一、谷氨酰胺发酵条件研究（论文文献综述）
杜建辉[1]（2021）在《谷氨酰胺转氨酶高效表达及热稳定性改造》文中指出谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase）是一种酰基转移酶,可催化蛋白质分子内或分子间的酰基转移反应,从而使蛋白分子交联。目前,TGase主要应用于食品加工,且在生物医药、纺织材料和皮革加工等领域均展现出较大的应用潜力。茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）是商品化TGase最主要的来源。随着应用市场的拓展,进一步提高TGase的稳定性并实现其高效重组表达一直是国内外研究的热点。本研究将来源于S.mobaraensis DSM40847 的 TGase 酶原（pro-TGase）表达于大肠杆菌 Escherichia coli BL21（DE3）中,通过酶原区替换、定点突变、密码子优化、融合表达标签及共表达噬菌体裂解蛋白,实现了 pro-TGase的胞外高效表达。在此基础上,通过构建分子内二硫键提高了 TGase的热稳定性。主要研究结果如下:（1）发酵条件优化及基因工程手段提高pro-TGase在E.coli中胞内表达量将S.mobaraensis中的pro-TGase基因克隆至表达载体pET-22b得到重组质粒pET-22b-proM-TGase,转化E.coli BL21（DE3）。重组pro-TGase在体外经中性蛋白酶dispase活化,转化为活性TGase。重组菌最优表达条件为:TB培养基,培养基中添加0.5%乙醇,诱导起始菌体浓度OD600=1.00,添加终浓度为0.10 mMIPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导,诱导温度为20℃。该条件下,重组菌发酵36 h,胞内及胞外总酶活达到2.75 U mL-1。为进一步提高TGase的表达量,分别将S.mobaraensis pro-TGase酶原区分别替换为proC（Streptomyces caniferus,Genebank:AM746294.1）、proF（Streptomyces fradiae,Genebank:AM746294.1）、proH（Streptomyces hygroscopicus,Genebank:EU477523.1）、proN（Streptomyces netropsis,Genebank:EF195356.1）及proP（Streptomyces platensis,Genebank:AM746296.1）等五种酶原。其中融合proC和proH酶原区的TGase的表达量分别较S.mobaraensis pro-TGase 提高 1.43 和 1.13 倍。通过高表达及高稳定性位点突变、密码子优化和促溶蛋白标签TrxA、MBP和GST整合等优化措施,最终得到的重组质粒pET-22b-TrxA-proC-MS-OP的pro-TGase 表达量为 25.00 U mL-1,产量为 0.50 mg mL-1。（2）构建自裂解系统促进pro-TGase高效胞外表达在可高效表达pro-TGase质粒的基础上,导入可表达噬菌体裂解蛋白SRRz质粒pRSFDuet-1-SRRz,与pro-TGase共表达。由温敏启动子PL/PR诱导表达λ噬菌体裂解蛋白SRRz,在发酵中后期通过升温至42℃诱导裂解蛋白的表达并裂解细胞,使胞内富集的pro-TGase释放至胞外,在胞外测TGase酶活为21.30 U mL-1。（3）构建二硫键筛选高稳定性突变体TGase在热稳定性较高的TGase突变体MS（S2P-S23V-Y24N-S199A-K294L）基础上进行热稳定性改造。通过软件Disulfide by Design 2.0理性设计及结构分析,模拟软件评估可以形成二硫键的突变位点,分析评估结果,通过一步克隆及磷酸化获得各突变体阳性克隆子,发酵36 h后活化纯化TGase,测定各突变体60℃热处理20 min之后的残余酶活,获得三种热稳定性明显提高的突变体:D118C-K121C、P244C-E249C和P22C-Q328C,残余酶活较突变体MS分别提升了 77.39%、71.58%和91.06%。与MS相比,MS-P22C-Q328C的t1/2（60℃）和tm分别提升了 2.06倍和1.06℃,但比酶活下降13.20%。
于凡[2]（2020）在《谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件优化》文中认为谷氨酰胺转氨酶（TGase）被广泛应用于蛋白质的修饰,可以改变蛋白质网络结构、增强保水能力和促进凝胶形成,甚至提高蛋白质营养价值,在食品、医药、纺织等领域具有重要的应用价值。目前,TGase的主要来源是微生物,因为微生物生长快,产量大,效率高。天然发酵菌种可以直接获得活性TGase,但发酵周期长、工艺复杂且成本高。而异源重组表达工艺简单、成本低、周期短。巴斯德毕赤酵母研究背景清楚,是一种理想的异源蛋白表达系统,因此,选择毕赤酵母异源表达谷氨酰胺转氨酶是一个可行的策略。本研究将前期筛选得到的吸水链霉菌107.3的谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达、超滤纯化和酶学性质表征探究,通过响应面法优化重组菌株发酵条件,并在10 L发酵罐小试表达重组酶,评价重组菌株的发酵性能。主要研究结果如下:（1）成功构建了谷氨酰胺转氨酶的分泌载体并在毕赤酵母GS115中实现表达。构建含有吸水链霉菌前肽pro、kex2酶切位点、成熟酶mTGase三部分融合基因的分泌载体pPIC9K-pro-kex-TGase并通过电转整合到毕赤酵母GS115的基因组中,获得阳性克隆转化子GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase（hs-D6）,经表达可直接获得活性重组谷氨酰胺转氨酶,在dispaseⅡ处理后重组酶酶活力达到0.3 14 U/mL。SDS-PAGE分析发现,重组毕赤酵母hs-D6菌株可表达出45 kDa左右大小的蛋白条带,与酶原理论分子大小一致,不存在糖基化。但未见成熟酶mTGase蛋白条带,可能原因是GS115菌株自身的kex2蛋白酶识别kex2位点,酶切了一小部分表达的TGase酶原。因此,本研究构建的重组吸水链霉菌TGase的毕赤酵母表达系统,既可以产生大量酶原蛋白,又可以直接产生具有酶活性的mTGase,这在一定程度上实现了我们的设计目标即直接获得活性TGase,为谷氨酰胺转氨酶的生产和分子改造提供了新思路。（2）超滤纯化重组谷氨酰胺转氨酶并对其酶学性质进行表征。利用超滤的方法可以实现重组酶的简单纯化,10 kDa规格的超滤管可以完全截留重组酶蛋白;使用纯化后的重组谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质的测定,其最适温度为40℃,最适pH为7,在最适条件下测定重组酶最大速度（Vmax）和动力学常数（Km）分别为16.58μmol/（L·min）、3.79μmol/L;Na+、K+对酶活有一定的促进作用,Ca2+几乎没有影响,Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+均对重组 TGase 表现出抑制作用,且 Fe2+、Zn2+、Cu2+离子对酶活的抑制作用随着浓度的增加而增强;体积分数10%的甲醇、乙醇对重组TGase有一定积极的促进作用,甘油对酶活性影响较小,丙酮、异丙醇均对酶活性有抑制作用,尤其是丙酮有明显的抑制作用;表面活性剂中SDS对重组TGase具有明显的抑制作用,PEG800、PEG8000、Tween20均对重组TGase酶活性具有一定的促进作用。不同来源的谷氨酰胺转氨酶在酶特性上也存在着差异,研究其酶学性质对酶的实际生产应用具有重要意义。（3）响应面法优化谷氨酰胺转氨酶的发酵条件,在10L发酵罐中进行发酵小试。采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面法（RSM）在摇瓶水平研究了接种量、诱导温度、时间、初始pH值和甲醇浓度的5个发酵条件,得到了重组毕赤酵母hs-D6菌株在摇瓶中的最佳产酶条件为:接种量OD600为6、pH为7、甲醇浓度2.0%、诱导温度23℃、诱导时间72h。优化发酵条件后,重组菌株在摇瓶中产TGase酶活力可达1.1 U/mL,是初始酶活的3.6倍。采用响应面摇瓶优化的发酵条件结果,在10 L发酵罐中进行扩大培养发酵表达重组酶,结果表明在优化条件下重组菌株产谷氨酰胺转氨酶的酶活力进一步提高,不仅可以积累重组菌株较大的生物量,还具有比较好的产酶效果;在高生物量、诱导pH5.0的条件下重组酶活力最高达到2.54 U/mL,积累生物量达到30g/L,是初始酶活的8.5倍。说明重组毕赤酵母hs-D6在摇瓶和发酵罐的优化条件下具有较好的发酵性能。
胡竞进[3]（2020）在《基于比较转录组学和ChIP-Seq研究转录因子Dal80p在酿酒酵母氮代谢中的调控功能》文中进行了进一步梳理氨基甲酸乙酯是发酵食品特别是发酵饮品中分布最广的2A级致癌物质之一,已有研究表明其形成的主要原因是酿酒酵母氮代谢阻遏效应引起的氮源选择性和不充分利用。因此,深入理解酿酒酵母细胞的氮代谢调控机制,对发酵菌株进行代谢工程靶向改造是解决发酵饮品中氨基甲酸乙酯形成最有效的途径。课题组前期研究表明,Dal80是酿酒酵母细胞氮代谢阻遏效应负向转录调控因子之一,但其在氮代谢过程中功能作用还不甚了解。因此,本学位论文利用酿酒酵母BY4741、Dal80敲除菌、Dal80过表达菌作为研究对象,采用比较转录组学和分子互作研究手段Chip-seq及常规生理生化评价手段针对Dal80p在酿酒酵母氮代谢调控中的具体功能进行系统研究。本论文具体研究结论如下:1.本文对氮代谢转录因子Dal80p在酿酒酵母菌株的细胞生长及氮源选择性利用过程中的作用进行研究。研究结果表明,Dal80p对酿酒酵母菌株生长没有显着影响,但dal80过表达会显着抑制总氨基酸及丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、组氨酸、半胱氨酸等氨基酸的利用,从而增加贫乏型氮源条件下因精氨酸代谢产生的尿素积累。2.围绕上述研究结果开展了偏好性氮源对精氨酸和尿素利用的影响研究。研究结果发现,偏好性氮源对精氨酸利用的抑制较尿素更为明显,dal80缺失有利于酿酒酵母菌株在偏好性氮源下对精氨酸的利用并减少精氨酸降解过程中胞内尿素的积累,但过表达则会增加胞内及发酵液中尿素的积累。综合分析已有研究数据,我们发现谷氨酰胺影响酵母细胞对精氨酸利用抑制作用最为突出的偏好性氮源,其浓度升高会降低精氨酸和尿素酶的活性,dal80缺失有助于缓解酶活性的降低。3.基于上述研究结果和发现,本文继续采用比较转录组学研究Dal80p在低浓度谷氨酰胺背景下对精氨酸利用的抑制作用。