠分选法从肝癌细胞系SNU-398、MHCC-97h中分选CD44v6+及CD44v6-细胞后流式细胞术鉴定其分选效率。再利用平板克隆增殖实验、Transwell迁移侵袭实验、Sorafenib抵抗实验、NOD/SCID小鼠体内有限稀释实验和Western blot检测Nanog、Oct4、Sox2相关“干性”基因等实验鉴定CD44v6+肝癌干细胞的“干性”特征。接着在确证MSI2、Notch1信号通路在CD44v6+肝癌干细胞中表达明显高于CD44v6-细胞后,通过慢病毒下调/上调SNU-398 CD44v6+/-肝癌细胞中MSI2或Notch1,并重复以上实验检测其生物学行为的变化;第三部分为深究MSI2维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”的具体分子机制,使用Notch RT2PCR芯片检测下调CD44v6+细胞中MSI2基因后Notch信号通路分子的变化,并用RT-PCR和Western blot进一步筛查和明确MSI2通过LFNG激活Notch1信号通路。接着使用慢病毒下调SNU-398 CD44v6+细胞中LFNG基因后检测其“干性”生物学行为的变化,最后用CO-IP和RIP实验明确MSI2与LFNG的相互作用机制。结果:第一部分（1）Western blot结果显示MSI2和CD44v6在肝癌组织中的蛋白水平明显高于癌旁组织;（2）免疫组织化学分析法结果显示MSI2在肝癌组织中的表达显着高于癌旁组织,且与CD44v6的表达呈正相关关系,MSI2和CD44v6的高表达与肝癌患者不良预后相关;第二部分（1）免疫磁珠分选法分选的CD44v6+细胞较CD44v6-细胞而言具有更强的克隆增殖能力、迁移侵袭能力、自我更新能力、Sorafenib抵抗能力、NOD/SCID小鼠体内成瘤能力等“干性”特征,且表达更多的“干性”基因;（2）Western blot检测MSI2在CD44v6+细胞中高表达的情况下,使用慢病毒下调CD44v6+细胞中MSI2后发现细胞“干性”生物学行为能力降低,“干性”基因表达减少。而上调CD44v6-细胞中MSI2的表达后,其自我更新能力、迁移侵袭能力、克隆增殖能力、NOD/SCID小鼠体内成瘤能力明显增强,“干性”基因表达显着增加;（3）使用慢病毒下调CD44v6+细胞中Notch1基因或用γ分泌酶抑制剂RO4929097抑制Notch信号通路的活性后,细胞“干性”生物学行为能力减弱,“干性”基因表达减少;第三部分（1）Western blot实验结果发现在CD44v6+细胞中下调MSI2基因后Notch1信号通路关键分子（Notch1、NICD、Hey1、Hes1）表达减少,而在CD44v6-细胞中上调MSI2后Notch1信号通路关键分子表达增加;（2）Notch RT2 PCR芯片结果显示在SNU-398 CD44v6+细胞中下调MSI2后筛选出18个具有显着性差异的基因,其中表达下调的6个,表达上调的12个,我们选择差异最明显的10个基因使用RT-PCR进行筛查后发现LFNG变化最显着;（3）使用慢病毒下调SNU-398 CD44v6+细胞中LFNG后细胞的自我更新能力、NOD/SCID小鼠体内成瘤能力减弱,“干性”基因表达减少;（4）慢病毒序贯调控实验结果显示MSI2通过LFNG活化Notch1信号通路参与维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”特征;（5）CO-IP实验及RIP实验结果显示MSI2可与LFNG的蛋白和mRNA直接结合调控Notch1信号通路。结论:综上所述,MSI2在肝癌组织中高表达,且MSI2的高表达与CD44v6的高表达呈正相关关系,与肝癌患者预后不良密切相关。CD44v6可作为肝癌干细胞一个可靠的“干性”标记物。MSI2和Notch1信号通路在维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”特征中发挥重要作用。通过芯片筛查、序贯调控实验及CO-IP、RIP等实验我们发现MSI2可直接与LFNG的蛋白和mRNA结合调控Notch1受体的表达,进而激活Notch1信号通路参与维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”化。本研究从肝癌干细胞维持这一角度进一步完善了肝癌的侵袭转移机制,为阻遏肝癌复发转移的治疗提供了潜在的分子靶点。
陈聪[4]（2020）在《c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究》文中提出目的:设计靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,验证其在胃癌中的有效性及安全性,并对c-Met CAR进行PD1/CD28融合受体优化以改善免疫抑制,提高抗肿瘤效果。方法:使用生物信息学的方法分析TCGA中胃癌数据的c-Met表达情况及其与生存预后的关系。收集手术患者的胃癌肿瘤及癌旁组织标本,用免疫组化的方法检测c-Met的表达。并用PCR、WB、流式细胞计数等方法检测6种不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1的基因和蛋白表达情况。构建c-Met CAR和cMet-PD1/CD28 CAR质粒,包装慢病毒、感染T细胞,制备对应的CAR-T。在体外细胞实验中,检测CAR-T细胞不同亚群和表型的变化,及靶细胞刺激对CAR-T激活和PD-1表达的影响。检测CAR-T的细胞因子分泌水平,并通过乳酸脱氢酶释放实验、7-AAD染色、CD107a脱颗粒反应等方法反映c-Met CAR-T、cMet-PD1/CD28 CAR-T对靶细胞的杀伤能力。在体内动物模型中,通过活体小动物成像等方法观测两种CAR-T对小鼠胃癌皮下移植肿瘤的作用,并通过HE染色的方法检测两种靶向c-Met的CAR-T对小鼠正常器官的脱靶毒性。结果:TCGA数据库和胃癌标本免疫组化结果均显示胃癌组织高表达c-Met,c-Met表达较高的胃癌患者的预后较差。通过PCR、WB、FCM等方法筛选出c-Met表达最高的胃癌细胞系MKN-45和最低的细胞系HGC-27,作为实验细胞,并使HGC-27过表达c-Met构建HGC27-OE作为阳性对照。相对于转染空载体质粒的Mock T,c-Met CAR-T细胞的CD3+CD8+亚群和CD62L+CCR7+中央记忆表型增多,PD1/CD28融合受体结构能够进一步增加CAR-T的CD62L+CCR7+中央记忆细胞的比例,但却未明显改变CD4+、CD8+T细胞亚群。靶细胞的刺激可以使c-Met CAR-T的PD-1表达升高,CD69+、CD71+激活表型增多。相对于Mock T,c-Met CAR-T与靶细胞共培养后能够分泌更多的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子,CD107a脱颗粒反应和对靶细胞的杀伤能力均明显提高,且其杀伤活性依赖于靶细胞c-Met的表达。PD1/CD28融合受体结构能够进一步增强c-Met CAR-T对c-Met阳性胃癌细胞的杀伤能力,此外,还可以降低炎性因子IL-6的释放水平。c-Met CAR-T对小鼠皮下移植胃癌模型肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且对小鼠正常的胃、小肠、心、肝、脾、肺、肾等重要器官没有明显的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构还能进一步增强c-Met CAR-T的远期抗肿瘤效果。结论:c-Met CAR-T对高表达c-Met的胃癌细胞具有良好的杀伤活性,能够明显抑制c-Met阳性胃癌肿瘤的生长,且对正常器官没有严重的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构能够通过逆转PD-1免疫抑制信号,进一步增强c-Met CAR-T的抗肿瘤能力,并且可以减少c-Met CAR-T炎性因子IL-6的分泌,降低细胞因子释放综合征的发生率,具有更高的安全性。
夏露花[5]（2020）在《nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响》文中研究表明目的:研究和探讨nm23基因与其他基因（EGFR,VEGF）在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及其相关性,为临床治疗非小细胞肺癌疾病选取最有效的药物提供更多的参考信息。靶向逆转nm23基因对非小细胞肺癌在放疗敏感性中的影响研究,并探讨其可能机制。探讨使用PET/CT与增强CT两种检查方法对nm23表达的非小细胞肺癌分期及对放疗计划的影响。方法:1)选取180例nm23表达阳性的非小细胞肺癌患者的肿瘤组织标本,将其列为研究组。选取上述研究组中的53例非小细胞癌标本的癌旁正常肺组织作为对照组。检测两组的nm23和EGFR、VEGF基因的表达,对比其差异。对上述180例患者进行回顾性分析,分析在不同性别、病理类型、分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期方面nm23、EGFR、VEGF三者表达的差异及其相关性。2)采用实时荧光PCR检测不同非小细胞肺癌细胞株A549和细胞株H1299中nm23 mRNA中表达水平;对照组细胞株A549给予照射处理,实验组则将过表达nm23重组质粒转染A549后给予照射处理;采用克隆形成实验检测各组细胞集落形成情况;采用实时荧光PCR检测各组nm23 mRNA表达并进行统计学分析;采用Western Blot检测两组PI3K和AKT蛋白表达,分析其表达的差异。3)选取213例nm23表达的非小细胞肺癌患者为研究对象,根据患者图像检查方法的不同,将其分为PET/CT组与增强CT组。在PET/CT组中,对比nm23表达强阳性（>++）组nm23表达阳性（≤++）组的SUVmax及GTVPET/CT。观察对比PET/CT组与增强CT组两组图像下,肿瘤分期改变情况、靶区勾画的体积大小、危及器官靶区的照射剂量,评估其对放疗靶区勾画的差异,对分期及放疗计划的影响。