一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究（论文文献综述）
田姗姗,刘冉冉,钱晓龙,郭晓静,张锴[1]（2021）在《石蜡包埋组织中组蛋白的提取分离和翻译后修饰的定量分析》文中指出组蛋白翻译后修饰（HPTMs）参与基因转录调控,其异常与肿瘤等重大疾病的发生发展密切相关。石蜡包埋组织是当前疾病研究的重要样本资源,对肿瘤机制和标志物研究具有重要意义。目前基于质谱的蛋白质组学技术已成为HPTMs分析的有力工具,而针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样品的HPTMs分析还十分有限。该研究发展了一种基于高效液相色谱-串联质谱的FFPE组织样本HPTMs分离分析新方法。通过研究并优化组蛋白的提取策略,建立了FFPE组织样本脱蜡水化处理、蛋白质提取与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相结合的组蛋白提取和分离方法。通过研究FFPE切片数量、组蛋白化学衍生化方法等对组蛋白鉴定的影响,确定了组蛋白处理的具体步骤。通过HPLC分离结合非依赖性采集模式的质谱分析,鉴定了组蛋白修饰的类型、位点和丰度。最后,将优化的实验方法应用于FFPE临床样本的HPTMs分析,鉴定了2例人乳腺浸润性癌和癌旁正常组织的HPTMs图谱,均获得了100种以上的不同组蛋白修饰形式的多肽。定量分析了他们的差异性水平,通过主成分降维分析,发现浸润性癌和癌旁正常组织之间组蛋白修饰丰度存在明显的差异,且差异性具有一定的规律,特别是涉及转录调控的组蛋白修饰与乳腺癌的预后和治疗靶点具有相关性,进而探讨了乳腺癌中异常HPTMs的生物学意义。该研究对临床石蜡样本中组蛋白修饰的分离分析以及肿瘤表观遗传标志物的检测进行了有益的探索。
冯学珍[2]（2021）在《裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究》文中研究表明高血压是导致心血管疾病的主要危险因素之一,血管紧张素转化酶（Angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制剂是治疗高血压的主要药物。化学合成的ACE抑制剂,如赖诺普利、卡托普利等由于其副作用使其应用受限,从海洋食源生物中筛选ACE抑制肽成为众学者研究的热点。ACE抑制肽在酶解活性肽组分中存在含量相对较少、分离纯化步骤繁琐等问题,且有关抑制肽作用机理的研究相对较少。本文以裙带菜为研究对象,基于“蛋白改性-亲和介质制备-生物亲和纯化”的思路,运用超声预处理改性裙带菜蛋白,采用磁性金属有机骨架（Magnetic metal-organic framework,MOF）材料固定化ACE构建亲和介质,亲和分离获得新颖ACE抑制肽,研究抑制肽与ACE的相互作用,以解决亲和材料制备复杂、使用前仍需活化等问题。主要内容如下:（1）采用超滤、凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱（reversed high performance liquid chromatography,RP-HPLC）等对裙带菜蛋白酶解产物进行分离纯化,获得高抑制ACE活性组分,经质谱仪鉴定其氨基酸序列为:Tyr-Lys-Tyr-Tyr（YKYY）,IC50=71.88±1.43μM,经检索为已报道的抑制肽。实验纯化步骤相对较少,用于酶解的菠萝蛋白酶更安全、经济。（2）运用超声预处理对蛋白进行改性,改性蛋白酶解后产物具有更高水解度（Degree of hydrolysis,DH）和ACE抑制率:在超声功率200 W、超声时间15 min、超声工作间歇比1:2（s/s）的条件下,裙带菜蛋白(4.0mg·m L-1)酶解产物的ACE抑制率由41.2±2.0%提高至88.1±2.1%,DH由9.2±0.2%提高至15.6±0.3%,肽含量由13.6±0.2%提高至19.5±0.2%。运用紫外、红外、荧光光谱等分析其原因,结果表明超声预处理可诱导裙带菜蛋白结构由α-螺旋转向β-折叠,蛋白结构变得松弛,酶解产物中疏水性氨基酸含量增加;同时,显着提高了蛋白的溶解度、乳化活性、表面疏水性等性质。（3）采用磁性MOF材料（Fe3O4@ZIF-90）吸附-交联猪肺ACE,最佳固定化条件为:蛋白浓度为10.0 mg·m L-1,固定化pH值为8.0,温度为45℃,时间为2.0 h,Fe3O4@ZIF-90-ACE活力可达0.028±0.006 U·g-1。酶学性质研究结果表明固定化酶的最适pH为8.3,最适温度为45℃,与游离酶相比,固定化ACE增强了对温度的抵抗力,提高了酶的最适温度。稳定性研究结果表明固定化ACE具有较好的热、pH和储存稳定性,重复使用6次后的相对酶活保留率为54.05%,具有良好的操作稳定性。采用密度泛函理论和光电子能谱等方法从结合能、金属离子亲和层析、成键等方面探讨了Fe3O4@ZIF-90分离、固定化ACE机理,结果表明Zn2+可与ACE中的咪唑基（His）、硫醇基（Trp）和吲哚基（Cys）等配位结合亲和分离猪肺ACE,ACE通过物理吸附和共价结合固定在Fe3O4@ZIF-90上。（4）采用Fe3O4@ZIF-90-ACE磁性亲和分离结合RP-HPLC从裙带菜蛋白酶解液中分离纯化获得具有较高抑制ACE活性组分,经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪鉴定为未报道的ACE抑制肽:Lys-Asn-Phe-Leu（KNFL）,IC50=225.87±2.7μM。与传统分离纯化方法相比,亲和纯化时间短,过程简化,亲和介质Fe3O4@ZIF-90-ACE的制备无需活化,且固定化粗提ACE具备成本低、稳定性高、可操作性强的优点。（5）运用初始速率法、等温滴定量热法、紫外、荧光、圆二色谱和分子对接等方法,解析抑制肽KNFL与ACE的作用机理。抑制肽KNFL对ACE的抑制类型为混合型抑制模式;KNFL与ACE多位点结合,且结合为自发的放热反应;二者相互作用的热力学模式为熵、焓双驱动模式,KNFL可与ACE的活性中心和非活性中心发生氢键相互作用,使ACE分子直径增加;KNFL对ACE产生荧光猝灭效果,影响ACE的Trp-、Tyr-残基周围的微环境;使ACE的α-螺旋和无规则卷曲结构向β-折叠结构转变,引起肽链重排,导致ACE空间构象发生变化,ACE活性下降。采用分子动力学模拟对对接复合物进行稳定性考察,通过根均方偏差、均方根涨落和回旋半径的分析结果表明对接复合物在模拟条件下是稳定的,最终建立KNFL与ACE相互作用模型,KNFL与ACE通过多步的诱导契合和构象选择形成相对稳定的复合物。
刘慧[3]（2021）在《捻转血矛线虫Hc-CAP-15、Hc-CAP-17编码基因的克隆和功能研究》文中研究表明捻转血矛线虫病呈全球性分布,在国内外广泛流行,是当前反刍动物最为易感的消化道寄生虫病之一。目前我国对于该病的防控主要依赖于驱虫药物的使用,而长期不合理的使用驱虫药物导致了捻转血矛线虫单耐药株甚至多重耐药虫株的出现,极大增加了防控难度。该病的肆虐严重制约畜牧业的健康发展,因此寻求新的药物靶标或合适的疫苗候选分子对于捻转血矛线虫病的防控迫在眉睫。CAP蛋白家族（Cysteine-rich secretory proteins,Antigen 5 and Pathogenesis-related1,CAP）在原核生物和真核生物中广泛存在,其蛋白种类繁多且功能复杂。最近基于捻转血矛线虫基因组学和转录组学分析表明,在捻转血矛线虫中存在大量的CAP蛋白分子,但其确切功能尚未解析。因此,本研究从CAP蛋白是否能够调节虫体生长发育的功能研究入手,从已报道的捻转血矛线虫的CAP分子中选取Hc-CAP-15、Hc-CAP-17为研究对象,利用转录水平分析、免疫组化及RNAi等实验方法,初步探求该类分子在捻转血矛线虫生长发育过程中的调控作用。（1）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17编码序列的扩增及蛋白序列分析根据捻转血矛线虫基因组数据,通过设计合成特异性引物,扩增获得Hc-cap-15和Hc-cap-17的编码区序列。随后通过氨基酸序列比对和进化树分析表明捻转血矛线虫Hc-CAP-15、Hc-CAP-17均具备由四个CAP基序构成的CAP结构域及保守的半胱氨酸残基,表明二者均为典型的单结构域CAP蛋白。（2）Hc-cap-15和Hc-cap-17在捻转血矛线虫不同时期的转录水平分析提取捻转血矛线虫虫卵和各个时期虫体的RNA,利用荧光定量PCR测定Hccap-15和Hc-cap-17在虫体各个时期的转录水平。两个基因在虫体的各个时期均被转录,其中Hc-cap-15在四期幼虫转录水平最高,Hc-cap-17在二期幼虫转录水平最高。（3）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17在捻转血矛线虫成虫的组织定位通过构建Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的原核表达质粒,表达并纯化了两个重组蛋白。用其免疫新西兰大白兔获得了抗体效价良好的两株多克隆抗体,在此基础上,利用纯化后的多克隆抗体对两个蛋白在捻转血矛线虫成虫中的表达进行了组织定位。其中Hc-CAP-15主要表达于雌性成虫的肠道微绒毛、卵巢、表皮中及雄虫的肠道中;Hc-CAP-17主要表达于雌性成虫的肠道壁及卵巢中。（4）Hc-cap-15和Hc-cap-17的RNAi干扰实验利用浸泡法RNA干扰技术,对Hc-cap-15及Hc-cap-17进行基因沉默,从而探究其在虫体生长发育过程中发挥的具体功能,其中利用特异性siRNA对Hc-cap-15转录水平实现了有效的基因沉默,Hc-cap-15转录水平的下调对虫体由脱鞘三期幼虫到四期幼虫的发育率没有显着影响,但是会导致四期幼虫虫体的体长增长,表明Hccap-15对于虫体的增长具有负调节作用。而不管是dsRNA还是siRNA都无法下调Hc-cap-17的转录水平。（5）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的反应原性鉴定利用新生小羊的阴性血清及感染捻转血矛线虫山羊的阳性血清对Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的免疫原性进行检测,结果表明,重组Hc-CAP-15和Hc-CAP-17蛋白均能够被感染了捻转血矛线虫的血清所识别,证明其具有良好的反应原性。本研究对CAP蛋白家族成员Hc-CAP-15和Hc-CAP-17在捻转血矛线虫时空表达特征及生长发育方面的功能研究,为进一步研究两分子的功能及作用机制奠定了坚实的基础,这对于完善捻转血矛线虫生长发育的分子机制及新型防控措施的开发具有重要意义。