研究结果发现,Dal80的缺失会上调氨基酸代谢的细胞周期、糖酵解、MAPK信号通路等代谢路径相关基因的表达,而过表达则相反。其中,氨基酸代谢相关基因主要为氨基酸转运和降解相关的酶类。光定量实验结果表明,dal80的缺失会显着引起谷氨酸合成酶基因gdh1和精氨酸酶基因car1的下调,同时上调谷氨酸降解酶gdh2、谷氨酸合成酶gdh3、脲酶dur1,2和精氨酸转运酶alp1基因的上调表达,对精氨酸转运酶基因gap1的表达影响不显着。4.本文借助比较转录组学手段研究了Dal80p在高浓度谷氨酰胺营养环境下对精氨酸利用的抑制作用。研究结果表明,谷氨酰胺浓度升高会抑制酿酒酵母细胞中大量氨基酸转运及其代谢相关酶类基因的表达,这种抑制作用会随着dal80的缺失而解除甚至出现逆转。此外,dal80过表达还会显着抑制核糖体代谢相关基因的表达。荧光定量PCR验证结果表明,dal80缺失能够上调精氨酸酶car2、脲酶dur1,2、精氨酸转运蛋白gap1、alp1和氨基酸渗透酶agp1、agp2以及精氨酸合成相关基因arg1和arg4的表达,抑制精氨酸酶car1的表达,同时上调谷氨酰胺合成酶gln1和谷氨酸脱氢酶gdh1、gdh3表达抑制谷氨酸脱氢酶gdh2的表达,这可能表明dal80的缺失有助于通过增强精氨酸的转运和分解产物的降解来缓解谷氨酰胺对其利用的抑制。5.本文借助分子互作研究手段解析转录因子Dal80p对酿酒酵母细胞氮代谢的可能作用靶标。ChIP-Seq互作研究结果发现,转录因子Da80p可能作用于细胞周期、细胞分裂、氨基酸合成、MAPK信号通路、核糖体等代谢通路,同时氨基酸合成代谢通路的基因主要为氨基酸转运和降解相关的酶类,特别是与精氨酸和谷氨酰胺相关。此外,本文研究还发现Dal80p可能与其它蛋白互作共同完成氮代谢的转录调控,除在转录起始位点结合外可能还在转录终止位点结合。对Peak富集到的精氨酸代谢相关基因与第5章中dal80缺失引起的上调表达的氨基酸代谢相关基因对比发现两者高度一致,主要为精氨酸转运、合成以及代谢产物分解相关的酶,这表明dal80可能通过抑制精氨酸的转运、合成、产物分解来阻遏谷氨酰胺条件下精氨酸的利用。此外,荧光定量PCR结果发现,dal80缺失会上调dur3和gln3基因的表达,但对液泡膜蛋白atg22以及tor1、can1、dal81及其它GATA家族转录因子表达没有影响。这表明,dal80缺失可能会促进环境中尿素向胞内的转运但不会影响胞质和液泡间氨基酸的平衡。
高慧[4]（2020）在《谷氨酰胺转氨酶的发酵优化及活化研究》文中认为谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase）是一种酰基转移酶,能催化蛋白质分子间的交联反应,在食品、制药和纺织等领域具有广泛的应用前景。研究室前期工作中构建了表达茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）TGase酶原（pro-TGase）的重组菌——解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1h/hpro-TGase。为提高活性TGase生产效率,本文以Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase为对象,优化了pro-TGase在5 L罐上的发酵条件,构建了TGase活化蛋白酶（TAMEP）生产菌并对TAMEP进行固定化,实现了TGase的高效发酵和活化。主要研究结果如下:（1）Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase的发酵优化在5L罐中,依次考察了搅拌转速、pH控制和甘油补料对Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase发酵的影响,采用dispase活化后测定pro-TGase对应TGase活力。搅拌转速优化显示,低转速（600 rpm和700 rpm）较高转速（800 rpm和900 rpm）在80 h小时后获得的pro-TGase表达量更高;发酵120 h,600 rpm获得pro-TGase产量达到6.8 U·mL-1,较900 rpm提高45%。重组菌在甘油耗尽后pH升高,pro-TGase开始表达。故考察pH回升阶段控制pH为5～8,对pro-TGase发酵的影响。结果表明,控制pH 7时pro-TGase产量达到17.4 U·mL-1,较不控制pH提高156%。为提高菌体浓度,待培养基中甘油耗尽后,进行10～40 g·L-1的甘油补料。结果显示,10、20、30、40 g·L-1甘油补料较分批发酵的细胞浓度分别提高35%、83%、107%、142%,但pro-TGase产量分别下降17%、34%、25%、32%。最终确定5 L罐分批发酵发酵条件为:搅拌转速为600 rpm、pH回升阶段控制pH 7,发酵120 h。（2）TAMEP在E.coli BL21（DE3）中的表达及酶学性质分析为制备pro-TGase活化蛋白酶,将S.mobaraensis来源的TAMEP分泌表达于E.coli BL21（DE3）。信号肽优化显示,TAMEP天然信号肽介导的胞外TAMEP较pelB信号肽提高92.6%。对TAMEP天然信号肽的N端前10个氨基酸进行随机同义突变,筛选到一株TAMEP表达量高30%的突变株。通过单因素优化,最终确定该菌株高效分泌表达TAMEP的条件为:诱导温度20℃、IPTG浓度为10μM、诱导起始OD600=1.5及添加1.0%葡萄糖。在此条件下,胞外TAMEP酶活力达到186.3 U·mL-1,较优化前提高5.9倍。胞外TAMEP经镍柱亲和纯化,比酶活力达到437 U·mg-1。酶学性质分析显示,TAMEP最适反应温度和最适反应pH分别为55℃和7.0;TAMEP在30-50℃孵育1 h酶活残余50%,而在60℃下孵育1 h酶活完全丧失;TAMEP在碱性环境中较在酸性环境中更稳定。上述性质与天然S.mobaraensis TAMEP性质接近。活化反应分析表明,0.133μM TAMEP能使6.91μM pro-TGase在10 min内基本转化为活性TGase,且不会持续降解活化后的TGase。（3）TAMEP固定化及其催化pro-TGase活化的条件优化以戊二醛为交联剂将TAMEP固定化至壳聚糖小球。考查了戊二醛浓度（1-4%）、壳聚糖活化时间（10-240 min）、TAMEP浓度（1.77～14.17μM）及其交联时间（8～48 h）对固定化的影响。确定TAMEP固定化条件为:1%（v/v）戊二醛,壳聚糖活化3 h,10.63μM TAMEP,TAMEP交联8 h。在该条件下,TAMEP固定化率、酶活收率及与固定化酶比活力分别达到76.0%、36%、42.6 U·g-1。与游离的TAMEP相比,固定化TAMEP在50和60℃下孵育1 h后的残余酶活分别提高26%和19.3%;在pH为5和10的环境下孵育1 h,残余酶活分别提高39.7%和14.7%。上述结果表明,固定化TAMEP较游离的TAMEP具有更高的热稳定性和pH稳定性。此外,固定化使TAMEP的最适反应pH由7变为9。TGase酶原活化分析显示,10颗固定化TAMEP小球在37℃下反应10 min能完全活化1.40 U TGase,且重复反应10次后仍能保持75%的酶活。
邵文铉[5]（2020）在《谷氨酰胺转氨酶在酶改性中的应用》文中进行了进一步梳理在近些年的研究中,对多酶固定的方法有共固定法、共包埋法、共交联法,但是这些方法存在着一些问题,例如戊二醛交联会使得酶活损失较大,京尼平交联会使得产物呈现蓝色,而且价格昂贵。层层自组装、静电纺丝等方法,也不能做到酶分子比例的精确控制与底物传递两者兼顾。对酶分子进行特异性识别并交联,可以实现酶分子的可控有序排列,缩短酶分子之间的距离,完成多酶的级联催化或者多酶的协同作用。因此,将不同的酶分子按照需求进行特异性交联,是目前研究的方向之一。谷氨酰胺转氨酶（TGase）它可以催化蛋白质或多肽的谷氨酰胺（Gln）的酰胺基团和赖氨酸（Lys）的伯氨基团发生酰基转移反应,生成异肽键,从而使蛋白质分子之间或之内发生共价交联。但是天然的球形蛋白、柱形蛋白无法作为谷氨酰胺转氨酶的底物,现有的方法是蛋白质的N端连接肽链标签,使得蛋白质能够被谷氨酰胺转氨酶识别和交联。本文通过在蛋白质的基因片段中插入肽链标签序列,获得在N端带有肽链标签的蛋白质。利用谷氨酰胺转氨酶催化肽链标签的交联从而实现蛋白质的特异性交联。通过改变肽链标签可以得到不同的交联结果。本文的研究中先在增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中验证肽链标签的可行性。通过表达带有S肽、F肽或M肽的EGFP,以及对其进行荧光测定,验证肽链标签不会对蛋白质自身造成影响,同时采用肽链标签能够实现谷氨酰胺转氨酶特异性交联蛋白质的目的。而后将肽链标签应用于碳酸酐酶和甲酸脱氢酶的交联。将双酶交联后能提高二氧化碳向甲酸的转化效率,同时缩短中间产物碳酸氢根离子的传递距离。F肽、K2肽、K3肽分别与M肽交联,可以实现双酶的“一对一”、“一对二”、“一对三”交联。根据酶活保留率、热稳定性、催化效率等实验结果显示,“一对二”交联方式效果最佳,交联后双酶酶活基本无损失。交联后甲酸脱氢酶的热稳定性得到提高,可在35℃下稳定存在。同时在该温度下,交联双酶的甲酸产量最高,同时催化效率也最高,是游离酶的5.8 倍。最后一部分研究内容是制备一种内部带有有与谷氨酰胺有相似的结构水溶性高分子聚合物,谷氨酰胺转氨酶可催化该聚合物与酶交联,形成“聚合物-蛋白质”形式的缀合物。将双酶固定在聚合物上,可以提升酶的热稳定性至45℃。同时,在45℃下,固定化双酶的催化效率是游离酶的4.4倍,同时也能大大双酶提高使用寿命。另外,在凝血酶的介入下,可以将蛋白质从缀合物上分离下来,实现蛋白质的分离。