结果:1)EGFR、VEGF和nm23在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达:非小细胞癌组中的EGFR、VEGF阳性率均显着高于对照组,而nm23阳性率显着低于对照组,差异具有统计学意义。EGFR、VEGF和nm23表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系:（1）在性别、肿瘤分化程度方面:EGFR、VEGF、nm23阳性表达比较差异均无统计学意义;（2）病理类型方面:腺癌组EGFR阳性表达率高于鳞癌组;VEGF、nm23阳性表达率在腺癌、鳞癌上差异无统计学意义;（3）肿瘤分期方面:EGFR阳性表达率在肿瘤分期为Ⅲ—Ⅳ期组高于肿瘤分期为Ⅰ—Ⅱ期组,差异有统计学意义;VEGF、nm23在分期Ⅰ—Ⅱ期与Ⅲ—Ⅳ期中差异无统计学意义。（4）淋巴结转移方面:EGFR、VEGF阳性表达率有淋巴结转移组的高于无淋巴转移组;nm23的阳性表达率有淋巴结转移组低于无淋巴结转移组。（5）相关性分析结果显示:在非小细胞癌组织中,VEGF和EGFR不存在明显相关性;VEGF和nm23之间也不存在明显相关性,但EGFR与nm23与之间呈负相关性。2)A549和H1299非小细胞癌细胞株中nm23mRNA表达水平差异有统计学意义,A549非小细胞肺癌细胞株nm23表达水平较低;实验组与对照组MLD值和SF2值差异有统计学意义;实验组与对照组各放疗剂量下,细胞存活量差异有统计学意义;实验组与对照组在各放疗剂量下,nm23 mRNA表达水平差异有统计学意义;实验组与对照组在各放疗剂量下,PI3K和AKT蛋白表达水平差异有统计学意义。3)在PET/CT组中,nm23表达强阳性组SUVmax与GTVPET/CT均低于nm23表达阳性组。PET/CT组与增强CT组两组图像相比,两组在非小细胞癌分期改变、大体靶区体积（GTV）、危及器官的放疗照射量方面差异均有统计学意义。结论:（1）对nm23、EGFR和VEGF进行免疫组化检测,有助于临床了解非小细胞肺癌患者病变程度,为制定治疗方案及选择合适的药物提供更多有价值的信息。（2）靶向逆转nm23可增强非小细胞肺癌放疗敏感性,与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关。（3）了解nm23基因在非小细胞肺癌中的表达情况,能够为放疗靶区的制定提供更多有价值的信息。PET/CT在非小细胞肺癌放疗中,有助于提高靶区勾画的准确性,同时也能够更好的保护周围正常组织、器官,使患者获益。
曹奕[6]（2019）在《核糖体调节蛋白1在神经母细胞瘤中的功能及机制研究》文中提出神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是一种常见于婴幼儿外周神经系统的恶性肿瘤,是常见起源于交感神经系统神经嵴的胚胎实体瘤。神经母细胞瘤在遗传学上表现为各种染色体异常,其典型特征是转移,尤其是多部位、多灶性早期转移,其中早期骨髓转移在临床最为常见,其增殖及转移机制较为复杂,普遍认为酪氨酸激酶受体及其配体在神经母细胞瘤的发生、分化、细胞增殖、血管生成及转移、凋亡等方面发挥调节作用。目前国内的主要对神经母细胞瘤的治疗方法是手术、放化疗、干细胞移植加强化疗及诱导分化维持治疗等综合治疗,较之前极大地提高了晚期NB患儿的五年生存期,目前晚期NB患儿的五年生存率维持在50%左右。但是,晚期NB患儿治疗方法已进入瓶颈期,且NB属于少见癌种,对于NB的认识及治疗水平差异较大,这就加大了NB的复杂性和难治性。相较于国内,免疫靶向治疗和131I-MIBG放疗等特异性治疗手段已在西方发达国家得到应用,对于晚期NB的治疗具有较好的临床疗效。因此,在未来的临床治疗中应更加注重具有更强的特异性和敏感性的靶向治疗的应用,而寻求新而有效的潜在NB分子靶点是非常必要的。核糖体是细胞合成蛋白的主要场所,其主要组成成分是蛋白质和RNA,对细胞的生长和增殖发挥着重要的作用。核糖体最重要的生物学行为是蛋白质的生物合成。核糖体合成调节蛋白1（Regulator of ribosome synthesis 1,RRS1）最早在酵母中被发现,人RRS1基因定位在染色体8q13.1,染色体位置在66429028–66430733bp,人RRS1主要定位于核仁和内质网上。RRS1是一个多功能蛋白,作为一种核糖体合成调节蛋白,它参与pre-rRNA的加工,还参与60S核糖体亚单位从核仁向细胞浆的运输。RRS1可以根据细胞的状态调节核糖体合成的速度,从而保持细胞内的稳态,是蛋白质分泌与核糖体合成信号转导途径中的一个重要蛋白质。近年来,关于RRS1基因与疾病的相关性研究也日益增多,早在2009年Carnemolla等人报道,RRS1基因与人类亨廷顿病（Huntington disease,HD）的发生发展相关,研究结果显示RRS1基因在HD中的表达量显着升高。最近的研究发现,RRS1基因的异常表达与宫颈癌、肝癌、结直肠癌等癌症密切相关,且本课题组前期研究表明RRS1基因与乳腺癌的增殖相关。但是目前对RRS1基因在神经母细胞瘤中的功能尚未见报道,在本研究中我们将探索RRS1基因在神经母细胞瘤中的功能及其与神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的调节机制。目的:（1）检测RRS1基因在神经母细胞瘤组织中的表达水平,并探讨其与神经母细胞瘤临床病理特征及生存率之间的关系。（2）研究RRS1基因对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的影响。（3）探讨RRS1基因与神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的调节机制。方法:（1）采用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry,IHC）检测神经母细胞瘤组织中RRS1蛋白表达水平,统计其与患者临床病理特征及生存预后的相关性。（2）体外培养神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549及正常乳腺细胞HMEC,并采用qPCR检测各细胞系中RRS1基因的mRNA表达水平。（3）采用CRISPRCas9和RNA干扰技术构建慢病毒载体,感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,分别在DNA水平敲除和转录后水平敲减RRS1基因的表达量。（4）采用Cruise酶切检测Cas9的敲除效率,通过qPCR和Western Blot方法检测RRS1基因在mRNA水平和蛋白水平的敲减效率。通过MTT实验及克隆形成实验检测细胞的增殖活力;采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡水平;通过划痕实验及Transwell实验检测细胞的迁移能力;通过侵袭实验检测细胞的侵袭能力。（5）通过Western blot法检测RRS1基因敲减后,神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中凋亡相关蛋白P53、P21、Bcl-2及Bax的表达情况,探讨RRS1调节细胞凋亡的分子机制。结果:（1）免疫组化结果显示,45例神经母细胞瘤组织中RRS1蛋白阳性表达16例,阳性率为35.6%。（2）生存预后分析显示,神经母细胞瘤患者年龄大部分是在10岁以下,RRS1蛋白表达阳性在转移人群和未转移人群之间的分布存在差异（p<0.05）,RRS1阳性表达与死亡存在明显的相关性（p<0.01）。提示RRS1阳性为神经母细胞瘤转移的独立危险因素（p<0.05）,也是死亡的关键因素（p<0.01）。（3）神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞、正常乳腺HMEC细胞及乳腺癌MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453、MCF-7细胞中RRS1基因mRNA的ΔCt值分别为3.46±0.30、13.18±0.24、12.44±0.08、9.95±0.48、11.11±0.60、7.42±0.22,RRS1基因在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达量明显高于正常乳腺细胞及乳腺癌细胞。（4）CRISPRCas9慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后,敲除SH-SY5Y细胞中RRS1基因的表达,通过WB实验检测细胞蛋白表达水平,Control组RRS1蛋白表达量为1.428±0.350,而KnockOut组RRS1蛋白表达量为0.198±0.128,结果显示Control组RRS1蛋白表达量明显高于KnockOut组（p<0.01）。（5）RRS1-shRNA慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后,敲减SH-SY5Y细胞中RRS1基因的表达,通过WB实验检测细胞蛋白表达水平,NC组mRNA表达量为1.002±0.084,RRS1-shRNA组表达量为0.536±0.016（p<0.01）,且RRS1-shRNA组蛋白表达量也明显降低。（6）CRISPRCas9慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,敲除细胞中RRS1基因后:MTT实验显示细胞增殖能力明显下降（p<0.01）;克隆形成实验结果显示NC组单细胞克隆数为102±10,而Knockout组克隆数为8±3,克隆形成能力明显降低（p<0.01）;细胞周期实验显示NC组细胞,处于G1期的细胞数是43.75%±0.743而Knockout组的细胞处于G1期细胞数目是57.53%±0.580,细胞周期调控紊乱（p<0.01）;划痕实验结果显示NC组细胞24h后的迁移率是80.93%±0.0775,Knockout组细胞24h后的迁移率是63.00%±0.0505,细胞迁移能力明显下降（p<0.01）;Transwell结果显示NC组迁移到下室的细胞个数是180±3.85,Knockout组迁移到下室的细胞个数是24±4.46,细胞的迁移能力明显降低（p<0.01）;侵袭实验结果显示NC组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是157±3.36,Knockout组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是7±0.36,表明细胞的侵袭转移能力明显降低（p<0.01）。