孙惠惠[4]（2021）在《O1群El Tor型霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统介导分型噬菌体VP2感染的研究》文中进行了进一步梳理噬菌体在生物学中占有独特的地位,不同噬菌体能够特异地感染一类细菌,通过细菌-噬菌体相互作用,推动了细菌的多样化。利用不同噬菌体对目标细菌的裂解能力,还可以进行细菌变异分析和分型。多种噬菌体以霍乱弧菌为宿主菌,自上个世纪七十年代,在我国的霍乱防控中,利用选择的五株烈性噬菌体,建立了针对O1群El Tor生物型霍乱弧菌的噬菌体分型方案,用于病原学和流行病学监测分析,并结合生物分型进行菌株引发流行的危险性评价。研究霍乱弧菌分型噬菌体的感染及抗性机制,有助于理解霍乱弧菌的变异和噬菌体分型机理。受体是噬菌体感染细菌的第一步骤中的特异分子,目前对霍乱弧菌五株分型噬菌体及其受体的研究,已有研究发现霍乱弧菌的一种多聚谷氨酰胺（polyQ）膜蛋白为噬菌体VP1的感染受体,VP3的受体为核心寡糖和外膜蛋白TolC,为双受体感染方式;霍乱弧菌O-抗原是噬菌体VP4的受体,OmpW是噬菌体VP5的受体。VP2噬菌体为环状双链DNA,电镜下观察VP2为短尾噬菌体,基因组全长39853bp（GenBank 登录号为 NC005879）,G+C 含量为 50.56%,预测存在 49个开放阅读框（ORF）,同源噬菌体包括Vibriophage phiCJY、Vibriophage H3及Vibriophage Rostov 6。本研究中对VP2成熟颗粒进行了全蛋白组的质谱鉴定,显示有34个蛋白与预测的基因相对应。噬菌体感染细菌的第一步是与宿主细胞表面的受体特异性结合。噬菌体VP2用于O1群El Tor型霍乱弧菌的噬菌体分型,然而其感染受体尚未知。在本研究中,我们开展了 VP2在霍乱弧菌上感染的受体研究。通过采用转座子插入霍乱弧菌建立霍乱弧菌受体菌突变库、然后将VP2加入突变库中的细菌进行裂解的策略,挑选出了 VP2抗性株,通过测序及序列比对,针对其中明确为膜结构蛋白的突变基因epsM进行进一步研究。该基因编码霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统（T2SS）的内膜蛋白EpsM。将epsM基因进行了缺失和回补,得到了epsM缺失株（N-ΔepsM）及回补株（N-ΔepsM+C）。裂解实验显示N-△epsM对VP2产生了抗性,但VP2可以裂解回补株。VP2对N-ΔepsM的吸附实验表明,N-△epsM不能吸附VP2,说明内膜蛋白EpsM虽然与VP2吸附无关,但在VP2成功感染中发挥作用。将T2SS位于最外侧的外膜蛋白epsD基因缺失以及进行回补,得到epsD的缺失株（N-ΔepsD）和回补株（N-△epsD+C）,裂解实验证实EpsD在VP2感染霍乱弧菌中发挥作用,是VP2吸附霍乱弧菌的位点。进一步通过体内蛋白互作及pull-down等实验证实了 VP2的受体为霍乱弧菌T2SS的外膜蛋白EpsD。通过本研究发现,在霍乱弧菌中,Ⅱ型分泌系统除了作为霍乱毒素分泌和丝状噬菌体释放的运输装置外,还作为噬菌体感染的受体,可能是噬菌体DNA注射的通道,该研究拓展了对Ⅱ型分泌系统在细菌中的作用的认识。
于大力[5]（2020）在《秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶的多样性研究》文中认为秸秆还田是当今世界上普遍重视的一项耕作管理措施,不仅可以减少化肥使用,提高土壤有机质含量,从而保持土壤肥力,还能杜绝秸秆焚烧,减轻环境污染。土壤微生物不仅是土壤有机质和养分循环的动力,土壤微生物多样性对于反映土壤肥力状况及生态环境演变还具有重要的指示作用。细菌漆酶在木质素降解和土壤有机质的周转过程中发挥了重要的作用,是土壤质量和功能的潜在指标。与真菌漆酶相比,细菌漆酶在热稳定性、氯离子的耐受性及最适pH范围广等方面更有优势,而且无需糖基化的修饰,容易进行异源表达,使细菌漆酶更适用于纺织、造纸、环保等行业。为理解秸秆还田土壤有机质的周转过程以及相应的微生物驱动机制,对细菌漆酶资源进行开发和利用,本论文对秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶的多样性进行了深入研究。首先采用16S rRNA基因和ITS扩增子测序,分析了秸秆还田土壤耕层和下层的微生物群落结构。秸秆还田土壤细菌和真菌群落有丰富的多样性,具有独特的组成和结构。通过不同土层比较发现,虽然细菌丰度在耕层土壤和下层土壤没有显着差异,但细菌群落结构明显不同,真菌多样性在不同土层变化不大。以秸秆还田耕层土壤为材料筛选到7株产漆酶细菌,除两株为芽孢漆酶外均为胞内漆酶。通过宏基因组测序技术对秸秆还田土壤耕层微生物进行了全面解析,发现其中的功能基因以氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢相关基因为主,与牛瘤胃、天牛肠道、堆肥等木质纤维素降解菌群的代谢模式相似,表明在秸秆还田土壤中存在大量在秸秆降解过程中发挥重要作用的微生物。而其中碳水化合物活性酶编码基因的组成和分布又与其他木质纤维素降解菌群有所区别,暗示秸秆还田土壤微生物可能与其他木质纤维素降解菌群有不同的木质纤维素降解方式。利用隐含马尔科夫模型对秸秆还田土壤宏基因组中预测基因编码的氨基酸序列进行检索,共获得322个可能的细菌漆酶。这些细菌漆酶具有一定的新颖性和丰富的多样性,主要来源于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）,表明在秸秆还田土壤中以变形菌门为主,在放线菌门和芽单胞菌门的协同作用下进行木质素的加工和代谢。通过秸秆还田土壤来源的细菌漆酶和参考序列共同构建系统发育树进一步表明秸秆还田土壤中细菌漆酶的多样性,发现其中很多可能具有优良的酶学性质。选取部分细菌漆酶基因进行PCR扩增及测序,结果表明宏基因组数据预测的基因中绝大部分代表了秸秆还田土壤微生物中真实存在的基因。对于其中5个不具有完整开放读码框的细菌漆酶基因,利用热不对称交错PCR扩增其侧翼序列,经过序列拼接及开放读码框预测后获得其全长序列。将克隆到的7个细菌漆酶基因的完整开放读码框翻译成氨基酸序列,通过序列比对发现它们之间有较大的差异并且具有较高的新颖性。尽管这7个细菌漆酶的氨基酸序列在整体水平上有很大的差异,但其铜离子结合位点高度保守,预测的三维结构也比较相似,均为典型的三域漆酶。其中四个含有双精氨酸转运系统的信号肽,表明其可以通过双精氨酸转运系统穿过细胞膜。将细菌漆酶基因lacS1在大肠杆菌中进行异源表达,通过微好氧发酵,成功表达出有活性的重组漆酶LacS1。重组漆酶LacS1发挥催化活性的pH范围较宽,最适pH为5.0,在pH 5.0-9.0的条件下具有较好的稳定性。此外,该重组酶的最适温度为50℃,50℃处理1 h后仍剩余25%左右的活力;有较高的Cl-耐受性。这些性质表明其潜在的应用前景。本论文通过对秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶多样性进行深入研究,全面解析了秸秆还田土壤微生物的群落结构特征,发现其中存在大量特异的在秸秆降解过程中发挥重要作用的微生物,其细菌漆酶具有一定的新颖性和丰富的多样性,很多可能具有优良的酶学性质,为秸秆还田土壤木质素的降解及有机质周转过程的理解提供了指导,同时为细菌漆酶资源的开发和利用提供了材料。
滕海东[6]（2020）在《2’-氟-2-’脱氧腺苷的核苷磷酸化酶催化合成技术研究》文中研究说明核苷类似物已经被广泛地用于癌症和抗病毒的治疗,但是其昂贵的药物成本阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用。传统的化学合成方法步骤多,耗时长,还需要进行技术难度高的糖基活化以及对糖苷形成的立体和区域选择性控制。因此,能在环境友好的条件下有效合成核苷类似物的生物催化提供了更有吸引力的替代途径,从而使工艺更有效清洁。本文选取胸苷磷酸化酶（Thymidinephosphorylase,TP）与嘌呤核苷磷酸化酶（Purinenucleosidephosphorylase,PNP）作为生物催化剂,催化 2’-氟-2’-脱氧尿苷与腺嘌呤进行转糖基化反应生成2’-氟-2’-脱氧腺苷。首先根据大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶的空间结构,选取PNP原始序列上的活性位点进行定点饱和突变,利用高效液相色谱检测产物的浓度,筛选出酶活表现最佳的突变株,酶活比野生型菌株提升了 47.6%。其次探索并优化了突变株的最佳培养条件:接种2%（v/v）LB的活化菌液,加入卡那霉素至终浓度为40 mg/L,在37℃,200 rpm摇床里培养至菌液OD600=0.5Abs,加入IPTG至终浓度为0.9mM,在33℃,200 rpm摇床里继续培养12h。并在5L发酵罐中对工程菌进行发酵试验,培养共得到198 g湿菌体。最后,对筛选出的表现最优异的突变株MF13与TP催化2’-氟-2’-脱氧尿苷和腺嘌呤的转糖基化反应条件进行优化,得到最佳反应条件是:反应温度48℃,100 mM磷酸缓冲溶液pH=7.0,2’-氟-2’-脱氧尿苷25 mM,腺嘌呤62.5 mM,投入的TP酶液2mL,MF13酶液2mL,反应产率可以达到60.2%。在优化的反应条件的基础上,将反应体系放大了 50倍,在反应36h后产物浓度3.85g/L,产率达到了 57.4%。