何明[6]（2020）在《大口黑鲈饲料中发酵豆粕替代鱼粉的效果及谷氨酰胺、丁酸梭菌提升其效价的营养策略研究》文中研究指明本研究旨在探究发酵豆粕在大口黑鲈饲料中的应用效果及其营养提升策略。首先考察了发酵豆粕替代饲料中不同比例的鱼粉对大口黑鲈生长性能、营养物质利用、血清生化指标以及肠道健康的影响,再采用套算法对豆粕和发酵豆粕在大口黑鲈饲料中的营养价值进行评定,最后,在低鱼粉-高发酵豆粕饲料中添加丙氨酰谷氨酰胺和丁酸梭菌,考察其对大口黑鲈生长性能的提升以及营养物质利用和肠道健康的改善效果。本研究所得结果可为发酵豆粕在肉食性鱼类饲料中的合理应用提供理论依据。试验一:发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈生长、营养物质利用和血清生化指标的影响为研究发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈生长性能、体组成、营养物质利用率和血清生化指标的影响。设置一个鱼粉含量为35%的基础饲料,分别用豆粕、发酵豆粕等蛋白替代大口黑鲈饲料中0%、15%、30%、45%和60%的鱼粉（CON、SBM-15、SBM-30、SBM-45、SBM-60、FSBM-15、FSBM-30、FSBM-45和FSBM-60）。共9组饲料,饲喂大口黑鲈（4.5±0.1g）8周。结果表明:相比于CON组,SBM-45、SBM-60和FSBM-60组的增重率显着下降,SBM-30、SBM-45、SBM-60、FSBM-45和FSBM-60组的饲料系数显着上升（P<0.05）。当豆粕和发酵豆粕替代鱼粉的比例分别到达30%和45%,大口黑鲈肌肉水分含量显着低于对照组,粗蛋白显着高于对照组（P<0.05）,不同比例豆粕和发酵豆粕替代鱼粉对全鱼的常规成分没有显着性影响（P>0.05）。豆粕和发酵豆粕替代45%和60%的鱼粉显着提高了大口黑鲈肌肉中的天冬氨酸含量,降低了谷氨酸的含量（P<0.05）。在营养物质利用方面,SBM-45、SBM-60和FSBM-60组的干物质表观消化率和蛋白质表观消化率显着低于对照组（P<0.05）,SBM-30、SBM-45、SBM-60、FSBM-45和FSBM-60组的饲料蛋白质效率较对照组显着下降（P<0.05）。SBM-60和FSBM-60组的血清总蛋白含量以及SBM-45、SBM-60和FSBM-60组的胆固醇含量显着低于对照组,SBM-30和SBM-60组的血清谷丙转氨酶活力显着高于对照组。综上,在鱼粉含量为35%的大口黑鲈饲料中,发酵豆粕可以替代30%的鱼粉而不会对生长性能、营养物质利用和血清生化指标产生显着影响,而豆粕的替代比例为15%。试验二:发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构和微生物的影响在试验一的基础上,采用组织切片技术、传统培养法和Illumina-Mi Seq高通量测序技术研究了不同比例豆粕和发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构和微生物的影响。结果表明,SBM-60组的绒毛长度显着低于对照组,SBM-45、SBM-60、FSBM-60组的绒毛宽度显着低于对照组（P<0.05）。基于传统培养方法的肠道微生物研究结果表明,SBM-30组的总菌含量显着低于对照组（P<0.05）、豆粕和发酵豆粕替代60%的鱼粉显着降低了肠道中大肠杆菌（Escherichia coli）的含量（P<0.05）;相比于SBM-60组,FSBM-60组的总菌含量和乳酸菌（lactic acid bacteria）含量显着增加（P<0.05）。Illumina-Mi Seq高通量测序技术分析结果各组肠道微生物多样性相比于对照组无显着性差别（P>0.05）。在属水平上,大口黑鲈的肠道微生物主要包括支原体属（Mycoplasma）、鲸杆菌属（Cetobacterium）、邻单胞菌属（Plesiomonas）和弧菌属（Vibrio）。豆粕替代30%的鱼粉显着提升了大口黑鲈肠道微生物中鲸杆菌属细菌的相对丰度（P<0.05）,而发酵豆粕替代30%的鱼粉显着增加支原体属细菌的相对丰度（P<0.05）。综上所述,发酵豆粕替代大口黑鲈饲料中45%的鱼粉不会对肠道织结构产生显着影响,而豆粕的替代比例为30%,不同比例豆粕和发酵豆粕替代鱼粉显着影响了大口黑鲈肠道微生物组成。试验三:大口黑鲈饲料中发酵豆粕营养价值的评定本试验设计了一个鱼粉含量为40%的基础饲料,然后将豆粕和发酵豆粕分别以10%、20%和30%的比例和基础饲料混合,配置成7组饲料,投喂大口黑鲈（35.7±1.0g）两周后收集粪便,采用套算法测定不同混合比例下大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中营养物质的表观消化率。结果表明:随着混合比例的增加,大口黑鲈对豆粕中干物质、粗蛋白质、磷和总氨基酸的表观消化率显着下降（P<0.05）,而发酵豆粕中各营养物质的表观消化率则变化不显着（P>0.05）。在30%的混合比例下,发酵豆粕中干物质、粗蛋白质、磷和总氨基酸消化率分别为81.97%、84.00%、46.94%和92.25%,均较豆粕的消化率显着提高（74.71%、76.56%、23.24%和87.34%）（P<0.05）。综上,豆粕经发酵后,干物质、粗蛋白质、总氨基酸和磷的表观消化率显着提高。试验四:低鱼粉饲料中添加丙氨酰谷氨酰胺对大口黑鲈生长、营养物质利用和肠道健康的影响为研究在低鱼粉饲料中添加丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）对大口黑鲈生长性能、营养物质利用、肠道组织结构和血清生化指标的影响,设计了一个鱼粉含量为35%的基础饲料（CON）,并采用发酵豆粕替代基础饲料中40%的鱼粉,制成一个低鱼粉饲料（FSBM-40）。然后在FSBM-40中分别添加0.3%、0.6%、0.9%和1.2%的AG（AG-3、AG-6、AG-9和AG-12）,共6组试验饲料,投喂大口黑鲈（7.0±0.1 g）8周。结果表明:FSBM-40组大口黑鲈的增重率较对照组显着下降,饲料系数显着升高（P<0.05）;当添加0.9%AG时,鱼体增重率显着提高（P<0.05）,饲料系数显着降低（P<0.05）,达到和对照组一致的水平。不同处理组之间大口黑鲈肌肉常规成分和氨基酸组成没有显着差异（P>0.05）。FSBM-40组的干物质和蛋白质表观消化率相比于对照组显着下降（P<0.05）,而在低鱼粉饲料中添加0.6%以上的Ala-Gln显着提高了干物质和蛋白质的表观消化率（P<0.05）。肠道组织结构分析表明,FSBM-40组的绒毛宽度显着降低,饲料中补充Ala-Gln后绒毛宽度显着增加（P<0.05）,FSBM-40组及各Ala-Gln添加组肠道绒毛上的杯状细胞数量较对照有明显的增加,各组之间的绒毛高度和肌层厚度没有显着性差异（P>0.05）。饲料中添加Ala-Gln后,血清中白蛋白的含量较对照组和FSBM-40组显着提高（P<0.05）,FSBM-40、AG-3、AG-6和AG-9组的血清甘油三酯含量较对照组显着降低（P<0.05）。综上,在低鱼粉饲料中添加0.9%的Ala-Gln能显着改善大口黑鲈的肠道组织结构,提高生长性能。试验五:低鱼粉饲料中添加丁酸梭菌和谷氨酰胺对大口黑鲈生长、营养物质利用、肠道组织结构和微生物的影响为了研究在低鱼粉饲料中添加丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）对大口黑鲈生长性能、营养物质利用和肠道健康的影响,设计了一个鱼粉含量为35%的基础饲料（CON）,以发酵豆粕替代基础饲料中40%鱼粉制成低鱼粉饲料（FSBM-40）。然后在FSBM-40中添加0.2%丁酸梭菌（1.5×108cfu/g）、0.6%Ala-Gln以及两者混合物（CB、AG和CB-AG）,投喂大口黑鲈（7.0±0.1 g）8周。结果表明:FSBM-40组大口黑鲈的增重率、干物质和蛋白质表观消化率相比于对照组显着下降,饲料系数显着升高（P<0.05）。在低鱼粉饲料中补充丁酸梭菌、Ala-Gln和两者混合物对生长性能没有显着改善（P>0.05）。添加Ala-Gln显着提高了大口黑鲈对饲料中干物质的表观消化率（P<0.05）。FSBM-40组和CB组的肠道绒毛宽度显着低于对照组（P<0.05）。AG+CB和AG组的肠道绒毛高度和血清中白蛋白的含量较FSBM-40组显着增加（P<0.05）。肠道微生物分析结果表明,饲料中添加Ala-Gln显着提高了大口黑鲈肠道中芽孢杆菌属和不动杆菌属细菌的相对丰度。综上,在低鱼粉饲料中补充0.2%丁酸梭菌和0.6%谷氨酰胺对大口黑鲈生长性能没有显着影响,补充Ala-Gln能在一定程度改善大口黑鲈的肠道组织结构,调节肠道微生物组成。
裴绪泽[7]（2020）在《α-酯酰基转移酶重组大肠杆菌生产丙谷二肽》文中提出丙谷二肽是目前发展较快,应用最成熟的二肽产品,具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,被广泛应用于食品,卫生医疗等各个领域之中。生物酶法作为一种新兴的合成丙谷二肽的方法,相比于传统的化学法来说具有绿色环保,副产物较少,反应迅速等优势,受到了国内外的广泛关注。但是目前生物酶法的研究还停留在实验室阶段,对于其工业化的方法没有相关报道。本论文以表达α-酯酰基转移酶的重组大肠杆菌为出发菌株,研究其高密度发酵策略及固定化策略,提高了丙谷二肽生产过程中的发酵效率并降低生产成本。为实现丙谷二肽的高效、经济的工业化生产奠定基础。首先,对于重组大肠杆菌的高密度发酵进行了条件优化。通过对培养基的种类,碳源、氮源等浓度进行选择优化,确定了最佳的发酵培养基:葡萄糖10 g/L,混合氮源24 g/L,磷酸二氢钾4.62 g/L,磷酸氢二钾25.08 g/L。在此基础上,在3 L发酵罐中对发酵过程的pH控制,补料种类以及补料方式进行了研究,选择出溶氧反馈补料的方法来达到菌株的高密度培养,其生物量为初始培养基的14倍。在高密度培养的情况下,诱导后全细胞催化丙谷二肽的生成率达到34.56 g/L,底物转化率约为53%,说明高密度发酵水平下的菌株仍然保持着较好的活性。其次,采用不同方法对高密度培养的重组菌株进行了固定化研究。发现了先包埋再对重组细胞中的外源蛋白进行诱导表达可以有效增强反应活性。从多种材料中筛选出了最佳固定化材料为海藻酸钠-氯化钙。在此基础上,进一步探究了固定化细胞的性质,发现在pH稳定性,温度稳定性方面比游离细胞都有明显的提升。在20℃35℃,pH 8.09.0时均表现出较好的活性,最佳pH值为9.0。除此之外,固定化细胞重复使用十次之后,仍然保持着较好的活性。将固定化细胞放入连续流填料床反应器,实现了丙谷二肽的连续化生产。在流速为5 mL/min时,生产效率达到2.79mg/（min×mL-CV）,底物转化率为51%。再次,对催化反应完成后的丙谷二肽分离纯化进行了探究。研究发现,利用在甲醇溶液中溶解性的差异,可以较好地分离丙谷二肽。将盐酸加入反应液处理,置于圆底烧瓶中减压蒸馏;将蒸馏出固体与纯甲醇混合,搅拌至充分溶解,抽滤取沉淀;沉淀加入70%的甲醇水溶液中,搅拌至充分溶解,抽滤取上清液;将上清液减压蒸馏得到丙谷二肽粗品。最后,基于上述研究成果,对于高密度发酵和固定化策略分别进行了简要的经济核算。高密度发酵生产相同量菌株时可以缩减80%的成本,具有较好的经济性。对固定化细胞反应进行经济核算,发现其生产成本为产物价值的40%左右,有较大的利润空间。