（7）shRNA慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,敲减细胞中RRS1基因后:MTT实验显示细胞增殖能力明显下降（p<0.05）;克隆形成实验结果显示NC组单细胞克隆数为75±3,而RRS1-shRNA组克隆数为10±2,克隆形成能力明显降低（p<0.01）;细胞周期实验显示NC组细胞,处于G1期的细胞数是32.15%±0.7199而RRS1-shRNA组的细胞处于G1期细胞数目是69.36%±0.3879,细胞周期被明显阻滞在G1期（p<0.01）;细胞凋亡实验结果显示NC组早凋细胞比例是2.21%±0.1234,RRS1-shRNA组早凋细胞比例是7.24%±0.3465,细胞早期凋亡率明显增多（p<0.01）;划痕实验结果显示NC组细胞24h后的迁移率是16.31%±0.0181,RRS1-shRNA组细胞24h后的迁移率是9.79%±0.0346,细胞迁移能力明显下降（p<0.01）;Transwell结果显示NC组迁移到下室的细胞个数是219±4.72,RRS1-shRNA组迁移到下室的细胞个数是11±1.10,细胞的迁移能力明显降低（p<0.01）;侵袭实验结果显示NC组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是191±2.17,RRS1-shRNA组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是60±2.81,细胞的侵袭转移能力明显降低（p<0.01）。（8）敲减神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞RRS1基因后,凋亡相关蛋白p53、p21、Bax表达量明显提高,癌基因Bcl-2蛋白表达量明显降低,p53蛋白与MDM2的相互作用降低。结论:（1）RRS1基因在神经母细胞瘤组织中有阳性表达,主要定位于细胞核中,呈淡黄色至棕黄色颗粒,部分在胞浆弱阳性表达。（2）RRS1基因阳性表达与神经母细胞瘤患者的转移及死亡密切相关。（3）RRS1基因在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中高度表达,敲除及敲减RRS1基因的表达后,SY5Y细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显下降,凋亡水平明显升高。（4）敲减神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞RRS1基因能诱导p53、p21蛋白的激活,从而导致细胞周期的阻滞及细胞凋亡的增多。RRS1基因可能是通过p53-MDM2信号通路调控细胞的凋亡及周期。
刘刚[7]（2019）在《MiR-34a调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和粘附及其分子机制》文中研究说明[研究目的]骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤之一,青少年较为常见,它影响快速增殖的骨骼。数据统计显示,每年估计全球有400万人发病。过去的十年中,手术结合化疗等手段,能较有效的抑制骨肉瘤的生长和浸润。目前尽管患者能得到积极的治疗,但骨肉瘤的复发、转移和化疗耐受等仍然是导致治疗失败的主要原因。骨肉瘤的5年生存率约50%至70%,局部复发约占患者的10%,生存率低。骨肉瘤患者死亡的主要原因是由于肿瘤细胞的复发、转移,因此,目前需寻找有效的抑制肿瘤细胞转移的方法,找出驱动骨肉瘤恶化、复发和转移的潜在分子机制,识别与预后相关的分子治疗靶点,以改善骨肉瘤患者的治疗效果和预后。在与肿瘤转移相关基因的基础研究中,microRNA（miRNA）已经成为一个新的探索热点。愈来愈多的研究结果显示,miRNA在身体正常功能的维系和疾病的发生、发展过程中具有重要的作用,同时参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、应激反应和发育等。在机体许多类型肿瘤的发生、侵润和转移中,miRNA的调节发生异常,如卵巢癌、肝癌、膀胱癌和结直肠癌等。在microRNA中,尤其miR-34a,被公认是一种肿瘤抑制因子,参与调控多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、粘附和凋亡等生理病理过程。miR-34a有许多靶基因,如p53、Eag1、Wnt和Notch,这些靶基因科以在骨肉瘤中调节多种细胞功能。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一种极其保守的激酶家族,它将信号从外界传递到细胞内,调节细胞的生长和分化。而在介导MAPK去磷酸化的酶中,最为重要的是蛋白酪氨酸磷酸酶超家族,称为双特异性蛋白白磷酸酶（DUSPs）,其中DUSP1参与细胞周期中G0/G1期的过渡和细胞的凋亡的调节。有研究表明,miR-101作用DUSP1,影响索拉非尼处理下的的TGF-β分泌。抑制miR-940,促进DUSP1的表达,减弱JNK介导的肺癌细胞凋亡。然而,在骨肉瘤中,miR-34a在DUSP1上的调节尚不清楚。我们的研究旨在揭示miR-34a和DUSP1对骨肉瘤细胞增殖、迁移、粘附和凋亡等作用,及其对相关效应蛋白的影响,阐述其分子机制。了解miRNA对于骨肉瘤细胞的增殖、凋亡等的影响,有助于筛选出新的与分子预后有关的治疗靶点,为研发新的抗肿瘤药物及临床骨肉瘤的预防、诊断、治疗及预后提供参考。[研究方法]通过应用pre-miR-34a、anti-miR-34a和阴性对照,过度表达和降低表达miR-34a,探索miR-34a对骨肉瘤细胞的相关作用。通过MTT和克隆形成实验,检测miR-34a对细胞增殖的作用;通过Traswell细胞迁移实验,检测了 miR-34a对骨肉瘤细胞的迁移作用;通过流式细胞术实验,检测miR-34a对细胞周期和凋亡的作用;通过双荧光素酶报告基因分析实验、QPCR实验和western blot实验,检测miR-34a对DUSP1的表达调控,探讨其分子机制。[研究结果]miR-34a使骨肉瘤细胞停滞在G0/G1期,减少S期的比例,显着地抑制MG63细胞的增殖。同时,miR-34a对骨肉瘤细胞的迁移抑制达到了百分之六十,使细胞的凋亡增加六倍,抑制百分之八十的细胞的粘附。相反地,在U-20S细胞中转染anti-miR-34a,降低miR-34a的表达,可使细胞在G0/G1期比例减少,增加S期的比例,促进细胞的增殖,抑制了骨肉瘤细胞凋亡,促进了细胞粘附。在骨肉瘤中,双特异性磷酸化酶1（DUSP1）是miR-34a的直接靶基因,在MG63细胞中高表达DUSP1,使骨肉瘤细胞在G0/G1期比例下降,增加了 S期细胞比例,抑制了骨肉瘤细胞凋亡,促进细胞的增殖,增强了细胞的粘附能力。然而,在U-20S细胞中抑制DUSP1的表达,阻滞骨肉瘤细胞在G0/G1期,使S期细胞比例减少,抑制骨肉瘤细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,抑制骨肉瘤细胞的粘附能力。miR-34a负调控DUSP1,提高Bax表达,抑制Bcl-2表达,促进骨肉瘤细胞的凋亡;抑制细胞周期蛋白D1和E表达,阻滞骨肉瘤细胞于G0/G1期,抑制骨肉瘤细胞的增殖;提高E-钙黏蛋白的表达,降低β-catenin表达,抑制骨肉瘤细胞的粘附。[研究结论]miR-34a在骨肉瘤中,通过直接靶向作用DUSP1,抑制DUSP1的表达,抑制骨肉瘤细胞增殖,阻滞细胞于G0/G1期,抑制细胞迁移,抑制细胞粘附,促进细胞凋亡,发挥抑制骨肉瘤细胞的作用。
莫艳秀[8]（2019）在《SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究》文中认为前期研究发现化学小分子SP600125能够诱导鱼类细胞发生多倍化并成功获得稳定的同源四倍体鲫鱼细胞系。为进一步了解SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制,本研究通过RNA-seq方法获取SP600125处理组和对照组细胞的差异基因表达谱,利用GO和KEGG通路富集分析全面挖掘SP600125诱导细胞多倍化和细胞稳态维持相关的信号调控网络和关键功能基因,旨在揭示SP600125诱导鱼类细胞多倍化的作用机制,以期为SP600125在鱼类发育生物学的研究以及多倍体培育中的应用提供理论依据和技术参考。具体结果如下:1.高通量测序分析SP600125处理细胞全转录组水平的变化采用高通量测序技术,对体外培养的二倍体鲫尾鳍细胞和SP600125处理组细胞进行了转录组测序和比较分析。获得96,997个unigenes并对unigenes进行了GO功能注释和KEGG通路富集分析。比较SP600125处理组与对照组共获得差异表达基因4516个,其中显着上调有2670个,显着下调有1846个。差异基因主要与细胞代谢、应激反应、发育过程以及细胞周期调控相关。结果显示SP600125诱导引起一批细胞增殖调控相关功能基因尤其以细胞周期检测点相关基因表达水平的改变最为突出,表明SP600125对细胞周期检验点的多重调控与其实现鱼类细胞多倍化的诱导密切相关。2.p53信号通路对SP600125诱导细胞多倍化的调控作用基于转录组学分析的结果,进一步鉴定了与细胞周期检测点密切相关的p53信号通路在SP600125诱导细胞多倍化中的作用。