张玉龙[7]（2019）在《HMGB1诱导EPCs迁移在创面新生血管形成中的作用及分子机制研究》文中研究说明研究背景:烧伤和各种原因造成的创伤以及糖尿病等缺血性疾病所引起的难愈性皮肤创面是临床治疗的难点问题。延迟愈合的创面最终还容易形成增生性瘢痕,从而导致机体不同程度的功能障碍。有效的创面修复需要在新生肉芽组织内生成大量的新生血管,来维持创面的营养及细胞外基质的沉积。因此创面组织中新生血管的生长对于肉芽组织的形成,改善创面微循环,减少感染的发生,促进慢性难愈创面或深度烧伤创面的愈合等起着非常重要的作用,其形成障碍将直接导致创面愈合延迟或愈合不良。因此进一步明确难愈性皮肤创面愈合的机理,促进其早期修复是创伤研究领域的焦点问题。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）参与了创面新生血管形成并发挥重要作用。EPCs有助于缺血或损伤后局部组织的再内皮化和增强血管形成能力,从而加速缺血肢体或创面的愈合,为创面愈合提供了一个新的研究策略和治疗方向。然而,EPCs参与新生血管形成的具体分子机制尚无定论,需要进一步研究。目前的研究结果证实骨髓来源的干细胞在骨髓中活化、动员,进一步归巢、迁移到受损或缺血组织的过程中可能涉及多种趋化因子的参与。高迁移率族蛋白B1（High mobility group box-1,HMGB1）是一种广泛存在的核内DNA结合蛋白,参与DNA的转录、复制、修复等。HMGB1可由坏死的细胞以及受LPS、TNF-α、IL-1等刺激后的炎性细胞主动释放或分泌到胞外,作为一种致炎因子引起炎症反应。除了诱导炎症反应之外,分泌到胞外的HMGB1还具有类似于趋化性细胞因子的功能,是细胞迁移普遍的调节因子。既往研究提示创面局部产生的各种炎症因子在诱导细胞迁移到损伤部位,促进创面修复过程中起着重要作用。结合HMGB1具有的趋化效应,对于创面局部HMGB1水平的升高是否能够对EPCs的迁移起着趋化性细胞因子的作用,使其达到创面局部并形成新生血管,促进皮肤缺损部位组织结构和功能的修复目前尚无太多的研究。文献报道HMGB1可促使胎鼠和成年鼠的血管相关干细胞中层成血管细胞穿过内皮细胞屏障,促进其迁移和增殖作用。基于以上证据我们假设在EPCs向皮肤创面迁移归巢和增殖分化过程中,除已知的SDF-1、VEGF等趋化因子外,创面炎症反应过程中释放的HMGB1可能也是诱导EPCs迁移的重要分子之一。晚期糖基化终产物受体（RAGE）是一种免疫球蛋白,是HMGB1天然的受体,HMGB1与RAGE结合后可活化信号通路中的多种信号转导分子。目前认为参与EPCs迁移的信号通路与MAPK、PI3K、JAK2-STAT以及转录因子NF-κB等有关。细胞骨架是参与介导细胞变形、细胞运动及细胞迁移等重要活动的蛋白质体系。PI3K/Akt信号通路在VEGF或者降血脂药物如西伐他汀诱导的EPCs定向迁移中起重要角色,并可增加EPCs内NO的合成。因此,我们设想HMGB1在作为趋化因子诱导EPCs迁移过程中可能涉及胞内PI3K/Akt/e NOS信号通路,通过影响细胞骨架结构的改变进而参与EPCs的细胞迁移活动,HMGB1可能在诱导EPCs向创面迁移,增加创面肉芽组织新生血管形成,促进创面愈合过程中起着重要作用。本研究拟重点研究HMGB1对EPCs的生物活性和功能的影响以及HMGB-RAGE轴激活PI3K/Akt/e NOS信号通路对EPCs迁移的影响;揭示HMGB1促进EPCs迁移的可能机制,明确提出创面炎症反应释放的HMGB1是趋化EPCs向创面局部迁移的重要分子之一,深化对创面修复血管形成过程中EPCs调控机制的认识,为创面治疗提供新的着力点和理论支持。研究方法:第一部分小鼠皮肤创面HMGB1的表达变化及其对创面愈合的影响建立小鼠皮肤创面模型,利用Western blot和q RT-PCR检测HMGB1在STZ诱导糖尿病小鼠及正常小鼠创面组织中的表达变化。使用HMGB1高表达腺病毒载体处理糖尿病小鼠创面,观察其对糖尿病小鼠创面愈合的影响,同时用HE、Masson、HIC染色观察创面肉芽组织厚度,新生血管数量以及胶原形成情况。使用Flow cytometry技术检测正常小鼠及高血糖小鼠外周血中CD34+细胞数量的差异性。明确HMGB1在创面愈合中的作用。第二部分HMGB1对体外培养的EPC细胞生物学特性的影响及趋化作用利用梯度离心法分离小鼠骨髓内皮祖细胞并用细胞流式方法和细胞荧光鉴定。利用Western blot和q RT-PCR实验以及免疫荧光检测检测EPCs表面HMGB1受体RAGE的表达;利用CCK-8和ELISA实验检测HMGB1对EPCs分化增殖及旁分泌作用的影响。内皮细胞小管形成实验检测其体外血管形成能力;通过体外划痕实验和细胞迁移实验检测不同浓度的HMGB1对EPCs迁移诱导作用,明确HMGB1对EPCs生物学特性及迁移的趋化作用。第三部分HMGB1诱导EPC迁移的分子机制研究通过体外划痕实验和细胞迁移实验检测并观察不同信号通路抑制剂（LY294002,PI3K抑制剂;PD98059,ERK抑制剂;L-NAME,e NOS抑制剂）以及RAGE中和抗体对HMGB1诱导EPCs迁移的影响,Western blot检测PI3K、Akt、ERK、P38,JNK蛋白的表达变化及其磷酸化过程;EPC中F-actin荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞骨架结构变化。明确PI3K/Akt/e NOS信号通路在HMGB1诱导EPCs迁移中的作用,进一步揭示HMGB1诱导EPCs迁移的分子机制。研究结果:第一部分1.正常小鼠创面组织中HMGB1蛋白在创面形成的第1天明显升高,第3天达到高峰,而后逐渐回落。在DM组中,HMGB1蛋白在创面中的表达量明显低于血糖正常小鼠。2.糖尿病小鼠创面愈合时间较血糖正常小鼠时间明显延长。与此同时其外周血中CD34+细胞的数量明显低于正常小鼠。3.糖尿病小鼠创面使用外源性HMGB1治疗之后,创面愈合时间较对照组明显缩短。同时在创面肉芽组织形成、新生血管形成数量及胶原纤维形成等方面均优于对照组。第二部分1.流式细胞检测结果显示贴壁细胞表达CD133（49.6%）、CD34（90.03%）和VEGFR-2（76.48%）。同时表达Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的阳性细胞数达95%以上。2.HMGB1上调EPCs中RAGE蛋白的表达,并具有浓度依赖性。3.在一定浓度的范围内（1-50ng/m L）HMGB1能够促进EPCs增殖活力,而使用Anti-RAGE-Ab后这一作用明显减弱。4.在一定的浓度范围内,HMGB1增强了EPCs分泌SDF-1的能力,同时促进EPCs的血管形成能力。5.HMGB1促使EPCs发生迁移且具有浓度依赖性。第三部分1.HMGB1增加EPCs的运动迁移。Anti-RAGE抗体显着抑制HMGB1诱导的EPCs运动。同时LY294002（PI3K抑制剂）预处理的HMGB1诱导的EPCs迁移运动被阻断,L-NAME（ENOS抑制剂）预处理的EPCs,其迁移运动也被明显减弱。但PD98059（ERK抑制剂）对HMGB1诱导的细胞运动没有影响。2.HMGB1（100ng/m L）上调了p-Akt的表达,LY294002和Anti-RAGE抗体的加入则明显抑制了这一结果。PD98059和Anti-RAGE抗体的加入,使p-ERK的表达下调,说明HMGB1-RAGE同样参与了ERK信号通路的磷酸化过程。3.HMGB1使EPCs中p-e NOS蛋白表达上调,而加入Anti-RAGE抗体、L-NAME则明显抑制了这一过程4.HMGB1处理的EPCs中NO的产量增加,而加入Anti-RAGE抗体、L-NAME（1m M）之后,NO的含量则明显减少。5.HMGB1参与了ERK信号通路的磷酸化过程,具有浓度和时间的依赖。在实验中发现HMGB1激活ERK信号通路对EPCs的细胞迁移作用并不明显。说明虽然HMGB1参与了ERK的磷酸化过程,但是其作用并没有表现在细胞迁移中,其发挥的具体作用需要进一步研究来证实。6.HMGB1激活PI3K/Akt信号通路调节EPCs中的F-actin水平。但这一过程被LY294002和Anti-RAGE抗体所阻断。结论:1.正常小鼠创面中HMGB1蛋白的表达和CD34+细胞的数量要高于糖尿病小鼠。外源性HMGB1能够促进了糖尿病小鼠创面的愈合,增加上皮化速度和新生血管密度,同时增加糖尿病小鼠循环中CD34+细胞的数量。2.外源性HMGB1上调了EPCs中RAGE的表达,并具有浓度依赖性。HMGB1在一定浓度范围内促进了EPCs的增殖和旁分泌功能。同时有助于体外血管形成能力和细胞迁移活动。同时这些功能与RAGE呈正相关。3.HMGB1-RAGE信号级联的激活引起PI3K/Akt/e NOS信号通路激活,诱导NO的产生,引起细胞骨架发生形变,导致EPCs迁移事件的发生。说明PI3K/Akt信号通路与血管内皮细胞迁移及新生血管生成存在着密切的关系。RAGE可能是HMGB1诱导的EPCs通过PI3K/Akt信号通路迁移更为有效的受体。这些结果有助于阐明HMGB1诱导EPCs迁移的分子机制,揭示HGMB-RAGE依赖的PI3K/Akt/e NOS通路是影响创面愈合的潜在治疗靶点。4.尽管HMGB1参与了ERK、JNK、P38的磷酸化过程,但MEK/ERK信号通路对HMGB1诱导的EPCs迁移没有明显的影响。因此参与HMGB1-RAGE介导的细胞迁移的信号途径可能取决于细胞类型,MAPK/ERK也可能通过其他的方法参与血管形成行为。这些潜在的机制需要在进一步的实验中确认。
黄倩[8]（2019）在《蛋白酶脱胶对丝素材料结构和性能的影响》文中指出目前广泛使用中性皂或碳酸钠溶液用于去除蚕丝外围的丝胶,但会对丝素纤维造成明显破坏。中性蛋白酶能够在中性或接近中性环境,及相对较低的温度下催化丝胶的水解,部分中性蛋白酶对丝胶蛋白的水解具有一定的特异性,具有广泛应用于蚕丝脱胶的潜力。选择合适的中性蛋白酶和合适的工艺条件处理蚕丝,达到既除去蚕丝外围的丝胶,又尽量减轻对丝素的破坏效果,是真丝织物精炼及医用丝素蛋白纯化领域需要研究的重要问题。本文分别采用不同浓度的胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对家蚕生丝脱胶,并与碳酸钠脱胶进行对比,研究蛋白酶的种类、浓度对脱胶程度、丝素纤维理化性质、丝素蛋白分子量的影响。并将脱胶、溶解、透析后得到的丝素蛋白按分子量大小分离后,采用冷冻干燥法制备多孔丝素材料,探讨丝素蛋白高分子量组份对多孔材料的孔结构和力学性能的影响。首先,分别在胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的最高活性对应的温度和pH下,研究不同浓度（0.1g/L、1g/L、2g/L和4g/L）蛋白酶的蚕丝脱胶效果,及其对丝素纤维的表面形貌、力学性能、结构和组成的影响。脱胶率检测结果显示,随着脱胶所用蛋白酶浓度的增大,蚕丝的脱胶率增大,酶浓度相同的条件下,脱胶率高低顺序为:木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>枯草杆菌蛋白酶>菠萝蛋白酶;扫描电镜观察脱胶后纤维表面显示,2g/L和4g/L的胰蛋白酶、4g/L的枯草杆菌蛋白酶和菠萝蛋白酶、2g/L的木瓜蛋白酶脱胶后,蚕丝的表面光滑,无丝胶残留;红外吸收光谱和氨基酸组成对脱胶后丝素纤维中丝胶残留的分析结果显示,用浓度为2g/L的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,或用4g/L的菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶处理后,能够基本将蚕丝外围的丝胶脱除;力学性能测试显示,与脱胶前相比,虽经脱胶后蚕丝的拉伸强度均有所下降,但用菠萝蛋白酶脱胶后强度的下降幅度较小。其次,分别用浓度为4g/L的胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶,2g/L的木瓜蛋白酶及0.5g/L的Na2CO3对蚕丝脱胶,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、乌氏粘度、凝胶层析和流变学剪切粘度等分析测试手段,分析对比蚕丝经上述5种方案脱胶处理后对丝素蛋白分子量和溶液粘度的影响。