李嘉慧[8]（2020）在《DsrA-Hfq抗酸模块的进化及其提高大肠杆菌酸耐受性的研究》文中研究表明我国生物发酵工业产值超3000亿元,是我国战略产业的主攻方向之一。在生物发酵过程中,菌株常面临酸压力的逆境。提高菌株的酸耐受性,可降低发酵与其下游过程的中和剂用量与废水的排放,促进绿色制造。目前,大多数耐酸的研究关注其机理层面,合成生物学的发展使得通过人工设计高效抗酸模块以提高工业菌株的抗酸性能成为可能。在前期工作中,我们发现非编码小分子RNA（sRNA）DsrA和分子伴侣Hfq是有潜力的抗酸模块。本课题对DsrA-Hfq抗酸模块进行深入研究,通过建立基因组（genomic context）上抗酸模块的定向进化,实现DsrA-Hfq抗酸模块在大肠杆菌基因组上的改造,获得稳定遗传的耐酸菌株,并初步解析DsrA-Hfq突变株的抗酸机制。主要研究如下:成功构建基于CRISPR/Cas9和易错PCR技术对DsrA-Hfq抗酸模块进行基因组上的定向进化,发现以线性DNA形式为供体更优。筛选获得六株DsrA-Hfq抗酸模块突变株,与起始菌株MG1655相比,在中等酸压力下,突变株的终OD600提高了41%～51%（2%葡萄糖的培养基）和51%～72%（7.5%葡萄糖的培养基）,其中最优的两株突变株H4和E11比DsrA-Hfq（WT）提高了12.6%和11.6%,且能稳定遗传。在极端酸压力条件下存活率的变化较大,提高1～100倍,如突变株H4没有明显差异,突变株E11提高10倍。因此,我们建议采用中等酸条件下的生长测试更合适于对菌株抗酸性能的评估。进一步,分析DsrA-Hfq模块提高大肠杆菌酸耐受的机理。测序分析发现DsrA和Hfq的启动子区和基因区均有突变。其中,Hfq启动子区的突变提高了其转录水平;推测Hfq基因区的突变改变了其与相应sRNA的亲和力。DsrA基因区的突变,推测其提高了DsrA稳定性或结合Rpo S、H-NS等调控因子m RNA的能力,从而促进了下游相关抗酸基因的表达。定量PCR结果显示抗酸调控基因gad E以及结构基因gad B、yba S、hde B和kat E的转录水平都得到显着提高。γ-氨基丁酸释放和NH3释放研究也显示第二抗酸系统具有更高的活性。综上,推测第二抗酸系统、分子伴侣表达和自由基清除系统水平的提高是突变株抗酸性能提高的主要原因。本研究通过耦合sRNA DsrA和分子伴侣Hfq,并对其进行基因组上的定向进化,有效地提高大肠杆菌的抗酸性能。本研究为提高菌株酸耐受性的工程改造提供了新的思路与策略,也为基因元件器件、菌株定向进化提供了借鉴。
陈中山[9]（2019）在《一种微生物谷氨酰胺转胺酶的性质及应用研究》文中研究说明微生物谷氨酰胺转胺酶（Microbial Transglutaminase,MTG,EC 2.3.2.13）是一种转移酶,其作用是催化相同或不同蛋白质之间的交联反应,形成高分子复合物。因其来源于微生物,便于工业化生产,在医药工业尤其是食品领域中应用广泛。但是目前的市售MTG热稳定性不佳,导致其在高温食品生产制作中的应用受限。为了获得热稳定性更好的MTG,本文以实验室保存的从土壤中筛选得到的八株产MTG菌株为实验对象,经生物信息学方法分析及酶活半衰期测量,从八株菌株中进一步筛选得到菌株MJ-7,其所产的MTG具有最优良的热稳定性,本文将其命名为MTG-MJ7。为了得到纯度高的MTG-MJ7以便进行后续酶学性质的分析,对菌株MJ-7的发酵条件及MTG-MJ7的纯化条件进行优化。通过对液体酶制剂配方及固定化酶的研究,进一步提高了MTG-MJ7的热稳定性,并将其应用在高温喷雾干燥及食品领域当中。本文的主要结论如下:1、本文以实验室保存的八株产MTG菌株为实验对象,对其进行全基因组测序,将八株菌编码MTG的基因序列翻译后的氨基酸序列与市售MTG的氨基酸序列进行比对,挑选出三株候选菌株MJ-5、MJ-6、MJ-7,此三株菌所产MTG的理论氨基酸序列与市售MTG的氨基酸序列存在差异,将其所产MTG分别命名为MTG-MJ5、MTG-MJ6、MTG-MJ7。使用生物信息学方法对这三种MTG及市售MTG的结构进行分析,并通过酶活半衰期检测证明MTG-MJ7的热稳定性优于市售MTG。综合上述分析及实验得出结论,最能影响酶蛋白热稳定性的因素是结构中α螺旋的含量及氢键的数目,且热稳定性与α螺旋含量及氢键数目成正比。对菌株MJ-5、MJ-6、MJ-7编码MTG的相关片段进行PCR扩增,并对PCR产物进行测序,验证翻译后的理论氨基酸序列的真实性;2、为了初步获得一条工业化生产的工艺,使菌株MJ-7能够应用于后续生产,对菌株MJ-7的发酵条件及MTG-MJ7的工业纯化方法进行初步研究。通过优化碳氮源,确定了其最佳碳氮源分别是甘油和酵母浸粉FM802,在最优条件下MJ-7菌株发酵最高酶活达到0.91 U/m L,较未优化前的0.50 U/m L提高了82%。然后进行实验室规模的发酵罐小试放大培养,并对温度和p H进行优化。最终确定发酵罐小试最佳条件为25℃、p H 6.5,此条件下酶活达到0.95 U/m L,较未优化前（发酵罐30℃、p H 7.4）的0.86 U/m L提高了10.5%。经过超滤浓缩、乙醇沉淀,酶活由0.95 U/m L提高至16.97 U/m L,酶活回收率为71.45%,比酶活由0.16 U/mg提高至0.59 U/mg,纯化倍数为3.69,初步证实了其工业纯化的可行性;3、为了便于进行后续的酶学性质及应用研究,探讨杂质对MTG-MJ7热稳定性的影响,本文对MTG-MJ7的精细纯化方式展开研究,在工业纯化方法的基础上进一步提高它的纯度。在精细纯化中,确定了阴离子交换层析的方法,优化条件为p H 8.0、10 mmol/L的磷酸盐缓冲液,上样量10 mg。此条件适用于体系的放大,酶活回收率可达76.25%,比酶活由0.59 U/mg提高至4.33 U/mg,纯化倍数为7.34。最后结合凝胶层析,MTG-MJ7达到98.7%电泳纯。纯化后的MTG-MJ7在80℃下的酶活半衰期较纯化前延长了50%,表明杂质的减少有助于热稳定性的提升;4、对纯化后的MTG-MJ7进行酶学性质的分析,首先经高分辨质谱检测其分子量为37836.39 Da,与理论序列分子量一致,证明其理论序列即为实际序列。通过底物特异性实验找到其最适底物为底物5。MTG-MJ7的最适反应温度介于54℃～56℃之间,高于市售MTG,且中高温下的酶活半衰期也长于市售MTG,验证其热稳定性优良的特性。MTG-MJ7的最适p H与p H稳定性和市售MTG一致;5、纯化后MTG-MJ7的热稳定性有一定程度的改善,但仍不是特别理想。为进一步提高MTG-MJ7的热稳定性,本文从液体酶制剂配方及固定化酶两方面进行研究。液体酶制剂配方方面,首创了?KTA-96孔板高效筛选法,筛选出甘油和海藻糖的适宜浓度范围。并通过正交实验、抑菌实验及金属离子实验,确定最优配方为35%甘油+21%海藻糖+0.003%H2O2+100 mmol/L氯化钾,此配方可使MTG-MJ7的热稳定性提高,80℃下酶活半衰期较纯酶延长33.3%。将此最优配方下的MTG-MJ7进行海藻酸钠凝胶固定化,最佳固定化条件为2%海藻酸钠、2%氯化钙、30 min凝胶时间,固定后可使80℃下的酶活半衰期较纯酶延长116.7%;6、将配方优化后的MTG-MJ7酶制剂应用于高温喷雾干燥及食品中。经120℃高温喷雾干燥后的MTG-MJ7固体酶制剂,酶活回收率为86.2%,满足工业化生产的需求。在食品制作方面,在60℃下,较之市售MTG,MTG-MJ7能更加显着地提高明胶产品、蛋清产品的凝胶强度。并证实了一步法制作肉丸的可行性,经一步法制作的鸡肉丸,硬度达到408.5±24.2 g,弹性达到47.4±2.6%,与传统两步法的结果（硬度424.2±32.9 g,弹性49.2±2.7%）无显着性差异。电镜照片显示,一步法制作的肉丸切面光滑均一,无明显孔洞,与两步法的结果一致。综上所述,本文从发酵、纯化、酶学性质鉴定及生产应用方面对MTG-MJ7的性质进行了研究,并对其热稳定性进行了分析和人工改良,为实现其商品化奠定理论基础。
白婧[10]（2015）在《利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺》文中研究指明谷氨酸棒状杆菌（C glutamicum）,革兰氏阳性细菌,是应用于发酵生产中最重要的菌种之一,常被用来生产L-赖氨酸,L-谷氨酸,谷氨酸钠和L-谷氨酰胺（L-Gln）等。谷氨酰胺合成酶（GS）是L-谷氨酰胺（L-Gln）合成过程中的关键酶,然而GS的酶活性会受到多种因素的影响,导致其酶活力不强,产物L-Gln偏低,因此掌握谷氨酰胺合成酶的功能和特性对于L-Gln发酵生产具有特殊意义。本文以GS的基因为研究对象,构建谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的高效表达系统。利用C.glutamicum中的两种强启动子:tac启动子（Ptac）和麦芽糖启动子（Pmal）,比较不同启动子作用下GS的酶活力;其次,为了避免腺苷酰化对C.glutamicum的GS的抑制作用,将GS的腺苷酰化位点突变成苯丙氨酸（Tyr405Phe）;同时由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的谷氨酰胺合成酶不受腺苷酰化作用的影响,故将Bacillussubtilis的GS基因导入到C.glutamicum的表达系统中,比较两种基因来源不同GS的酶活力高低,以期达到高产L-Gln的目的。最终结果表明,在谷氨酸棒状杆菌的表达系统中,Ptac比Pmal的效果更好,来自C.glutamicum的GS突变型比来自Bacillus subtilis的GS酶活力更高。重组菌BJ2有最高的酶活力和产量,L-Gln的最终产量达到32.5 g/L。
二、谷氨酰胺发酵条件研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、谷氨酰胺发酵条件研究（论文提纲范文）
（1）谷氨酰胺转氨酶高效表达及热稳定性改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷氨酰胺转氨酶概述 |
| 1.1.1 谷氨酰胺转氨酶的催化特性 |
| 1.1.2 不同来源的谷氨酰胺转氨酶 |
| 1.1.3 微生物谷氨酰胺转氨酶的应用 |
| 1.1.4 谷氨酰胺转氨酶的结构与作用机制 |
| 1.1.5 微生物谷氨酰胺转氨酶的理化性质 |
| 1.2 微生物产谷氨酰胺转氨酶研究进展 |
| 1.2.1 发酵法产谷氨酰胺转氨酶 |
| 1.2.2 基因工程手段提高谷氨酰胺转氨酶产量 |
| 1.3 自裂解系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌E.coli细胞膜结构 |
| 1.3.2 大肠杆菌素裂解酶 |
| 1.3.3 噬菌体裂解系统 |
| 1.4 酶的稳定性改造 |
| 1.4.1 传统实验方法 |
| 1.4.2 计算机技术 |
| 1.5 立题依据及意义 |
| 1.6 本论文主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基及配制溶液 |
| 2.2 操作方法 |
| 2.2.1 DNA操作 |
| 2.2.2 质粒与菌株的构建 |
| 2.2.3 软件分析 |
| 2.2.4 控制发酵条件对菌株的培养 |
| 2.2.5 发酵产物回收 |
| 2.2.6 TGase的纯化及脱盐 |
| 2.2.7 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.8 SDS-PAGE凝胶电泳检测方法 |
| 2.2.9 酶活测定方法 |
| 2.2.10 自裂解效率测定 |