根据已建立的SP600125诱导多倍化的间隔循环策略,利用qRT-PCR和Western blot技术检测SP600125处理对p53信号通路相关基因的mRNA和蛋白水平的影响,结果表明SP600125诱导引起p53、Mdm2、p21和Gadd45ɑ等细胞周期调控相关功能基因的mRNA表达水平产生显着上调,这与转录组分析的结果具有一致性;Western blot结果亦表明SP600125处理48h后细胞中的p53、MDM2和p21的蛋白表达明显上调。为进一步验证p53通路在SP600125诱导细胞多倍体中的作用,以p53抑制剂PFT-ɑ孵育细胞,结果显示PFT-ɑ处理可以在一定程度上降低SP600125对细胞周期G2/M期的阻滞和减少多倍体细胞的产生。以上结果表明p53通路通过调控细胞周期发生G2/M期阻滞参与SP600125诱导鱼类细胞多倍化的产生。3.纺锤体检测点（SAC）基因对SP600125诱导细胞多倍化的影响细胞学观察显示经SP600125处理导致细胞停滞于有丝分裂期。转录组学分析和qRT-PCR验证结果均表明SP600125导致细胞CyclinBl/3、Cdc2、Securin以及负责与动点粘附和对染色体分离监控的纺锤体检验点（SAC）相关基因Bub1、Mad2和Cdc20的mRNA水平呈下调性变化。Western blot结果进一步证实SP600125诱导引起细胞中的BUB1、MAD2和CDC20蛋白的表达水平下降。利用腺病毒成功构建了纺锤体检验点（SAC）核心蛋白MAD2的过表达重组载体（pAd-mCMV-MAD2-3-Flag-GFP-pA）。结合qRT-PCR、Western blot技术以及流式细胞仪分析,进一步鉴定了过表达MAD2对SP600125诱导细胞多倍化的影响。结果证实过表达MAD2能明显减弱SP600125间隔循环处理所引起细胞多倍体的发生。以上结果表明经SP600125诱导引起CyclinBl-Cdc2复合物和纺锤体检验点（SAC）活力下降导致有丝分裂滑移和核内有丝分裂共同产生细胞多倍化。4.急性免疫应激参与SP600125胁迫下的细胞内稳态维持调节基于转录组测序分析,二倍体鲫尾鳍细胞经SP600125处理后能够引起大量免疫炎症相关基因表达水平发生显着的改变,其中涉及到参与先天防御、炎症途径和细胞粘附分子相关途径包括促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-ɑ和IL-6R）、转录因子信号转导分子（如Stat-1/3和IκB）、细胞粘附分子（如Vcam-1）和整合素（ɑ2β1和ɑMβ2）等。同时SP600125处理导致线粒体不仅在形态和数量发生明显改变而且在Glut1和主要糖酵解酶基因（如Hk1、Pfbfk、Pgam、Eno和Ldh）的mRNA水平显着降低以及线粒体电子传递链基因（如NADH脱氢酶的Nd1、Nd2和Nd5复合体I亚基基因、Adh、Ndufs8、Ndufa4、Uqcr和Sdhd等）的mRNA水平也显着下调。相关研究结果揭示了在SP600125的胁迫下细胞通过应激免疫响应和降低氧化磷酸化水平等措施参与细胞内稳态的维持。结论:（1）转录组学分析表明SP600125对细胞周期检验点的多重调控与其实现鱼类细胞多倍化的诱导密切相关。（2）SP600125诱导增强了p53信号通路的G2/M期阻滞并导致纺锤体检验点（SAC）信号削弱引发的有丝分裂滑移和核内有丝分裂从而实现鱼类细胞多倍化。（3）在SP600125胁迫下细胞通过应激免疫响应和降低氧化磷酸化水平等措施参与细胞内稳态的维持。研究结果为SP600125在鱼类发育生物学研究和生产实践中的应用奠定了理论基础。
郑斌[9]（2019）在《长链非编码RNA LINC00680在食管鳞癌增殖侵袭中功能及与预后微转移相关性的研究》文中进行了进一步梳理背景:根据世界癌症统计的结果,食管癌是最常见的恶性肿瘤之一。根据报道,食管癌发病率位列全部恶性肿瘤中第8位,死亡率位列第6位。从发病率男女比例来看,男性明显高于女性。在中国平均每年约有25万新增的食管癌患者,数量占全球食管癌新增患者数的一半以上。不同于西方国家,食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）仍是我国乃至东亚最普遍的食管癌类型。食管鳞癌、食管腺癌两者的病理学类型与好发部位不同,其发生的危险因素、生物学行为、好发部位、治疗敏感性等方面均有不同。因此,目前针对食管鳞癌的相关研究正在如火如荼的开展,有望能够发现亚洲食管鳞癌发生发展以及生物学行为独特的分子生物学机制。食管鳞癌不仅具有高发病率,其还具有高侵袭性以及预后差等特点,在肿瘤进展的方式中,食管鳞癌早期发生转移是导致预后不佳的主要原因之一。而淋巴结转移是食管鳞癌的主要转移方式,其与食管鳞癌的分期、预后情况明显相关。近年来有文献报道,随着全基因组测序技术的快速发展,学者们发现编码蛋白质的编码序列所占比例很少,全人类基因组中参与进行编码蛋白质组的部分只有不到1-2%。很长一段时间,因为非编码RNA并不直接参与编码蛋白组,其功能一度被忽略。从发现有非编码RNA参与P53通路,并同时参与生物学调节过程开始,越来越多的学者研究并关注非编码RNA,尤其是针对非编码RNA在肿瘤的发生、发展过程中作用的研究逐渐增多。长链非编码RNA（lncRNA）是RNA分子的一个特殊类型,lncRNA是指RNA分子的转录本长度超过200核苷酸,lncRNA一般不直接参与编码蛋白,或者只是参与编码短多肽。相比于与研究比较深入的与蛋白编码相关的RNA,lncRNA的研究才初步兴起,针对lncRNA的基因表达以及其在肿瘤发生发展中作用的研究将不断深入。有理由相信,lncRNA可能是继编码RNA后的又一个明星分子。在食管癌研究领域,根据文献报道,亦有部分关于lncRNA参与肿瘤的发生发展的各个过程的研究,如有研究者鉴定出lncRNA通过调控下游靶基因的甲基化水平从而调节食管癌生物学过程。有研究者推测lncRNA可作为食管癌早期筛选及诊断的潜在生物标志物。有研究者证明高表达的lncRNA与肿瘤细胞增殖、侵袭、粘附相关。有研究者发现高表达的食管鳞癌相关lncRNA能够促进食管癌细胞的侵袭转移并诱导肿瘤细胞出现耐药性。这些研究结果显示,在食管癌发生、发展过程中,部分lncRNA的表达水平发生了特征性的改变,这些lncRNA通过调控某些重要信号转导通路,调节下游靶基因的表达,从而影响食管癌的发生、发展。利用高通量测序技术进行癌症发病机制研究是目前食管癌研究领域的热点。在我们的前期工作中,完成了对食管鳞癌组织及其对应癌旁正常组织的高通量转录组学测序,并对基因的表达水平进行了筛选比较,发现食管鳞癌样本中lncRNA的表达水平发生了显着的变化,这说明lncRNA的差异性表达在食管癌发生、发展中可能扮演着重要的角色。因此我们拟利用分子生物学及细胞生物学实验,通过在体外培养食管鳞癌细胞系,建立食管鳞癌动物模型,结合收集到的食管鳞癌患者手术病理样本,以期筛选出有意义的差异性表达的lncRNA,探讨其在食管鳞癌增殖侵袭生物过程中的功能,并研究其与食管癌预后的关系,以期从另一个方面了解该差异性表达lncRNA的作用。我们拟通过本研究,进一步揭示食管鳞癌的发展机制,有望为食管癌的诊断、治疗和预后判断提供有效且特异的生物标志物,为其临床诊疗提供新的方向。方法:本研究采用42对ESCC和匹配的来自ESCC病例的相邻非肿瘤组织样本,非肿瘤组织样本取自相应患者自体癌旁正常组织。所有患者均在作者所在医院进行了组织病理学和临床诊断和外科治疗。所有患者均接受胸腔镜联合腹腔镜微创食管癌切除术,以及胃代食管左颈吻合术,淋巴结清扫范围为二野（胸野、腹野）或三野（颈野、胸野、腹野）淋巴结清扫。患者术前均未接受过局部或系统抗肿瘤治疗。从病历中收集临床信息。我们通过门诊、电话随访确定存活数据。我们应用总RNA提取试剂TRIzol reagent提取标本（食管鳞癌组织与癌旁正常组织）中的总RNA。RNA的质量检测内容包括纯度、浓度与完整性。使用二代测序平台Hiseq-2500完成高通量测序。通过建立cDNA文库并进行生物信息学分析,从而筛选出差异性表达的lncRNA。使用qRT-PCR法对全部样本的差异性表达lncRNA的表达水平进行验证。并使用核质分离实验检测差异性表达lncRNA的细胞定位。选择小干扰RNA（siRNAs）和一种无明确靶点的阴性对照（NC）转染ESCC细胞系。观察转染后的细胞系的增殖情况。使用Transwell方法对转染后细胞系的迁移和侵袭能力进行检测。将带有NC或siRNA的转染细胞皮下注射到裸鼠体内,在6周观察期结束时,处死小鼠,取出肿瘤组织并称重。将差异性lncRNA与预后相关指标进行联合分析。收集患者的临床病理资料。探讨差异性表达的lncRNA在不同临床病理情况下的表达情况。我们通过使用Kaplan-Meier生存分析,研究差异性表达lncRNA以及各临床病理特征与生存率的关系,并绘制生存曲线,采用Log-rank法进行检验。我们进一步进行单因素与多因素分析,分析并找出可能影响术后生存率的独立危险因素。使用Ber-Ep4,CD44v6单克隆抗体联合检测食管鳞癌区域淋巴结微转移情况。针对差异性表达的lncRNA以及各个患者的局部淋巴结微转移情况,采用Sperman相关性分析,探讨差异性表达的lncRNA与淋巴结微转移阳性情况之间的相关性。结果:RNA质量检测结果显示各个样本纯度及浓度符合实验要求。琼脂糖凝胶电泳方法检测结果显示各个样本RNA的完整性良好。所有样本通过RNA质量控制。使用高通量测序技术,对2对食管鳞癌组织及其对应癌旁正常组织,进行测序。分析食管鳞癌中差异性表达的lncRNA倍数变化,设定变化倍数在1.5倍以上的为有意义改变。测序分析结果显示筛选出一组差异性表达lncRNA,变化倍数（包括高表达与低表达）在1.5倍以上的lncRNA共181个,其中86个lncRNA在ESCC组织中相对高表达,95个lncRNA在ESCC组织中相对低表达。采用生物学信息分析的方法,发现LINC00680是在ESCC组织中表达上调最多的lncRNA之一,在本研究中,我们选择LINC00680作为研究的目标lncRNA。