结果显示,枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶脱胶获得的丝素蛋白的平均分子量分别为183.5kDa、183kDa、184.5kDa和170kDa,均高于碳酸钠脱胶获得的丝素蛋白的平均分子量142.5kDa。剪切粘度测试结果显示,菠萝蛋白酶脱胶获得的丝素蛋白的粘度最大,且上述几种蛋白酶脱胶获得的丝素蛋白粘度均高于碳酸钠脱胶获得的丝素蛋白。表明菠萝蛋白酶脱胶对丝素纤维有明显的保护作用,枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶对丝素的水解破坏程度也较轻,而碳酸钠脱胶对丝素纤维有明显的水解破坏。最后,将4g/L胰蛋白酶脱胶后获得的丝素纤维,经9.3MLiBr溶解后,加入二硫苏糖醇断裂重链和轻链之间的二硫键,以双层透析的方式,分离、去除丝素蛋白中低分子量组份,获得高分子量丝素蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离出来的高分子量丝素蛋白分子量进行鉴定。进一步,用高分子量丝素蛋白组份制备多孔材料,以常规丝素蛋白为对照组,初步探究高分子量丝素蛋白多孔材料的孔结构及力学性能。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,用二硫苏糖醇断裂丝素蛋白中的二硫键以及双层透析的方式,能够将胰蛋白酶脱胶获得的丝素蛋白低分子量组份分离出去,从而获得高分子量丝素蛋白组份;与未去除低分子量组份的丝素相比,用高分子量丝素蛋白组份制得的多孔材料内部,纤维状及网络状结构明显减少,多孔材料的抗压强度和抗压模量显着增大。
陈谨[9]（2016）在《大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究》文中研究表明脑缺血再灌注损伤是一种极为复杂的病理生理过程,涉及到很多种机制,如自由基的生成、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙离子浓度超载等,彼此构成一个互相促进的复杂网络。尽管对脑缺血再灌注损伤机制的研究在不断深入和发展,但是脑缺血再灌注损伤各种机制的枢纽点/交汇点尚不明确,有待于更深入地研究。为了探究缺血/再灌注损伤早中晚期所涉及的级联发病机制及探讨STV对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其相关的保护机制。我们运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型。采用无创伤的激光多普勒血流仪实施实时的检测,分析大鼠造模前后血流变化值,确保模型构建的可靠性。实时监控大鼠的心率、呼吸频率、血氧饱和度及体温等各项生理指标,排除手术之外的其他因素对动物模型构建造成的影响。对各分组大鼠进行行为学评分。应用脑切片氯化三苯基四氮唑（TTC）染色,最直观的评判脑梗死模型构建的成功与否,同时利用Image J软件来计算梗死面积,表观的衡量STV对脑梗死面积的改善作用。为了探究脑组织蛋白合理有效的分离体系,我们利用不同浓度（10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶和4.2%-17.85%T（线性梯度）,5%C（交联度）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）为分离系统。利用Western blot蛋白印迹技术检测Thioredoxin 1（Trx1）蛋白、Peroxiredoxin 2（Prx2）蛋白和Heat shock protein 60 kDa（Hsp60）蛋白分别在各组相对应的缺血2 hours/再灌注0 hour/6 hours/22hours/168 hours时间点的表达量,探究STV是否具有神经保护作用及其相关的可能机制。我们成功构建了大鼠脑缺血/再灌注模型,应用脑组织切片的氯化三苯基四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死面积,发现STV组跟阳性对照组大鼠的脑梗死面积比手术组减小,同时对于缺血2 hours/再灌注22 hours这个时间点的模型,STV组大鼠比阳性对照大鼠的脑梗死面积大,但是对于缺血2 hours/再灌注168 hours这个时间的模型,STV组大鼠比较阳性对照大鼠的脑梗死面积有所减小。这从一定的程度上说明了,STV对脑缺血组织具有一定的保护作用,且它的长期保护作用更为明显,作用效果强于阳性对照药依达拉奉。我们试验了几种不同浓度（10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C）的SDS-PAGE和4.2%-17.85%T（线性梯度）,5%C（交联度）SDS-PAGE,最终发现4.2%-17.85%T,5%C的SDS-PAGE对大鼠脑组织蛋白有较好的分离效果。免疫印迹结果表明在缺血2 hours/再灌注0 hour及6 hours时,STV给药组Hsp60表达量减少,说明STV在脑缺血早期能减少脑组织的应激反应。在缺血2 hours/再灌注22 hours,STV组Prx2的表达量明显升高和缺血2 hours/再灌注168 hours模型,Trx1的表达量明显升高,且其表达量也高于阳性对照组。说明Prx2在脑缺血中后期发挥良好的抗氧化作用,防止自由基对脑组织的损害。Trx1在脑缺血后期发挥良好的抗氧化和抗凋亡作用,防止神经元细胞的死亡。在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV组的Prx2的表达量高于同一时期Trx1的表达,说明在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV主要是通过上调Prx2的表达来发挥抗氧化作用。在缺血2 hours/再灌注168 hours时,STV主要是通过上调Trx1的表达来发挥抗凋亡作用。实验结果表明,在脑缺血再灌注损伤的不同时期,STV启动不同的信号通路来保护脑组织。除了上述的工作外,我们还进行了以下的工作。我们结合非变性微型二维凝胶电泳,网格凝胶切取以及定量液相色谱串联质谱（获取数据非依赖型模式,MSE）,用来构建数字化非变性蛋白质谱图,同时,为了改进此研究模式,我们采用了新的质谱串联模式,采用了增强离子淌度分离的数据非依赖模式串联质谱（HDMSE模式）,并将此模式运用到人类血浆蛋白质分析的工作中。即人类血浆样品经过非变性微型二维凝胶电泳分离,将得到的低密度脂蛋白（LDL）所在的长方形区域（18 mm×4.8 mm）切割成72块方形胶粒并将胶粒经过一系列处理后进行定量的液相色谱串联质谱分析（LC-MS/MS）。所得的结果显示,与MSE相比,HDMSE表现出更好的分析性能,鉴定所得蛋白质种类数目提高了约50%,并且每种蛋白质在更多的胶粒中被检测到,即对每种蛋白质得到了更全面的谱图。运用LC-HDMSE,共检测出253种蛋白质,根据每种蛋白质的含量分布信息我们重构了非变性蛋白质谱图。从谱图中,我们可以看到,载脂蛋白B-100（Apo B-100）在凝胶切取区域是含量最丰富的蛋白质,主要分布区域在pI 5.1-6.1,表观分子量在约1000 kDa,即其所在的位置在编号为39-42相对应的四块胶粒中。用我们编写的Excel宏程序去检索蛋白质谱图,结果表明蛋白质的含量峰值落在Apo B-100的集中区域。在252个蛋白质中有22个蛋白质符合此标准,且这22个蛋白质中有19个蛋白质被报道跟LDL相关。这个方法仅仅需要几微升的血浆样品,且蛋白质的分离原理与常用的超速离心法完全不同。这个方法所得到的结果将会使我们对LDL的结构和功能有更深程度的理解。
谢玲姬[10]（2016）在《内生菌SYfx213.2发酵产薯蓣皂苷酶条件优化及酶的初步分离纯化》文中研究表明薯蓣皂苷元是合成200多种甾体激素类药物的重要前体物质,薯蓣皂苷元及其衍生物具有抗氧化、降血脂、促癌细胞凋亡等多种生理活性。传统生产薯蓣皂苷元的方法是用强酸将盾叶薯蓣植物中的甾体皂苷水解为皂素,但是该方法对薯蓣植物利用率低且会产生大量的酸性废水,对环境造成极大的污染。微生物酶解法温和、环保,是解决废水污染问题与提高薯蓣皂苷元产量理想的方法。本论文利用内生真菌SYfx213.2发酵产皂苷酶获得薯蓣皂苷元的方法,是生产薯蓣皂苷元的新途径。本论文从分子生物学角度对内生真菌SYfx213.2进行属种鉴定,以其发酵产物薯蓣皂苷酶为研究对象,利用响应面方法优化内生真菌SYfx213.2发酵产薯蓣皂苷酶条件,对最佳发酵产酶条件进行了发酵验证,并初步对薯蓣皂苷酶进行分离纯化探索。主要研究结果如下:（1）对高效产酶菌株（SYfx213.2）进行分子生物学鉴定,鉴定结果曲霉属黄曲霉。（2）对内生真菌发酵条件进行单因素优化,单因素优化结果分别为:蔗糖8.0 g/L,牛肉膏2.0 g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钾0.5g/L、接种量15%、转速100rpm、发酵温度33℃、初始pH5.0、装液量为100m L。（3）对发酵条件进行响应面优化,响应面分析得最佳条件分别为蔗糖8.95g/L,牛肉膏2.08g/L,诱导物14.12g/L,该条件下发酵产薯蓣皂苷元产量为19.73mg/L。相比内生真菌SYfx213.2产酶条件优化前薯蓣皂苷元产量提高6.8倍,皂苷酶酶活力达到178U。（4）丙酮沉淀优化后,丙酮沉淀最佳方案为:薯蓣皂苷酶粗酶液v:丙酮溶液v=1:4,沉淀时间1小时,丙酮沉淀次数为一次。（5）通过两次非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对薯蓣皂苷酶分离纯化进行了初步探索,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定皂苷酶蛋白条带分子量为64.60kDa。
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究（论文提纲范文）
（1）石蜡包埋组织中组蛋白的提取分离和翻译后修饰的定量分析（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 仪器、试剂与材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 石蜡包埋组织中组蛋白的提取 |
| 1.2.2 组蛋白的胶内化学衍生化与酶解 |
| 1.2.3 LC-MS/MS分析 |
| 1.2.4 数据分析 |