| 2.2.11 酶半衰期的测定 |
| 2.2.12 巯基滴定法检测二硫键生成 |
| 2.2.13 差示扫描热量测定 |
| 2.2.14 动力学参数测定 |
| 2.2.15 酶-底物分子对接 |
| 2.2.16 分子动力学模拟 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达优化 |
| 3.1.1 摇瓶发酵条件的优化 |
| 3.1.2 自诱导培养基发酵 |
| 3.1.3 替换酶原区对pro-TGase表达的影响 |
| 3.1.4 高酶活TGase与N端融合标签整合提高胞内酶活 |
| 3.2 TGASE自裂解活性表达双质粒系统的构建及表达 |
| 3.2.1 自裂解质粒pRSFDuet-1-SRRz的构建 |
| 3.2.2 TGase自裂解双质粒系统的表达 |
| 3.3 谷氨酰胺转氨酶热稳定性的提高 |
| 3.3.1 二硫键改造位点的构建及表达 |
| 3.3.2 高热稳定型TGase突变体的初筛及二硫键验证 |
| 3.3.3 TGase突变体MS-P22C-Q328C酶学性质分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 引言 |
| 1.1 谷氨酰胺转氨酶的催化反应及应用价值 |
| 1.2 谷氨酰胺转氨酶的来源 |
| 1.3 MTG异源表达研究 |
| 1.3.1 宿主微生物的选择 |
| 1.3.2 MTG活性表达策略 |
| 1.4 毕赤酵母研究进展 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母常见菌株及表达载体 |
| 1.4.3 毕赤酵母发酵一般过程 |
| 1.4.4 发酵条件的优化 |
| 1.5 本研究主要内容及意义 |
| 2 谷氨酰胺转氨酶在毕赤酵母GS115的表达研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要培养基及试剂 |
| 2.1.4 仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组载体的构建 |
| 2.2.2 重组质粒pPIC9K-pro-kex-TGase转入毕赤酵母GS115 |
| 2.2.3 重组GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase摇瓶培养诱导表达 |
| 2.2.4 酶活测定及SDS-PAGE电泳 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组质粒的构建 |
| 2.3.2 重组质粒pPIC9K-pro-kex-TGase整合到毕赤酵母GS115 |
| 2.3.3 重组GS115菌株表达谷氨酰胺转氨酶 |
| 2.4 小结 |
| 3 重组谷氨酰胺转氨酶酶学性质 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 重组谷氨酰胺转氨酶的最适温度及温度稳定性 |
| 3.2.2 重组谷氨酰胺转氨酶的最适pH |
| 3.2.3 不同离子浓度对重组谷氨酰胺转氨酶的影响 |
| 3.2.4 不同化学试剂对谷氨酰胺转氨酶的影响 |
| 3.2.5 重组谷氨酰胺转氨酶的动力学常数 |
| 3.3 小结 |
| 4 重组GS115菌株产MTG发酵条件优化及发酵罐扩大培养 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 摇瓶种子液的最佳时间确定 |
| 4.2.2 用PB设计筛选TGase表达的主要因素 |
| 4.2.3 用RSM优化显着因子 |
| 4.2.4 发酵条件优化验证 |
| 4.2.5 发酵罐扩大培养 |
| 4.3 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 吸水链霉菌107.3经毕赤酵母密码子优化后的谷氨酰胺转氨酶基因 |
| 硕士期间发表学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）基于比较转录组学和ChIP-Seq研究转录因子Dal80p在酿酒酵母氮代谢中的调控功能（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 发酵食品的定义、历史、特点 |
| 1.1.1 发酵食品的定义、分类和作用 |
| 1.1.2 发酵食品加工中面临的挑战 |
| 1.1.3 发酵食品中的胺类物质与生物胺研究 |
| 1.1.4 发酵食品中的氨基甲酸乙酯研究 |
| 1.2 酵母氮代谢与发酵食品安全问题 |
| 1.2.1 酿酒酵母在发酵食品中的应用 |
| 1.2.2 酿酒酵母细胞的氮代谢调控研究 |
| 1.2.2.1 酿酒酵母细胞对氮源的感知调控 |
| 1.2.2.2 酿酒酵母胞内的氮源转运调控研究 |
| 1.2.2.3 酿酒酵母的氮代谢转录调控机理 |
| 1.2.2.4 酿酒酵母氮代谢的翻译调控研究 |
| 1.2.2.5 碳源条件对酿酒酵母氮代谢的影响 |
| 1.2.2.6 液泡膜蛋白对酿酒酵母氮代谢的影响 |
| 1.3 本课题研究意义和主要研究内容 |
| 1.3.1 课题研究意义 |
| 1.3.2 论文主要研究内容 |
| 第二章 氮代谢转录因子Dal80p对酿酒酵母氮源利用选择的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基与主要试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Dal80 过表达菌株的构建 |
| 2.3.2 酵母细胞生长曲线的测定 |
| 2.3.3 发酵液中尿素浓度的测定 |
| 2.3.4 发酵液中氨基酸和硫酸铵浓度的测定 |
| 2.3.5 Dal80p对菌株在YPD和 YNB培养基条件下的生长及精氨酸和尿素代谢的影响 |
| 2.3.6 Dal80p对菌株氮源选择利用的影响 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.0 PCR获得dal80 基因和EGFP报告基因 |
| 2.4.1 表达载体的获得及验证 |
| 2.4.2 Dal80p对酿酒酵母在丰富型氮源精氨酸选择培养基下生长及精氨酸利用的影响 |
| 2.4.3 Dal80p对酿酒酵母在丰富型氮源尿素选择培养基下生长及尿素利用的影响 |
| 2.4.4 Dal80p对酿酒酵母在匮乏型氮源精氨酸选择培养基下生长及对精氨酸利用影响 |
| 2.4.5 Dal80p对酿酒酵母在匮乏型氮源尿素培养下细胞生长及尿素利用的调控 |
| 2.4.6 Dal80p对培养体系中氮源选择利用的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 转录因子Dal80p在偏好性氮源培养体系中对精氨酸和尿素利用抑制的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酵母细胞生长曲线的测定 |
| 3.3.2 胞内和发酵液中尿素的测定 |
| 3.3.4 胞内和发酵液中精氨酸浓度的测定 |
| 3.3.5 精氨酸酶活性测定 |
| 3.3.6 尿素酶活性测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Dal80 敲除和过表达对酵母细胞在偏好性氮源的选择培养条件下对细胞生长和尿素利用的影响 |
| 3.4.2 Dal80 敲除和过表达对酵母细胞在偏好性氮源选择培养条件下细胞生长和精氨酸利用的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于RNA-Seq研究在低浓度谷氨酰胺条件下Dal80p对氮代谢转录调控的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 主要材料与仪器 |
| 4.2.1 菌株与培养基 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.3 实验设计与研究方法 |
| 4.3.1 实验设计 |
| 4.3.2 总RNA提取 |
| 4.3.3 转录组测序 |
| 4.3.4 测序数据质控、序列比对分析和转录本组装 |
| 4.3.5 转录组功能注释 |
| 4.3.6 基因表达量分析、表达量差异分析和基因集分析 |
| 4.3.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 RNA样本及测序数据质控和序列比对分析 |
| 4.4.2 表达量统计及样本相关性分析 |
| 4.4.3 表达差异分析 |
| 4.4.4 差异表达基因集分析 |
| 4.4.5 差异表达基因的功能富集分析 |
| 4.4.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于RNA-Seq研究在高浓度谷氨酰胺条件下Dal80p在氮代谢过程中的转录调控作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 主要材料与仪器 |
| 5.2.1 菌株与培养基 |
| 5.2.2 仪器与试剂 |
| 5.3 实验设计与方法 |
| 5.3.1 实验设计 |
| 5.3.2 总RNA的提取 |
| 5.3.3 转录组测序 |
| 5.3.4 测序数据质控、序列比对分析和转录本组装 |
| 5.3.5 转录组功能注释 |
| 5.3.6 基因表达量分析、表达量差异分析和基因集分析 |
| 5.3.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 RNA样本及测序数据质控和序列比对分析 |
| 5.4.2 表达量统计及样本相关性分析 |
| 5.4.3 表达差异分析 |
| 5.4.4 差异表达基因集分析 |
| 5.4.5 差异表达基因功能富集分析 |
| 5.4.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 基于ChIP-Seq探究转录因子Dal80p调控氮代谢的作用机理 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 主要材料与仪器 |
| 6.2.1 菌株和质粒 |
| 6.2.2 培养基与主要试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.3 实验设计与研究方法 |
| 6.3.1 Dal80Δ-dal80-3XFlag-p ESC-ura菌株的构建 |
| 6.3.2 Dal80-3XFlag蛋白在 dal80Δ-pESC-ura-TEF1-dal80-3xFlag 菌株中表达验证 |