使用GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）与CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库检索,结果显示在包括食管癌在内的多种癌细胞中,LINC00680亦呈高表达情况。我们利用UCSC Genome Browser完成对目标lncRNA的基因注释。我们使用qRT-PCR方法检测42例配对样本中LINC00680的表达水平。结果表明,LINC00680在90.5%（38/42）的癌组织中有明显的高表达,肿瘤组织的LINC00680表达情况与癌旁正常组织的表达情况存在显着性差异,上调倍数中位数为2.09（P<0.001）。我们进行了qRT-PCR分析,以评估LINC00680在ESCC细胞系中的表达。结果显示,与人正常食管上皮细胞系（HEEC）相比,两个细胞系（KYSE140和KYSE510）中的LINC0680表达水平相对较高。核质分离试验结果显示,大部分LINC00680表达主要集中在细胞核中而不是细胞质中。设计合成了两种siRNA（siRNA-1和siRNA-2）,转染后的细胞系中,LINC00680的表达被有效抑制。细胞增殖实验结果显示,在KYSE140、KYSE510细胞系中,使用siRNA敲低LINC00680可显着抑制ESCC细胞增殖。其中siRNA-1抑制LINC00680细胞增殖的效能更加显着。迁移与侵袭实验结果显示,siRNA转染的ESCC的迁移率以及侵袭能力显着降低。裸鼠异种移植实验结果显示抑制LINC00680基因表达后,ESCC异种移植物的体内生长能力也受到抑制。通过LINC00680与食管鳞癌临床病理因素之间的关系分析,结果显示,LINC00680的表达水平与年龄、吸烟情况、肿瘤长度、淋巴结转移和TNM分期显着相关（P<0.05）。而LINC00680的表达与性别、家族史、肿瘤位置、分化或T期无关。LINC0680高表达的患者生存率明显低于LINC00680低表达的患者。单因素分析结果显示,除了LINC00680的表达情况外,N分期、TNM分期也是ESCC患者总生存率的重要的预后因素。而性别、年龄、吸烟状态、家族史、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度与T分期与生存率无明显相关。多因素分析结果表明,LINC00680的表达是导致总生存率下降的唯一独立因素（HR:3.192,95%CI:1.197-8.510,P=0.020）。食管癌区域淋巴结微转移检测方面,Ber-Ep4与CD44v6同时阳性表达率为26.2%（11/42）。根据qRT-PCR检测到的LINC00680的表达水平。采用Spearman相关性分析两者的关系,结果显示二者表达呈正相关（r=0.487,P=0.001）,提示LINC00680的表达情况与淋巴结微转移检测结果存在显着的相关性。结论:综上所述,我们的研究结果显示LINC00680为一种新的ESCC潜在癌基因,它在细胞增殖、迁移和侵袭中起到重要作用。而LINC00680可能是ESCC潜在的重要预后因子。然而,在ESCC中,LINC00680相关细胞迁移和侵袭的潜在机制仍不清楚。进一步的研究有助于更深入了解ESCC中LINC00680的作用机理。
黄世文[10]（2013）在《亚砷酸钠诱引角质形成细胞恶性转化及其机制研究》文中指出在流行病学的研究报告中充分显示无机砷为人类致癌物,长期无机砷暴露除引发皮肤癌外也会有肺癌、膀胱癌、肝癌等癌症的发生。然而动物实验尚未直接证实砷化物的致癌性。为进一步了解无机砷的致癌性,并从人类皮肤角质形成细胞起源角度探索砷致皮肤癌发生的分子机制将为进一步理解砷致皮肤癌发生发展的机理提供新的证据,同时也为寻找对早期预防、早期诊断和治疗有价值的新的分子标记提供线索。由于皮肤是无机砷的主要靶组织,也是对砷毒性最敏感的组织之一,因此正常人皮肤角质形成细胞对于砷毒性作用的研究具有重要的实际意义。HaCaT永生化的人角质形成细胞株（以下简称HaCaT细胞）来源于正常人皮肤,与正常皮肤角质形成细胞分化特性相似,可无限传代,但无致瘤性,是体外研究砷致癌等作用机制的理想模型。因此本研究以HaCaT细胞为研究对象,采用存在于自然界中对人体毒性较大的三价无机砷：亚砷酸钠（sodium arsenite, NaAsO2）进行长期（30代,约4个月）、低浓度诱导其恶性转化。结果发现,NaAsO2处理HaCaT细胞至25代后（约100天）,以皮下注射方式将细胞注射进入到裸鼠左腋下,可见肿瘤的形成,肿瘤组织切片观察判定是鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）,属于砷引起皮肤癌的一种类型。长期低水平砷暴露诱导成致瘤性的HaCaT细胞群中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞（Cancer stem cells, CSCs）,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-κ B的激活和对P53的抑制有关。采用基因芯片技术、荧光定量PCR技术分析NaAsO2处理导致致瘤性转化的HaCaT细胞和同期配对的对照组HaCaT细胞的基因表达谱变化,通过生物信息学分析发现细胞增殖、免疫系统反应、细胞生长、细胞粘附运动等生物过程的失调或改变在长期低浓度NaAsO2诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中发挥重要作用。差异基因参与多条与肿瘤及癌干细胞密切相关的信号通路,如Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-κB、PI-3K/AKT等信号通路。与这些生物过程、信号通路密切相关的基因可能是砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的关键因子,如鼠类胸腺瘤病毒（v-akt）同源体2/β-rac蛋白激酶（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ, AKT2）,骨髓细胞瘤病毒同源的MYC原癌基因（v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC）, MDM2癌基因（Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2）,细胞周期蛋白D3（cyclin D3, CCND3）,丝裂原活化蛋白激酶3K14（mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14）, Jak蛋白酪氨酸激酶-1（Janus kinase1, JAK1）,基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase9, MMP9）, PTEN抑癌基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）, ATM抑癌基因（Ataxia telangiectasia mutated, ATM）,信号传导子及转录激活子5A（Signal transducer and activator of transcription5A, STAT5A）, Rho相关蛋白激酶2（Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2）等。第一章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的研究为进一步了解无机砷的致癌性,因此利用0.05ppm（约0.4μM）NaAsO2处理人永生化角质形成细胞株（HaCaT）大约4个月,探讨暴露在长时间低浓度无机砷下的HaCaT细胞的生长情形,诱导HaCaT细胞发生致瘤性转化,为进一步探索、分析转化过程中肿瘤干细胞标志物表达变化和基因表达谱的变化提供基础。HaCaT细胞常规培养于完全培养基DMEM。长时间细胞培养的做法是接种5×105个HaCaT细胞于100ml培养瓶中并且分别处理0,0.05ppm NaAsO2,当满2天时更换新的DMEM培养液,满4天时则进行隔代培养。总共隔代培养30代,约4个月中NaAsO2持续存在于DMEM培养液中。细胞培养期间,倒置显微镜下观察每代细胞形态的变化并拍照。并进行软琼脂克隆形成率（Colony-forming efficiency, CFE）等实验验证细胞的转化、应用MTT法测定转化细胞的增殖能力、流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）检测转化细胞的细胞周期、并将恶性转化和同期配对传代的对照组HaCaT细胞注射于Balb/c裸鼠左侧腋窝皮下,观察肿瘤形成情况,并作组织切片、HE染色后进行组织病理学鉴定。NaAsO2处理HaCaT细胞至25代后（约100天）,以皮下注射方式将细胞打入裸鼠左腋下,可见肿瘤的形成。并且借由观察肿瘤组织切片判定是鳞状细胞癌,是砷引起皮肤癌的一种类型。经长期低浓度无机砷刺激的HaCaT细胞发生了致瘤性转化。此外,HaCaT细胞还有下列几项的变化：（1）软琼脂克隆形成实验表明NaAs02长期低浓度处理的细胞具有了非停泊性依赖生长的特性。（2）光镜下观察到细胞于培养瓶内长满时有较高的细胞密度,出现排列紊乱、重叠交叉生长现象,并出现多核巨细胞。（3）MTT检测结果表明长期低浓度NaAs02处理的HaCaT细胞的增殖能力较对照组细胞明显增强。（4）NaAsO2处理的HaCaT细胞较未处理的细胞有更多的细胞处于细胞周期的S、G2/M期,说明受NaAsO2处理细胞的增殖能力旺盛。本部分实验成功建立了低水平NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞恶性转化模型,从而为进一步探讨砷化物所致细胞恶性转化分子机制提供了基础。第二章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞标志物的表达及意义本部分旨在探讨肿瘤干细胞在砷致人角质形成细胞恶性转化中的作用及其影响因素,以期发现或揭示砷致皮肤癌过程中的肿瘤干细胞特异性标志物及相关信号转导通路。