| 1.3 伦理声明 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 石蜡包埋组织中组蛋白的提取方法与条件优化 |
| 2.1.1 组蛋白提取策略与评价 |
| 2.1.2 组蛋白提取方法的条件优化 |
| 2.2 乳腺癌石蜡包埋临床样本中组蛋白翻译后修饰分析 |
| 2.2.1 样本选取与组蛋白提取 |
| 2.2.2 组蛋白翻译后修饰的定性鉴定 |
| 2.2.3 组蛋白翻译后修饰的定量分析 |
| 3 结论 |
（2）裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 血管紧张素转化酶 |
| 1.2.1 ACE的分类和结构特点 |
| 1.2.2 ACE在血压调节系统中的作用 |
| 1.3 ACE抑制肽的研究进展 |
| 1.3.1 海洋来源的ACE抑制肽 |
| 1.3.2 ACE抑制肽的制备 |
| 1.3.3 ACE抑制肽的分离纯化 |
| 1.3.4 ACE抑制肽的构效关系 |
| 1.3.5 ACE抑制肽的作用机理 |
| 1.4 裙带菜的研究进展 |
| 1.4.1 裙带菜的主要化学成分 |
| 1.4.2 裙带菜的药理作用 |
| 1.5 论文研究的目的、内容和创新点 |
| 1.5.1 目的与意义 |
| 1.5.2 主要内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 第二章 裙带菜ACE抑制肽的分离纯化与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 裙带菜蛋白的提取 |
| 2.3.2 裙带菜蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.3.3 蛋白酶的筛选 |
| 2.3.4 裙带菜ACE抑制肽的分离 |
| 2.3.5 反相高效液相色谱法分离ACE抑制肽 |
| 2.3.6 高活性组分的结构鉴定 |
| 2.3.7 ACE抑制肽的分子对接 |
| 2.3.8 检测方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 牛血清白蛋白、葡萄糖及马尿酸的标准曲线 |
| 2.4.2 裙带菜蛋白的提取及酶解蛋白酶的筛选 |
| 2.4.3 裙带菜ACE抑制肽的分离 |
| 2.4.4 反相高效液相色谱法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 2.4.5 结构鉴定分析 |
| 2.4.6 分子对接分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 超声预处理改性裙带菜蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 裙带菜蛋白的超声预处理 |
| 3.3.2 水解度(DH)的测定方法 |
| 3.3.3 多肽含量的测定方法 |
| 3.3.4 浊度和粒径的测定方法 |
| 3.3.5 裙带菜蛋白的差示扫描量热分析 |
| 3.3.6 裙带菜蛋白的光谱分析 |
| 3.3.7 裙带菜蛋白的功能特性的研究 |
| 3.3.8 氨基酸组成分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 裙带菜蛋白的超声预处理 |
| 3.4.2 裙带菜蛋白浊度的测定和粒径分布 |
| 3.4.3 裙带菜蛋白的差示扫描量热分析 |
| 3.4.4 裙带菜蛋白的光谱分析 |
| 3.4.5 裙带菜蛋白功能特性的研究 |
| 3.4.6 氨基酸组成分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 磁性金属有机骨架亲和介质的制备及性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 磁性金属有机骨架Fe_3O_4@ZIF-90 的制备 |
| 4.3.2 猪肺ACE的提取 |
| 4.3.3 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化 ACE条件优化 |
| 4.3.4 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE性质研究 |
| 4.3.5 Fe_3O_4@ZIF-90 及固定化ACE的表征 |
| 4.3.6 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE机理研究 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE的制备工艺研究 |
| 4.4.2 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE性质研究 |
| 4.4.3 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE的稳定性研究 |
| 4.4.4 Fe_3O_4@ZIF-90 及固定化ACE的表征 |
| 4.4.5 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE机理研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 磁性金属有机骨架亲和介质分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 超滤法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.2 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE亲和分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.3 反相高效液相色谱法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.4 ACE抑制肽的结构鉴定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 超滤法分离 |
| 5.4.2 磁性亲和分离 |
| 5.4.3 反向高效液相色谱法分离 |
| 5.4.4 MALDI-TOF/TOF MS分析 |
| 5.4.5 ACE抑制肽KNFL的构效关系 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 ACE抑制肽的抑制机理研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 ACE抑制肽的抑制类型研究 |
| 6.3.2 等温滴定量热法测定酶催化反应动力学参数 |
| 6.3.3 ITC法测定ACE抑制肽与ACE结合的热力学参数 |
| 6.3.4 紫外光谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.5 荧光光谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.6 圆二色谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.7 分子对接法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.8 分子动力学模拟研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 ACE抑制肽的抑制类型分析 |
| 6.4.2 等温滴定量热法测定酶催化反应动力学参数 |
| 6.4.3 ACE抑制肽与ACE结合的热力学分析 |
| 6.4.4 紫外光谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.5 荧光光谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.6 圆二色谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.7 分子对接法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.8 分子动力学模拟法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.9 ACE抑制肽KNFL与 ACE相互作用模型的建立 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（3）捻转血矛线虫Hc-CAP-15、Hc-CAP-17编码基因的克隆和功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫的生活史及形态学特征 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫病流行病学特征 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫病的致病机理和临床表现 |
| 1.2 捻转血矛线虫病的药物防控 |
| 1.3 CAP蛋白家族概述 |
| 1.3.1 CAP蛋白家族的命名 |
| 1.3.2 CAP蛋白结构与功能之间的关系 |
| 1.3.3 植物寄生虫中CAP蛋白的研究进展 |
| 1.3.4 动物寄生虫中CAP蛋白的研究进展 |
| 1.3.5 捻转血矛线虫CAP蛋白的研究进展 |
| 1.4 RNAi的作用机制及其在寄生线虫分子功能研究的应用 |
| 1.4.1 RNAi概述 |
| 1.4.2 siRNA介导的RNAi作用机制 |
| 1.4.3 RNAi在探究寄生线虫分子功能中的应用 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及实验用菌株 |
| 3.1.2 主要仪器及设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试剂溶液的配制 |
| 3.2.1 抗生素和细菌培养基溶液的配制 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 |
| 3.2.3 SDS-聚丙烯凝胶电泳主要溶液 |
| 3.2.4 表达和纯化蛋白所需溶液 |
| 3.2.5 Western-blot缓冲液 |
| 3.2.6 ELISA的主要溶液 |