| 6.3.3 ChIP-Seq文库构建 |
| 6.3.4 ChIP-Seq的主要生物信息学分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 DNA超声化片段结果及IP结果Western blot检测 |
| 6.4.2 IP实验中的DNA富集情况 |
| 6.4.3 样品在参考基因组上不同区域的分布 |
| 6.4.4 Reads在基因上下游的分布 |
| 6.4.5 样本生物学重复相关性检测 |
| 6.4.6 Peak的长度分布统计、数目统计 |
| 6.4.7 Peak在染色体的上分布分析 |
| 6.4.8 Peak在基因组功能区的分布 |
| 6.4.9 Peak在 TSS上下游的分布分析 |
| 6.4.10 Peak关联基因的数量统计以及相关基因的功能富集分析 |
| 6.4.11 实时荧光定量PCR验证 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 论文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 主要研究成果及作者简介 |
（4）谷氨酰胺转氨酶的发酵优化及活化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷氨酰胺转氨酶概述 |
| 1.1.1 谷氨酰胺转氨酶催化特性及来源 |
| 1.1.2 谷氨酰胺转氨酶的应用 |
| 1.2 谷氨酰胺转氨酶的微生物发酵 |
| 1.2.1 链霉菌谷氨酰胺转氨酶的活化机制 |
| 1.2.2 野生菌发酵生产 |
| 1.2.3 利用重组菌生产 |
| 1.3 酶固定化技术 |
| 1.3.1 吸附法酶固定化技术 |
| 1.3.2 包埋法酶固定化技术 |
| 1.3.3 共价交联法酶固定化技术 |
| 1.3.4 其他酶固定化技术 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 1.5 本文主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 试剂和仪器 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分子生物学操作 |
| 2.2.2 Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase5L罐发酵条件优化 |
| 2.2.3 TAMEP在大肠杆菌中表达的重组质粒的构建与转化 |
| 2.2.4 重组大肠杆菌的培养发酵方法 |
| 2.2.5 TAMEP信号肽N端密码子的优化 |
| 2.2.6 重组大肠杆菌发酵优化 |
| 2.2.7 蛋白质分离纯化 |
| 2.2.8 壳聚糖小球的制备 |
| 2.2.9 固定化TAMEP的方法及其优化 |
| 2.2.10 游离TAMEP酶学性质的测定 |
| 2.2.11 固定化TAMEP酶学性质的测定 |
| 2.2.12 分析方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase在5 L罐中的发酵优化 |
| 3.1.1 搅拌转速对Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase发酵过程的影响 |
| 3.1.2 pH控制对Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase发酵过程的影响 |
| 3.1.3 甘油补料对Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase发酵过程的影响 |
| 3.2 TAMEP在 E.coli中重组表达 |
| 3.2.1 信号肽来源优化提高TAMEP在 E.coli中的分泌表达 |
| 3.2.2 信号肽N端密码子同义突变提高TAMEP在 E.coli中的表达 |
| 3.2.3 发酵条件优化提高TAMEP在 E.coli中的表达 |
| 3.2.4 TAMEP的纯化及酶学性质研究 |
| 3.2.5 TAMEP催化pro-TGase活化 |
| 3.3 固定化TAMEP活化pro-TGase |
| 3.3.1 TAMEP固定化参数优化 |
| 3.3.2 固定化TAMEP的酶学性质研究 |
| 3.3.3 固定化TAMEP催化pro-TGase活化 |
| 3.3.4 固定化TAMEP的重复利用性分析 |
| 主要结论和展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士期间发表的论文 |
（5）谷氨酰胺转氨酶在酶改性中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 酶分子交联 |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 固定化酶与交联酶结晶体 |
| 1.1.3 交联酶聚集体(CLEA) |
| 1.1.4 交联酶聚集体的应用 |
| 1.2 谷氨酰胺转氨酶 |
| 1.2.1 谷氨酰胺转氨酶简介 |
| 1.2.2 谷氨酰胺应用现状 |
| 1.3 肽链标签与特异性交联 |
| 1.3.1 肽链标签简介 |
| 1.3.2 肽链标签特异性交联的应用现状 |
| 1.4 本论文的研究思路与内容 |
| 第二章 增强型绿色荧光蛋白中验证肽链标签的可行性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和实验设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 谷氨酰胺转氨酶酶活的测定方法 |
| 2.3.2 带有标签的增强型绿色荧光蛋白的表达与条件优化 |
| 2.3.3 带有标签的增强型绿色荧光蛋白的纯化 |
| 2.3.4 带有标签的增强型绿色荧光蛋白的表征 |
| 2.3.5 谷氨酰胺转氨酶交联带有标签的增强型绿色荧光蛋白 |
| 2.4 实验结果及分析 |
| 2.4.1 谷氨酰胺转氨酶酶活的测定 |
| 2.4.2 带有标签的增强型绿色荧光蛋白的表达与纯化 |
| 2.4.3 带有标签的增强型绿色荧光蛋白的表征 |
| 2.4.4 谷氨酰胺转氨酶交联带有标签的增强型绿色荧光蛋白 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 谷氨酰胺转氨酶催化碳酸酐酶和甲酸脱氢酶特异性交联 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 带有标签的碳酸酐酶和甲酸脱氢酶表达及条件的优化 |
| 3.3.2 带有标签的碳酸酐酶和甲酸脱氢酶的纯化 |
| 3.3.3 碳酸酐酶和甲酸脱氢酶酶活的测定方法 |
| 3.3.4 谷氨酰胺转氨酶介导碳酸酐酶和甲酸脱氢酶实现特异性交联及其表征 |
| 3.3.5 交联双酶在CO_2还原产HCOOH中的应用 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.4.1 带有标签的碳酸酐酶和甲酸脱氢酶表达及条件的优化 |
| 3.4.2 带有标签的碳酸酐酶和甲酸脱氢酶的纯化 |
| 3.4.3 碳酸酐酶和甲酸脱氢酶酶活的测定方法 |
| 3.4.4 谷氨酰胺转氨酶介导碳酸酐酶和甲酸脱氢酶实现特异性交联 |
| 3.4.5 交联方式对双酶酶活及热稳定性的影响 |
| 3.4.6 交联方式对双酶催化CO_2还原产甲酸效率的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 谷氨酰胺转氨酶催化水溶性高分子聚合物与蛋白质特异性交联 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 聚合物单体与水溶性高分子聚合物的制备与表征 |
| 4.3.2 谷氨酰胺转氨酶催化水溶性高分子聚合物与蛋白质特异性交联形成缀合物 |
| 4.3.3 谷氨酰胺转氨酶催化双酶在水溶性高分子聚合物上的固定化 |
| 4.3.4 固定化双酶的热稳定以及催化效率的测定 |
| 4.3.5 凝血酶介入实现蛋白质从缀合物上的分离实现蛋白的纯化 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 聚合物单体与水溶性高分子聚合物的制备与表征 |
| 4.4.2 谷氨酰胺转氨酶催化水溶性高分子聚合物与蛋白质特异性交联形成缀合物 |
| 4.4.3 谷氨酰胺转氨酶催化双酶在水溶性高分子聚合物上的固定化 |
| 4.4.4 固定化双酶的热稳定以及催化效率的测定 |
| 4.4.5 凝血酶介入实现蛋白质从缀合物上的分离以实现蛋白质的纯化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 导师简介及作者介绍 |
| 附件 |
（6）大口黑鲈饲料中发酵豆粕替代鱼粉的效果及谷氨酰胺、丁酸梭菌提升其效价的营养策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 发酵豆粕在水产饲料中的应用研究进展 |
| 1.1 发酵豆粕的营养特点 |
| 1.1.1 抗营养因子水平 |
| 1.1.2 常规营养成分 |
| 1.1.3 其他生物活性成分 |
| 1.2 发酵豆粕在水产饲料中替代鱼粉的作用效果 |
| 1.3 发酵豆粕对水产动物肠道消化功能的影响 |
| 1.4 发酵豆粕对水产动物免疫功能的影响 |
| 1.5 发酵豆粕对水产动物肠道微生物的影响 |
| 1.5.1 鱼类的肠道微生物组成 |
| 1.5.2 鱼类的肠道微生物的功能 |
| 1.5.3 豆粕和发酵豆粕对鱼类肠道微生物组成的影响 |
| 1.6 发酵豆粕在水产饲料中应用的注意问题 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈生长性能、营养物质利用和血清生化指标的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验饲料 |
| 2.1.2 试验用鱼与饲养管理 |
| 2.1.3 样品采集与计算 |
| 2.1.4 指标测定 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈生长性能和营养物质利用的影响 |
| 2.3.2 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肌肉营养成分和血清生化指标的影响 |
| 2.3.3 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈消化酶活力的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构和微生物的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验饲料 |