分别对第0,5,10,15,20,25,30代低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞和同期配对的对照组HaCaT细胞滴片进行荧光免疫组化（Immunofluorescence, IF）染色；同时提取上述不同时间点两组细胞的总蛋白,利用蛋白印迹（Western blotting, WB）等实验技术对可能存在的肿瘤干细胞标志物进行筛选,与其他检测指标进行相关分析。并分析其影响因素。结果显示,长期低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞中,肿瘤干细胞标志物CD44v6蛋白含量有逐渐增加的表现；对照组CD44v6蛋白含量未发现明显变化。恶性转化的HaCaT细胞（第25代）其CD44v6蛋白含量比同期对照组HaCaT细胞（第25代）显着增加（P<0.05）。NaAsO2处理组HaCaT细胞在15代后,CD44v6阳性表达显着增加,定位于细胞膜,在25代和30代约有8%的阳性率。对CD44v6的表达与软琼脂克隆阳性率之间的关系进行分析,结果发现,r=0.949,P=0.01,两者呈正相关性。肿瘤干细胞标志物CD44v6表达变化可能与砷致NF-κB激活、P53抑制有关。实验结果提示,长期低水平砷暴露所致皮肤损伤或癌组织中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-K B的激活和对P53的抑制有关。第三章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的基因表达变化本部分实验目的是探讨NaAsO2诱引人类皮肤细胞HaCaT恶性转化过程中基因表达谱的改变,分析差异基因的生物学意义,进而揭示在NaAsO2诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中可能起关键作用的生物学通路和分子,为理解砷暴露致皮肤癌发生的分子机制提供线索。实验方法：提取正常HaCaT细胞和转化HaCaT细胞的总RNA,应用高通量的基因芯片技术分析转化HaCaT细胞和正常对照HaCaT细胞基因表达谱的改变,运用实时定量PCR技术验证芯片的结果,并结合生物信息学分析对差异基因进行功能分类,同时探讨差异基因之间以及差异基因与其他基因之间可能的网络联系。结果发现,恶性转化的HaCaT细胞和正常对照HaCaT细胞共发现2,871个表达差异基因（P<0.05时,差异倍数≥2）,约占芯片探针总数的6.1%（2,871/44,000）。其中1,415个基因表达上调,1,456个基因表达下调。其中表达上调的基因包括鼠类胸腺瘤病毒（v-akt）同源体2/β-rac蛋白激酶（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ,AKT2）,骨髓细胞瘤病毒同源的MYC原癌基因（v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC）, MDM2癌基因（Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2）,细胞周期蛋白D3（cyclin D3, CCND3）,丝裂原活化蛋白激酶3K14（mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14）等；表达下调的基因有Jak蛋白酪氨酸激酶-1（Janus kinase1, JAK1）,基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase9, MMP9）, PTEN抑癌基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）,ATM抑癌基因（Ataxia telangiectasia mutated, ATM）,信号传导子及转录激活子5A（Signal transducer and activator of transcription5A,STAT5A）, Rho相关蛋白激酶2（Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2）等。实时荧光定量PCR分析上述基因在两组细胞中的表达,进一步证实了芯片结果的可靠性。用Gene Ontology（GO）数据库将差异基因进行功能注释,结果发现差异基因产物主要参与细胞增殖（cell proliferation）、免疫系统反应（immune system process）.细胞生长（cell development）、细胞粘附（cell adhesion）等与肿瘤发生、发展相关密切的功能调节。KEGG和Biocarta数据库分析差异基因之间的相互作用网络,结果发现差异基因参与多条信号通路,其中已知Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、TGF-beta、 NF-κB、PI-3K/AKT等信号通路与肿瘤及癌干细胞密切相关。AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等与多条通路有关,可能在NaAsO2诱导HaCaT细胞的转化过程中发挥关键的作用。以上结果提示：长期低浓度NaAsO2处理直接引起HaCaT细胞基因表达改变,砷暴露导致的细胞增殖、免疫调节、细胞粘附运动失衡或改变在其诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中可能发挥重要作用,Wnt、MAPK等多条信号通路参与砷诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程,AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是这一过程中的关键分子。结论1.人永生化角质形成细胞株HaCaT在长期低水平NaAsO2作用下发生了致瘤性转化。2.长期低水平砷暴露诱导成致瘤性的HaCaT细胞群中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。3.肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-κB的激活和对P53的抑制有关。4.分析了正常HaCaT细胞、转化HaCaT细胞的基因表达变化。在转化过程中发生改变的基因主要参与调节细胞增殖、免疫反应、细胞粘附运动等生物学过程；以及Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-kB、PI-3K/AKT等多条信号通路；AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是转化过程中的关键分子。
二、粘附分子CD44v6和p53基因在乳腺癌组织中的表达及其与DNA倍体的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、粘附分子CD44v6和p53基因在乳腺癌组织中的表达及其与DNA倍体的关系（论文提纲范文）
（1）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（2）CUL4B在结直肠癌干细胞调控中的作用及其分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 CUL4B促进CCSCs的形成、自我更新和转移 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CRL4B协同PRC2抑制miR34a转录进而促进其靶基因的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| Western原始数据 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述: 肿瘤类器官模型建立及应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文学术目录 |
| 英文论文 |
| 附件 |
（3）MSI2介导Notch1信号通路维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 MSI2与CD44v6在肝癌中的临床相关性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 MSI2与Notch1信号通路在CD44v6+肝癌干细胞“干性”维持中的关键作用 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 MSI2通过LFNG活化Notch1信号通路维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MSI2在肿瘤干细胞和肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录:博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胃癌CAR-T及c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CAR-T在胃癌中的研究现状 |
| 1.2.1 胃癌CAR-T的基础研究 |
| 1.2.2 胃癌CAR-T的临床实验注册 |
| 1.3 c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.3.1 c-Met CAR-T的基础研究现状 |
| 1.3.2 c-Met CAR-T临床实验注册 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MET基因在胃癌中表达及功能的生物信息学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 数据获取及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 c-Met在胃癌组织及细胞系中表达的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胃癌组织c-Met免疫组化表达分析 |