| 3.2.7 捻转血矛线虫的收集溶液及虫体培养液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物感染模型的建立 |
| 3.3.2 捻转血矛线虫不同发育阶段虫体的收集和纯化 |
| 3.3.3 捻转血矛线虫ITS-2鉴定 |
| 3.3.4 捻转血矛线虫RNA 的提取及cDNA的合成 |
| 3.3.5 捻转血矛线虫Hc-cap-15和Hc-cap-17基因的克隆 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.7 Hc-cap-15和Hc-cap-17在虫体不同发育阶段的转录水平测定 |
| 3.3.8 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 3.3.9 免疫组化 |
| 3.3.10 捻转血矛线虫RNAi实验 |
| 3.3.11 Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的反应原性检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 捻转血矛线虫虫卵和各个时期虫体的收集 |
| 4.1.1 捻转血矛线虫ITS-2的鉴定 |
| 4.1.2 捻转血矛线虫形态学观察 |
| 4.2 捻转血矛线虫Hc-CAP-15结构与功能研究 |
| 4.2.1 Hc-cap-15基因序列的获得 |
| 4.2.2 捻转血矛线虫Hc-CAP-15的序列分析 |
| 4.2.3 Hc-CAP-15的进化树分析 |
| 4.2.4 Hc-cap-15在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录水平分析 |
| 4.2.5 捻转血矛线虫Hc-CAP-15的多克隆抗体制备 |
| 4.2.6 Hc-CAP-15在成虫中的组织定位 |
| 4.2.7 捻转血矛线虫Hc-CAP-15的反应原性检测 |
| 4.2.8 Hc-cap-15的RNA干扰实验 |
| 4.3 捻转血矛线虫Hc-CAP-17结构与功能研究 |
| 4.3.1 Hc-cap-17基因序列的获得 |
| 4.3.2 捻转血矛线虫Hc-CAP-17的序列分析 |
| 4.3.3 Hc-CAP-17的进化树分析 |
| 4.3.4 Hc-cap-17在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录水平分析 |
| 4.3.5 捻转血矛线虫Hc-CAP-17的多克隆抗体制备 |
| 4.3.6 捻转血矛线虫Hc-CAP-17在成虫中的组织定位 |
| 4.3.7 捻转血矛线虫Hc-CAP-17的反应原性检测 |
| 4.3.8 Hc-cap-17的RNA干扰实验 |
| 5 讨论 |
| 5.1 Hc-cap-15和Hc-cap-17基因的鉴定和序列特征 |
| 5.2 Hc-cap-15和Hc-cap-17的转录水平分析 |
| 5.3 Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的组织定位分析 |
| 5.4 RNAi结果分析 |
| 5.5 展望 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）O1群El Tor型霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统介导分型噬菌体VP2感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一章 噬菌体VP2的一般生物学特性及基因组研究 |
| 一、试剂材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 噬菌体传代(噬斑法) |
| (二) 噬菌体大量富集 |
| (三) 噬菌体DNA提取 |
| (四) 噬菌体浓缩(PEG沉淀法) |
| (五) 噬菌体VP2的效价测定(双层平板法) |
| (六) VP2噬菌体形态观察 |
| (七) 最佳感染复数(MOI)的测定 |
| (八) VP2的一步生长曲线的测定 |
| (九) VP2的热稳定性 |
| (十) 噬菌体蛋白质谱分析 |
| 三、实验结果 |
| (一) 噬菌体形态 |
| (二) 最佳感染复数 |
| (三) VP2的一步生长曲线的测定 |
| (四) VP2的热稳定性 |
| (五) 噬菌体基因组特征序列分析 |
| (六) VP2噬菌体颗粒蛋白质谱分析及生物学信息分析 |
| (七) 全基因组核苷酸一致性分析 |
| 四、讨论 |
| 第二章 霍乱弧菌分型噬菌体VP2受体的研究 |
| 第一节 O1群El Tor型霍乱弧菌转座子突变抗性株的筛选 |
| 一、试剂与材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二节 霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统参与了VP2感染验证 |
| 一、试剂与材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三节 尾丝蛋白gp20与外膜蛋白EpsD相互作用验证 |
| 一、gp20与EpsD的克隆表达与纯化 |
| 二、His-gp20重组蛋白与霍乱弧菌的体外结合 |
| 三、细菌双杂交系统分析EpsD和gp20的相互作用 |
| 四、His融合蛋白沉降实验 |
| 五、His融合蛋白沉降验证gp20突变株与EpsD的相互作用 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 文献综述 |
| 噬菌体 |
| 一、噬菌体分类 |
| 二、有尾噬菌体和宿主之间的相互作用 |
| 三、噬菌体治疗 |
| 霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶的多样性研究（论文提纲范文）
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 土壤有机质概况 |
| 1.1.1 土壤有机质的功能 |
| 1.1.2 土壤有机质周转的关键环节 |
| 1.2 木质素的结构及降解 |
| 1.2.1 木质素的结构组成 |
| 1.2.2 木质素的降解酶系 |
| 1.3 漆酶概论 |
| 1.3.1 漆酶的来源与分布 |
| 1.3.2 漆酶的结构特征 |
| 1.3.3 漆酶的催化机理 |
| 1.3.4 漆酶的理化性质 |
| 1.3.5 漆酶的多样性 |
| 1.3.6 漆酶的应用 |
| 1.4 土壤微生物 |
| 1.4.1 土壤微生物区系 |
| 1.4.2 土壤微生物多样性 |
| 1.4.3 土壤微生物多样性的研究方法 |
| 1.5 秸秆还田 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 秸秆还田土壤微生物多样性分析 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基和溶液 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 土壤化学性质测定 |
| 2.2.2 土壤总DNA的提取和检测 |
| 2.2.3 细菌16SrRNA基因丰度的测定 |
| 2.2.4 扩增子测序及生物信息学分析 |
| 2.2.5 产漆酶细菌的筛选 |
| 2.2.6 产漆酶细菌的鉴定 |
| 2.2.7 产漆酶细菌的显微观察 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 秸秆还田土壤的化学性质 |
| 2.3.2 土壤总DNA的提取 |
| 2.3.3 扩增子测序数据分析 |
| 2.3.4 OTU聚类分析 |
| 2.3.5 细菌和真菌群落的α多样性 |
| 2.3.6 细菌和真菌群落的结构组成 |
| 2.3.7 不同土层的细菌丰度 |
| 2.3.8 产漆酶细菌的筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 秸秆还田土壤细菌漆酶多样性分析 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 土壤总DNA的提取和检测 |
| 3.2.2 宏基因组测序及生物信息学分析 |
| 3.2.3 细菌漆酶的系统发育分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 秸秆还田土壤宏基因组测序概况 |
| 3.3.2 秸秆还田土壤微生物的结构组成 |
| 3.3.3 秸秆还田土壤微生物的功能分析 |
| 3.3.4 秸秆还田土壤细菌漆酶的多样性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 秸秆还田土壤细菌漆酶基因的克隆、表达及性质测定 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 样品采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 培养基和溶液 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 土壤总DNA的提取和检测 |
| 4.2.2 细菌漆酶基因的克隆 |
| 4.2.3 TAIL-PCR克隆细菌漆酶基因 |
| 4.2.4 细菌漆酶序列分析 |
| 4.2.5 细菌漆酶LacS1的表达和纯化 |
| 4.2.6 重组细菌漆酶LacS1的酶学性质测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 细菌漆酶基因克隆 |
| 4.3.2 细菌漆酶LacS1的表达和纯化 |
| 4.3.3 重组细菌漆酶LacS1的酶学性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）2’-氟-2-’脱氧腺苷的核苷磷酸化酶催化合成技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 核苷类似物的概述 |
| 1.2 核苷类似物的生物合成技术 |
| 1.3 核苷磷酸化酶的研究进展 |
| 1.3.1 核苷磷酸化酶的分类 |
| 1.3.2 重组核苷磷酸化酶 |
| 1.3.3 嗜热菌的核苷磷酸化酶 |
| 1.4 蛋白质工程 |
| 1.4.1 定向进化 |
| 1.4.2 半理性设计 |