| 3.1.2 试验用鱼与饲养管理 |
| 3.1.3 样品采集与计算 |
| 3.1.4 肠道组织切片 |
| 3.1.5 肠道微生物分析 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构的影响 |
| 3.2.2 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道微生物组成的影响(涂板法) |
| 3.2.3 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道微生物组成的影响(高通量测序法) |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道组织结构的影响 |
| 3.3.2 发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈肠道微生物的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 大口黑鲈饲料中发酵豆粕营养价值的评定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验饲料 |
| 4.1.2 试验用鱼与饲养管理 |
| 4.1.3 样品采集 |
| 4.1.4 指标测定 |
| 4.1.5 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 大口黑鲈对混合饲料中常规营养物质的表观消化率 |
| 4.2.2 大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中常规营养成分的表观消化率 |
| 4.2.3 大口黑鲈对混合饲料中氨基酸的表观消化率 |
| 4.2.4 大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中氨基酸的表观消化率 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 发酵豆粕的营养价值 |
| 4.3.2 大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中营养物质的表观消化率 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 低鱼粉饲料中添加丙氨酰谷氨酰胺对大口黑鲈生长、营养物质利用和肠道健康的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验饲料 |
| 5.1.2 试验用鱼与饲养管理 |
| 5.1.3 样品采集与计算 |
| 5.1.4 指标测定 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Ala-Gln对大口黑鲈生长性能的影响 |
| 5.2.2 Ala-Gln对大口黑鲈肌肉常规成分及氨基酸的影响 |
| 5.2.3 Ala-Gln对大口黑鲈营养物质利用率和消化酶活力的影响 |
| 5.2.4 Ala-Gln对大口黑鲈肠道组织结构的影响 |
| 5.2.5 Ala-Gln对大口黑鲈血清生化指标的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 Ala-Gln对大口黑鲈生长性能和营养物质利用的影响 |
| 5.3.2 Ala-Gln对大口黑鲈肠道健康的影响 |
| 5.3.3 Ala-Gln对大口黑鲈血清生化指标的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 低鱼粉饲料中添加丁酸梭菌和丙氨酰谷氨酰胺对大口黑鲈生长、营养物利用、肠道组织结构和微生物的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验饲料 |
| 6.1.2 试验用鱼与饲养管理 |
| 6.1.3 样品采集与计算 |
| 6.1.4 指标测定 |
| 6.1.5 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈生长性能的影响 |
| 6.2.2 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈肌肉常规成分的影响 |
| 6.2.3 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈营养物质利用率和消化酶活力的影响 |
| 6.2.4 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈肠道组织结构的影响 |
| 6.2.5 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈血清生化指标的影响 |
| 6.2.6 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈肠道微生物的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈生长性能和营养物质利用的影响 |
| 6.3.2 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈血清生化指标的影响 |
| 6.3.3 丁酸梭菌和Ala-Gln对大口黑鲈肠道健康的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 学术成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）α-酯酰基转移酶重组大肠杆菌生产丙谷二肽（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 二肽 |
| 1.1.1 二肽的功能和应用 |
| 1.1.2 丙谷二肽 |
| 1.1.3 丙谷二肽合成方式 |
| 1.2 高密度表达策略 |
| 1.2.1 大肠杆菌高密度策略概述 |
| 1.2.2 高密度表达策略影响因素 |
| 1.3 细胞固定化技术 |
| 1.3.1 固定化技术特性 |
| 1.3.2 细胞固定化方式 |
| 1.3.3 固定化细胞连续化生产反应器 |
| 1.4 丙谷二肽的分离纯化 |
| 1.5 本课题的研究目的及研究意义 |
| 2 重组大肠杆菌的高密度发酵 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌种 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.2.4 培养基和溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种培养及发酵条件 |
| 2.3.2 培养基的优化 |
| 2.3.3 发酵罐实验 |
| 2.3.4 高密度培养条件优化 |
| 2.3.5 分析方法 |
| 2.3.6 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 标准曲线 |
| 2.4.2 培养基优化 |
| 2.4.3 高密度培养条件优化 |
| 2.4.4 高密度培养条件下酶活性测试 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 固定化重组大肠杆菌生产丙谷二肽 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.2.4 培养基和溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 固定化菌株准备 |
| 3.3.2 固定化材料选择 |
| 3.3.3 固定化性质研究 |
| 3.3.4 连续化丙谷二肽的生产 |
| 3.3.5 分析方法 |
| 3.3.6 数据分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 包埋时间的确定 |
| 3.4.2 固定化材料选择 |
| 3.4.3 固定化细胞性质研究 |
| 3.4.4 连续化丙谷二肽的合成 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 丙谷二肽的分离纯化及生产过程经济核算 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 分离纯化 |
| 4.3.2 经济核算 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 丙谷二肽的分离纯化 |
| 4.4.2 丙谷二肽生产过程的经济核算 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）DsrA-Hfq抗酸模块的进化及其提高大肠杆菌酸耐受性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 工业微生物酸耐受性的重要性 |
| 1.1.1 生物发酵与酸压力 |
| 1.1.2 酸性物质对发酵微生物细胞的损伤 |
| 1.1.3 微生物酸耐受的重要意义 |
| 1.2 大肠杆菌的抗酸系统和调控网络 |
| 1.2.1 大肠杆菌的天然抗酸系统 |
| 1.2.2 大肠杆菌的抗酸调控网络 |
| 1.3 微生物酸耐受性改造方法及研究进展 |
| 1.3.1 适应性驯化抗酸改造 |
| 1.3.2 人工诱变抗酸改造 |
| 1.3.3 基因组洗牌抗酸改造 |
| 1.3.4 酸耐受性机制相关的结构蛋白过表达抗酸改造 |
| 1.3.5 全局转录调控和抗酸调控因子抗酸改造 |
| 1.4 基于合成生物学与CRISPR/Cas9 技术的微生物制造 |
| 1.4.1 合成生物学与微生物制造 |
| 1.4.2 微生物合成生物学与CRISPR/Cas9 技术 |
| 1.4.3 微生物抗逆与合成生物学 |
| 1.5 本研究的意义与主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 DsrA-Hfq抗酸模块在基因组上的定向进化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器与材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 基因组上的突变库方法的建立 |
| 2.3.1 基于线性双链DNA形式建库 |
| 2.3.2 基于质粒DNA形式建库 |
| 2.4 基因组上的突变库方法的评估 |
| 2.4.1 目的基因的随机突变效果 |