| 3.1.2 胃癌细胞培养 |
| 3.1.3 提取细胞RNA |
| 3.1.4 PCR反应 |
| 3.1.5 提取细胞总蛋白 |
| 3.1.6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳 |
| 3.1.7 流式细胞计数检测胃癌细胞系c-Met、PD-L1 表达 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 c-Met在胃癌中的表达水平高于癌旁组织 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同胃癌细胞系中MET、PD-L1 基因转录水平 |
| 3.2.3 WB分析不同胃癌细胞系中c-Met表达水平 |
| 3.2.4 FCM分析不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1 的细胞膜表面表达水平 |
| 3.2.5 CCLE数据库中MET、PD-L1 表达验证 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 MET过表达慢病毒及CAR慢病毒的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒构建 |
| 4.1.2 载体酶切 |
| 4.1.3 目的基因片段扩增 |
| 4.1.4 酶连重组 |
| 4.1.5 转化 |
| 4.1.6 质粒抽提 |
| 4.1.7 重组质粒基因测序 |
| 4.1.8 质粒转染与慢病毒收获 |
| 4.1.9 慢病毒感染293T |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CAR序列结构 |
| 4.2.2 载体酶切、目的片段扩增、酶连重组验证 |
| 4.2.3 慢病毒的验证 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体外验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MET-OE慢病毒感染HGC-27 细胞 |
| 5.1.2 CAR-T细胞制备 |
| 5.1.3 慢病毒CAR-T感染效率的检测 |
| 5.1.4 CAR-T细胞增殖检测 |
| 5.1.5 CAR-T细胞亚群及表型检测 |
| 5.1.6 靶细胞刺激对CAR-T激活的影响 |
| 5.1.7 靶细胞刺激对CAR-T中 PD-1 表达的影响 |
| 5.1.8 细胞因子分泌检测 |
| 5.1.9 LDH释放实验 |
| 5.1.10 7-AAD杀伤实验 |
| 5.1.11 CD107a脱颗粒反应 |
| 5.1.12 高内涵成像分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 MET-OE慢病毒感染可使HGC-27 细胞过表达c-Met |
| 5.2.2 c-Met CAR和 c Met-PD1/CD28 CAR慢病毒感染以成功构建对应的CAR-T |
| 5.2.3 CAR-T细胞中CD8~+T细胞、中央记忆T细胞的比例升高 |
| 5.2.4 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中激活表型增多 |
| 5.2.5 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中 PD-1 表达升高 |
| 5.2.6 PD1/CD28 融合受体能刺激CAR-T中 IFN-γ、TNF-α分泌,抑制IL-6分泌 |
| 5.2.7 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T对靶细胞的杀伤 |
| 5.2.8 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T的脱颗粒水平 |
| 5.2.9 高内涵成像显示CAR-T识别并杀伤肿瘤 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体内验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 实验细胞 |
| 6.1.5 皮下成瘤及活体小动物成像 |
| 6.1.6 HE染色 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 c-Met CAR-T及 c Met-PD1/CD28 CAR-T对 c-Met~+胃癌模型具有明显的抑制作用 |
| 6.2.2 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对正常器官没有明显的脱靶毒性 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 讨论、结论与展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 嵌合抗原受体T细胞的新型设计方案 |
| 参考文献 |
| HGF/c-Met信号通路及其在胃和胃食管交界癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 附图 技术路线图 |
| 附表 |
| 附缩略词简表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 nm23、EGFR、VEGF在 NSCLC中的表达及其相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 仪器与试剂 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 靶向逆转nm23 对非小细胞肺癌放疗敏感性的影响及可能机制. |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PET/CT对 nm23 表达的NSCLC分期和放疗计划的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 实验观测指标 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 nm23 基因研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）核糖体调节蛋白1在神经母细胞瘤中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 组织标本及患者临床资料 |
| 1.3 主要试剂耗材 |
| 1.4 主要仪器和耗材 |
| 1.5 常用试剂配置 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 免疫组化 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞病毒感染 |
| 2.4 qPCR检测RNA的相对表达量 |
| 2.5 WB法检测蛋白表达量 |
| 2.6 基因组编辑CRISPR/Cas9技术 |
| 2.7 Cruise酶切检测技术 |
| 2.8 MTT实验 |
| 2.9 克隆形成实验 |
| 2.10 流式细胞仪检测细胞周期实验 |
| 2.11 Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.12 细胞侵袭实验——侵袭小室法 |
| 2.13 Transwell小室法检测细胞迁移 |
| 2.14 划痕实验 |
| 2.15 Co-IP实验 |
| 2.16 统计分析 |
| 结果 |
| 1.RRS1基因在神经母细胞瘤中的表达水平 |
| 2.慢病毒感染细胞后RRS1的敲除及敲减效率 |
| 3.敲除及敲减RRS1基因后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖能力明显下降 |
| 4.流式细胞仪检测敲除及敲减RRS1后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡水平增加 |
| 5.敲除及敲减RRS1后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞迁移能力下降 |
| 6.小室法检测敲除及敲减RRS1后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的侵袭能力 |
| 7.神经母瘤细胞SH-SY5Y中RRS1抑制凋亡发生的分子机制探索 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）MiR-34a调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和粘附及其分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MiR-34a对骨肉瘤细胞功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-34a负调控其靶基因DUSP1 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MiR-34a负调控DUSP1影响骨肉瘤细胞的效应蛋白 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多倍体 |
| 1.2 多倍体细胞形成的机制 |