| 1.5 课题研究意义和研究方案 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 课题研究思路及内容 |
| 第二章 嘌呤核苷磷酸化酶PNP的分子改造 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要的实验制剂及其配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 原始工程菌的活化与种子液的制备保存 |
| 2.4.2 原始工程菌的质粒提取 |
| 2.4.3 定点饱和突变 |
| 2.4.4 PCR扩增 |
| 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 2.4.6 PCR产物的消化,纯化与转化 |
| 2.4.7 胸腺嘧啶赛酸化癣TPI酶液的制备 |
| 2.4.8 突变酶的制备 |
| 2.4.9 酶液的蛋白浓度测定 |
| 2.4.10 高效液相色谱检测方法 |
| 2.4.11 突变酶的酶活测定方法 |
| 2.4.12 突变酶的筛选方法 |
| 2.5 实验结果与分析 |
| 2.5.1 原始工程菌的质粒提取的结果 |
| 2.5.2 定点饱和突变PCR的结果 |
| 2.5.3 蛋白浓度测定的标准曲线 |
| 2.5.4 高效液相色谱法测定的标准曲线 |
| 2.5.5 突变酶的筛选 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 PNP突变株的诱导表达条件优化及高密度发酵 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 突变株MF13种子液的制备与保存 |
| 3.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳实验 |
| 3.3.3 诱导时机对诱导表达的影响 |
| 3.3.4 IPTG终浓度对诱导表达的影响 |
| 3.3.5 诱导温度对诱导表达的影响 |
| 3.3.6 诱导时长对诱导表达的影响 |
| 3.3.7 MF13酶液的制备 |
| 3.3.8 突变株MF13的高密度发酵 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 诱导时机对突变株MF13诱导表达的影响 |
| 3.4.2 IPTG终浓度对突变株MF13诱导表达的影响 |
| 3.4.3 诱导温度对突变株MF13诱导表达的影响 |
| 3.4.4 诱导时长对突变株MF13诱导表达的影响 |
| 3.4.5 突变株MF13的高密度发酵 |
| 3.4.6 高密度发酵MF13的酶活 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应工艺的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器和试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TP与MF13的酶液制备 |
| 4.3.2 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应的温度优化 |
| 4.3.3 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应的pH优化 |
| 4.3.4 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应的酶底比优化 |
| 4.3.5 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成的放大反应 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应温度优化 |
| 4.4.2 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应的pH优化 |
| 4.4.3 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成反应的酶底比优化 |
| 4.4.4 2'-氟-2'-脱氧腺苷合成的放大反应 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 个人简历 |
（7）HMGB1诱导EPCs迁移在创面新生血管形成中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.4 研究内容及方法 |
| 第二章 小鼠皮肤创面组织HMGB1 的表达变化及其对创面愈合的影响 |
| 2.1 小鼠创面组织中HMGB1 蛋白的表达变化 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.2 外源性HMGB1 对糖尿病小鼠创面愈合的影响 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 HMGB1 对糖尿病小鼠外周血中CD34+细胞数量的影响 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HMGB1 对体外培养的EPCS生物学特性的影响及趋化作用 |
| 3.1 小鼠骨髓EPCs的分离培养与鉴定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 HMGB1对EPCs表面RAGE蛋白表达的影响 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 HMGB1对EPCs增殖、旁分泌作用及血管生成能力的影响 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 HMGB1对EPCs运动和迁移活动的影响 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 HMGB1 诱导EPCS迁移的分子机制研究 |
| 4.1 HMGB1 参与EPCs中 PI3K和 Akt磷酸化过程 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 HMGB1-RAGE激活PI3K/Akt信号通路对EPCs运动迁移过程的影响 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 HMGB1-RAGE对 Akt、ERK、eNOS蛋白表达及磷酸化的影响 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 HMGB1-RAGE对 EPC细胞ERK、JNK、P38 的磷酸化的影响 |
| 4.4.1 实验材料及设备 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 HMGB1-RAGE通过PI3K/Akt信号通路影响EPCs内 F-actin表达变化 |
| 4.5.1 实验材料及设备 |
| 4.5.2 实验方法 |
| 4.5.3 实验结果 |
| 4.6 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HMGB1在创面愈合中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）蛋白酶脱胶对丝素材料结构和性能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 蚕丝丝素 |
| 1.2 丝胶蛋白 |
| 1.3 蚕丝的脱胶 |
| 1.3.1 碱性试剂脱胶 |
| 1.3.2 酸性试剂脱胶 |
| 1.3.3 高温高压脱胶 |
| 1.3.4 表面活性剂脱胶 |
| 1.3.5 蛋白酶脱胶 |
| 1.3.6 蚕丝蛋白酶脱胶的研究现状 |
| 1.4 本课题的研究目的和主要内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 中性蛋白酶的选择 |
| 1.4.3 本文的研究内容 |
| 第二章 蛋白酶的浓度对脱胶后丝素纤维的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 经不同蛋白酶处理后蚕丝的脱胶率 |
| 2.2.2 脱胶后蚕丝的表面形貌 |
| 2.2.3 脱胶后蚕丝的红外吸收光谱 |
| 2.2.4 氨基酸分析 |
| 2.2.5 脱胶后蚕丝的拉伸断裂性能 |
| 2.2.6 脱胶后蚕丝的TG/DTG曲线 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 蛋白酶脱胶对丝素蛋白分子量的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂与缓冲液的制备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3.2.2 丝素蛋白溶液的流变性能 |
| 3.2.3 乌氏粘度 |
| 3.2.4 凝胶层析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 高分子量丝素蛋白组份多孔材料的性能 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.2.2 氨基酸分析 |
| 4.2.3 红外光谱 |
| 4.2.4 SEM观察多孔材料的形貌 |
| 4.2.5 多孔材料的孔隙率 |
| 4.2.6 多孔材料的压缩性能 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结语 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 本文的主要研究成果 |
| 5.3 后续研究计划 |
| 5.4 本文的不足之处 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间本人公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑卒中现状概述 |
| 1.2 脑卒中病理机制及研究现状 |
| 1.3 脑卒中的药物治疗现状 |
| 1.3.1 溶栓治疗 |
| 1.3.2 降纤药物与抗凝药物 |
| 1.3.3 抗血小板聚集药物 |
| 1.3.4 神经保护治疗 |
| 1.4 STV及其衍生物研究背景 |
| 1.5 蛋白质组学分析方法概述 |
| 1.5.1 基于蛋白质二维凝胶电泳分离-质谱分析的top-down策略 |