| 1.2.1 核内复制 |
| 1.2.2 有丝分裂滑移 |
| 1.2.3 细胞质分裂失败 |
| 1.2.4 细胞融合 |
| 1.3 多倍体研究与应用 |
| 1.3.1 多倍体与肿瘤的发生 |
| 1.3.2 多倍体与育种 |
| 1.4 SP600125的应用及相关研究进展 |
| 1.5 细胞应激响应与自稳态的维持 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 SP600125诱导鱼类细胞多倍化的转录组学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏和传代培养 |
| 2.2.2 SP600125孵育细胞 |
| 2.2.3 细胞总RNA的提取与检测 |
| 2.2.4 构建cDNA文库和测序 |
| 2.2.5 测序数据后的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 测序数据的拼接组装结果 |
| 2.3.2 Unigene的功能注释 |
| 2.3.3 差异表达基因(DEGs)的分析 |
| 2.3.4 差异表达基因的GO注释 |
| 2.3.5 COG功能注释分析 |
| 2.3.6 KEGG代谢通路注释 |
| 2.3.7 qRT-PCR验证差异表达基因(DEGs) |
| 2.3.8 SP600125诱导下细胞增殖调控相关功能基因的筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 p53信号通路参与调节SP600125诱导细胞多倍化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 SP600125对细胞间隔循环处理 |
| 3.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测细胞周期相关基因的表达 |
| 3.2.5 Western Blot检测 |
| 3.2.6 PFT-α孵育及细胞增殖活力检测 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SP600125间隔循环处理对细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 SP600125孵育对p53信号通路基因表达的影响 |
| 3.3.3 p53抑制剂处理对SP600125诱导细胞多倍化的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 纺锤体组装检验点对SP600125诱导细胞多倍化的调控作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Hoechst33342染色 |
| 4.2.2 免疫荧光分析 |
| 4.2.3 qRT-PCR检测有丝分裂检测点相关基因的表达 |
| 4.2.4 Western blot技术 |
| 4.2.5 二倍体鲫尾鳍细胞pAd-mCMV-MAD2-GFP3Flag-pA的构建及鉴定 |
| 4.2.6 包装与纯化重组腺病毒载体pAd-MAD2 |
| 4.2.7 过表达pAd-MAD2重组腺病毒感染二倍体鲫尾鳍细胞的验证 |
| 4.2.8 流式细胞仪检测过表达MAD2对二倍体鲫尾鳍细胞周期的影响 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 观察在SP600125孵育下细胞的增殖状态 |
| 4.3.2 SP600125孵育对纺锤体检测点(SAC)相关基因表达的影响 |
| 4.3.3 Mad2过表达重组腺病毒载体的构建 |
| 4.3.4 过表达MAD2对SP600125诱导细胞多倍化的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 SP600125胁迫下细胞稳态的维持研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 透射电镜 |
| 5.2.2 免疫荧光 |
| 5.2.3 qRT-PCR验证 |
| 5.2.4 线粒体ATP含量检测 |
| 5.2.5 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基于转录组数据分析在SP600125胁迫下细胞应激响应的相关信号通路 |
| 5.3.2 在SP600125胁迫下细胞应激响应的相关基因表达水平分析 |
| 5.3.3 SP600125胁迫对线粒体结构与功能的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 研究展望 |
| 6.2.1 SP600125诱导多倍化过程中细胞的染色体行为研究 |
| 6.2.2 SP600125诱导多倍体鱼的培育方法研究 |
| 6.2.3 SP600125诱导的四倍体细胞系生物学稳定性研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学习期间发表的主要论文 |
| 致谢 |
（9）长链非编码RNA LINC00680在食管鳞癌增殖侵袭中功能及与预后微转移相关性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.1 患者与标本 |
| 1.1.1 入组患者与标本收集 |
| 1.1.2 RNA的提取 |
| 1.1.3 提取RNA的质量控制 |
| 1.2 lncRNA筛选及增殖侵袭功能检测 |
| 1.2.1 高通量RNA检测 |
| 1.2.2 细胞系与培育条件 |
| 1.2.3 RNA提取与qRT-PCR |
| 1.2.4 核质分离试验 |
| 1.2.5 小干扰RNA转染 |
| 1.2.6 细胞增殖测定分析 |
| 1.2.7 细胞迁移和侵袭分析 |
| 1.2.8 裸鼠异种移植试验 |
| 1.3 lncRNA与预后、微转移相关性的研究 |
| 1.3.1 lncRNA与患者生存的关系 |
| 1.3.2 食管癌区域淋巴结微转移的检测 |
| 1.3.3 差异性表达的lncRNA与微转移的关系 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 RNA质量控制结果 |
| 2.2 lncRNA筛选及增殖侵袭功能检测结果 |
| 2.2.1 RNA序列分析检测ESCC中上调的LINC00680 |
| 2.2.2 在ESCC组织中,LINC00680 表达上调 |
| 2.2.3 ESCC细胞系中LINC00680 的表达 |
| 2.2.4 LINC00680 促进ESCC细胞体外增殖 |
| 2.2.5 LINC00680 基因敲低抑制体外细胞迁移与侵袭 |
| 2.2.6 LINC00680 基因敲低抑制ESCC异种移植物的体内生长 |
| 2.3 lncRNA与预后微转移相关性的研究结果 |
| 2.3.1 LINC00680 与临床病理因素之间的相关性 |
| 2.3.2 LINC00680 表达与食管鳞癌患者生存情况的关系 |
| 2.3.3 食管鳞癌区域淋巴结微转移的检测 |
| 2.3.4 LINC00680 与区域淋巴结微转移的关系 |
| 讨论 |
| 3.1 lncRNA与恶性肿瘤的关系 |
| 3.2 lncRNA与食管癌的关系 |
| 3.3 LINC00680 与食管癌的关系 |
| 3.4 研究的不足以及展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）亚砷酸钠诱引角质形成细胞恶性转化及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的研究 |
| 1 摘要 |
| 2 前言 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞标志物的表达及意义 |
| 1 摘要 |
| 2 前言 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的基因表达变化 |
| 1 摘要 |
| 2 前言 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、粘附分子CD44v6和p53基因在乳腺癌组织中的表达及其与DNA倍体的关系（论文参考文献）
- [1]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [2]CUL4B在结直肠癌干细胞调控中的作用及其分子机制[D]. 李彦军. 山东大学, 2020(11)
- [3]MSI2介导Notch1信号通路维持CD44v6+肝癌干细胞“干性”的机制研究[D]. 王喜菊. 华中科技大学, 2020(02)
- [4]c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究[D]. 陈聪. 兰州大学, 2020(01)
- [5]nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响[D]. 夏露花. 新疆医科大学, 2020(07)
- [6]核糖体调节蛋白1在神经母细胞瘤中的功能及机制研究[D]. 曹奕. 青岛大学, 2019(07)
- [7]MiR-34a调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和粘附及其分子机制[D]. 刘刚. 苏州大学, 2019(04)
- [8]SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究[D]. 莫艳秀. 湖南师范大学, 2019(01)
- [9]长链非编码RNA LINC00680在食管鳞癌增殖侵袭中功能及与预后微转移相关性的研究[D]. 郑斌. 福建医科大学, 2019(07)
- [10]亚砷酸钠诱引角质形成细胞恶性转化及其机制研究[D]. 黄世文. 广西医科大学, 2013(10)