| 1.5.2 基于肽段液相色谱分离-质谱分析的bottom-up策略 |
| 1.6 低密度脂蛋白的概述 |
| 1.7 本实验研究背景、意义和内容 |
| 1.7.1 研究背景 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 1.7.3 研究内容 |
| 第二章 大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型（MCAO/R）构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 脑卒中模型的选择及评价 |
| 2.1.2 大鼠大脑中动脉线栓法构建模型的优势 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料及相关溶液 |
| 2.2.3 线栓模型制作准备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠大脑中动脉局灶性缺血/再灌注模型的制备 |
| 2.3.2 试验分组和剂量、给药 |
| 2.3.3 模型成功性验证 |
| 2.3.4 生理参数检测 |
| 2.3.5 神经行为学恢复的评估 |
| 2.3.6 脑组织的切取 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 血流值测定结果 |
| 2.4.2 生理参数测定结果 |
| 2.4.3 脑梗死面积计算结果 |
| 2.4.4 动物行为学评分结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 不同十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶系统（SDS-PAGE）对脑组织蛋白的分离 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大鼠脑蛋白质的提取及浓度测定 |
| 3.3.2 不同SDS-PAGE凝胶系统的制备 |
| 3.3.3 梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶（4.2%-17.85% T（线性梯度），5% C（交联度））电泳 |
| 3.3.4 不同浓度（10% T，2.6% C或 12% T，2.6% C或 15% T，2.6% C）均一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同系统胶对蛋白分离的影响 |
| 3.4.2 脑组织蛋白的特点 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 不同时间点MCAO/R模型级联反应过程相关蛋白表达及量的变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 相关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 水溶性蛋白质的提取及浓度测定 |
| 4.3.2 大鼠脑组织蛋白质的一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.3 大鼠脑组织蛋白质的免疫印迹法 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 脑缺血过程中氧化应激相关蛋白的分析 |
| 4.4.2 相关蛋白不同时间点表达量的变化的所涉及的级联反应 |
| 4.4.3 STV与依达拉奉的比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 使用数字化非变性蛋白图谱方法分析低密度脂蛋白（LDL）及其相关蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血浆样品的准备 |
| 5.3.2 人血浆蛋白的非变性二维凝胶电泳 |
| 5.3.3 凝胶网格切取 |
| 5.3.4 胶内酶解 |
| 5.3.5 纳升级超高效液相色谱分离 |
| 5.3.6 质谱对肽段样品的定性定量分析 |
| 5.3.7 数据处理及蛋白质的鉴定和定量分析 |
| 5.3.8 重构非变性蛋白图谱 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 MS~E模式与HDMS~E模式的比较 |
| 5.4.2 Apo B-100 的分布及网格切取区域其他主要的血浆蛋白 |
| 5.4.3 运用数字化蛋白质谱图进行低密度脂蛋白相关蛋白搜索 |
| 5.4.4 已报道的LDL相关蛋白结果的比较 |
| 5.4.5 数字化天然蛋白图谱在分析LDL结合蛋白的特征 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）内生菌SYfx213.2发酵产薯蓣皂苷酶条件优化及酶的初步分离纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 盾叶薯蓣皂苷元概况 |
| 1.1.1 盾叶薯蓣概述 |
| 1.1.2 薯蓣皂苷元 |
| 1.1.3 薯蓣皂苷元的功能与应用 |
| 1.1.4 薯预皂苷元的工业生产现状 |
| 1.2 薯蓣皂苷酶研究进展 |
| 1.2.1 产薯蓣皂苷酶微生物的研究进展 |
| 1.2.2 薯蓣皂苷酶的研究进展 |
| 1.3 发酵过程优化 |
| 1.4 统计学方法优化 |
| 1.4.1 Plackett-Burman实验设计法（P-B） |
| 1.4.2 最陡爬坡法（Steepest Ascent） |
| 1.4.3 响应面法（RSM） |
| 1.5 立题依据 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 分子生物学鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 分子生物学鉴定及系统发育树构建 |
| 2.3 分子生物学鉴定结果 |
| 2.3.1 PCR扩增目的基因的结果 |
| 2.3.2 构建系统发育树 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 内生真菌SY_(fx2)13.2 产酶条件优化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌体活化与发酵培养 |
| 3.2.2 接种方式的优化 |
| 3.2.3 前体诱导物的优化 |
| 3.2.4 皂苷酶酶活力测定 |
| 3.2.5 单因素优化 |
| 3.2.6 多因素优化 |
| 3.2.7 验证实验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 接种方式优化结果 |
| 3.3.2 前体诱导物优化结果 |
| 3.3.3 单因素试验结果 |
| 3.3.4 多因素优化试验结果 |
| 3.3.5 验证试验结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.4.1 诱导物优化 |
| 3.4.2 菌体胞内酶活力 |
| 3.4.3 单因素优化 |
| 3.4.4 多因素优化 |
| 3.4.5 薯蓣皂苷元 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 皂苷酶初步分离纯化 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 溶液配制 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 薯蓣皂苷酶粗酶提取 |
| 4.2.2 蛋白质浓度测定 |
| 4.2.3 皂苷酶酶反应 |
| 4.2.4 薄层层析检测皂苷酶反应产物 |
| 4.2.5 丙酮沉淀优化 |
| 4.2.6 薯蓣皂苷酶分离纯化 |
| 4.2.7 薯蓣皂苷酶的分子量测定 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 薯蓣皂苷酶反应结果 |
| 4.3.2 皂苷酶粗酶液浓缩 |
| 4.3.3 皂苷酶电泳分离纯化结果 |
| 4.3.4 薯蓣皂苷酶分子量测定结果 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 4.4.1 皂苷酶粗酶酶活 |
| 4.4.2 皂苷酶酶反应机制推测 |
| 4.4.3 皂苷酶的分离纯化 |
| 4.4.4 皂苷酶酶学特性 |
| 4.4.5 酶反应产物生成率 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究（论文参考文献）
- [1]石蜡包埋组织中组蛋白的提取分离和翻译后修饰的定量分析[J]. 田姗姗,刘冉冉,钱晓龙,郭晓静,张锴. 色谱, 2021(10)
- [2]裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究[D]. 冯学珍. 广西大学, 2021
- [3]捻转血矛线虫Hc-CAP-15、Hc-CAP-17编码基因的克隆和功能研究[D]. 刘慧. 华中农业大学, 2021
- [4]O1群El Tor型霍乱弧菌Ⅱ型分泌系统介导分型噬菌体VP2感染的研究[D]. 孙惠惠. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [5]秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶的多样性研究[D]. 于大力. 中国农业科学院, 2020(01)
- [6]2’-氟-2-’脱氧腺苷的核苷磷酸化酶催化合成技术研究[D]. 滕海东. 浙江大学, 2020(03)
- [7]HMGB1诱导EPCs迁移在创面新生血管形成中的作用及分子机制研究[D]. 张玉龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]蛋白酶脱胶对丝素材料结构和性能的影响[D]. 黄倩. 苏州大学, 2019(05)
- [9]大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究[D]. 陈谨. 华南理工大学, 2016(02)
- [10]内生菌SYfx213.2发酵产薯蓣皂苷酶条件优化及酶的初步分离纯化[D]. 谢玲姬. 西北农林科技大学, 2016(09)
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