| 2.4.2 整合效率 |
| 2.4.3 质粒丢失效率 |
| 2.4.4 突变库的富集筛选评估 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的抗酸性能评估 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的构建 |
| 3.3.1 DsrA-Hfq抗酸模块突变体的获得 |
| 3.3.2 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的获得 |
| 3.4 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的表征 |
| 3.4.1 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的酸压力生长测试 |
| 3.4.2 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的酸冲击存活测试 |
| 3.4.3 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的遗传稳定性测试 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 DsrA-Hfq抗酸模块突变株的抗酸机理解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器与材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 DsrA-Hfq突变体的突变位点分析及其调控机制探究 |
| 4.3.1 启动子区域的突变分析 |
| 4.3.2 基因区域的突变分析 |
| 4.4 DsrA-Hfq抗酸模块突变株抗酸基因的转录表达分析 |
| 4.5 DsrA-Hfq抗酸模块突变株对谷氨酰胺依赖的抗酸系统的影响 |
| 4.6 DsrA-Hfq抗酸模块突变株对谷氨酸依赖的抗酸系统的影响 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新性 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 引物序列表 |
| 附录2 25 mM柠檬酸盐缓冲液(10 mM谷氨酸或谷氨酰胺,p H4.5) |
| 附录3 GABA浓度测量反应液 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）一种微生物谷氨酰胺转胺酶的性质及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 微生物谷氨酰胺转胺酶概况 |
| 2.1 微生物谷氨酰胺转胺酶的特点 |
| 2.2 微生物谷氨酰胺转胺酶在食品领域中的应用 |
| 2.3 产微生物谷氨酰胺转胺酶菌种的选育 |
| 2.4 微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化 |
| 3 微生物谷氨酰胺转胺酶的性质研究 |
| 3.1 微生物谷氨酰胺转胺酶的结构、成熟机制及催化机制 |
| 3.2 微生物谷氨酰胺转胺酶的保存稳定性及热稳定性研究 |
| 3.3 生物信息学在蛋白质结构分析中的应用 |
| 4 本课题的研究目的和意义 |
| 5 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 基于基因组测序及生物信息学分析的MTG的筛选 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 产MTG菌株的初步筛选 |
| 3.2 MTG-MJ5、MTG-MJ6、MTG-MJ7与市售MTG的序列对比 |
| 3.3 菌株MJ-5、MJ-6、MJ-7全基因组提取及PCR引物设计 |
| 3.4 PCR产物的测序和拼接 |
| 3.5 MTG-MJ5, MTG-MJ6, MTG-MJ7与市售MTG一级结构比较 |
| 3.6 MTG-MJ5, MTG-MJ6, MTG-MJ7与市售MTG二级结构比较 |
| 3.7 MTG-MJ5, MTG-MJ6, MTG-MJ7与市售MTG热稳定性比较 |
| 3.8 MTG-MJ7三级结构的活性位点分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 MJ-7 发酵条件及MTG-MJ7工业纯化方式的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 MJ-7菌株发酵培养基的优化 |
| 3.2 MJ-7菌株发酵罐小试条件的优化 |
| 3.3 MTG-MJ7的工业纯化步骤 |
| 3.4 真空冷冻干燥制备固体酶制剂 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 MTG-MJ7的精细纯化方法研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 阳离子交换层析纯化MTG-MJ7 |
| 3.2 阴离子交换层析-pH优化 |
| 3.3 阴离子交换层析-缓冲体系盐离子浓度优化 |
| 3.4 阴离子交换层析-上样量优化 |
| 3.5 阴离子交换层析-工艺放大 |
| 3.6 凝胶层析 |
| 3.7 纯化后MTG-MJ7热稳定性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 MTG-MJ7酶学性质及其热稳定性改善方法的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 MTG-MJ7的分子量测定 |
| 3.2 MTG-MJ7酶促动力学参数测定 |
| 3.3 MTG-MJ7的底物特异性研究 |
| 3.4 MTG-MJ7的最适反应温度及热稳定性研究 |
| 3.5 MTG-MJ7的最适反应pH及pH稳定性研究 |
| 3.6 蔗糖与海藻糖对MTG-MJ7热稳定性的影响 |
| 3.7 ?KTA-96孔板筛选法筛选配方 |
| 3.8 H_2O_2的抑菌效果及对酶活的影响 |
| 3.9 金属离子对热稳定性的影响 |
| 3.10 海藻酸钠凝胶固定法中浓度对凝胶强度的影响 |
| 3.11 海藻酸钠凝胶固定法正交实验设计 |
| 3.12 配方优化及海藻酸钠凝胶固定法对热稳定性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 MTG-MJ7在高温喷雾干燥及食品中的应用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 高温喷雾干燥制备MTG-MJ7固体酶制剂 |
| 3.2 MTG-MJ7在明胶制品中的应用 |
| 3.3 MTG-MJ7在蛋清制品中的应用 |
| 3.4 MTG-MJ7在鸡肉丸制作中的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 致谢 |
（10）利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 L-谷氨酰胺在自然界的存在和理化性质 |
| 1.2 L-谷氨酰胺的生理功能 |
| 1.2.1 抗胃肠道溃疡作用 |
| 1.2.2 L-谷氨酰胺的免疫功能 |
| 1.2.3 L谷氨酰胺的营养保健作用 |
| 1.2.4 L-谷氨酰胺在细胞培养方面的应用 |
| 1.3 谷氨酰胺的市场状况与发展前景 |
| 1.4 生产L-谷氨酰胺的方法 |
| 1.4.1 化学合成法 |
| 1.4.2 酶法 |
| 1.4.3 发酵法 |
| 1.5 基因工程在谷氨酰胺生产中的应用 |
| 1.6 本论文的研究内容 |
| 第二章 谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及GS的酶活力检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种与质粒 |
| 1.2 实验主要的试剂和仪器 |
| 1.3 实验的培养基 |
| 1.4 实验的主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 表达载体pEKEX2-Ptac-glnA~m,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)的构建 |
| 2.2 表达载体pEKEX2-Pmal-glnA~m,pEKEX2-Pmal-glnA~(BS)的构建 |
| 2.3 表达载体pEKEX2-Ptac-glnA~m-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~m-F-Ptac-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)-F-Ptac-vgb-F的构建 |
| 2.4 Cglutamicum感受态细胞的制备和电击转化 |
| 2.5 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 2.6 谷氨酰胺合成酶的酶活力的检测 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 重组质粒的构建 |
| 3.2 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 3.3 谷氨酰胺合成酶的酶活检测结果 |
| 4 实验讨论 |
| 第三章 谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵条件的初步优化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 实验主要的试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 培养方法 |
| 2.2 灭菌方法 |
| 2.3 发酵过程中采用的分析方法 |
| 2.4 用HPLC定性地检测L-谷氨酰胺 |
| 2.5 用谷氨酰胺测试盒检测重组菌中L-谷氨酰胺的产量 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生长曲线的测定结果和葡萄糖的消耗量的检测 |
| 3.2 L-谷氨酰胺发酵培养基的初步优化 |
| 3.3 结合HPLC和谷氨酰胺测试盒检测重组C.glutamicum发酵生产L-Gln的产量 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
四、谷氨酰胺发酵条件研究（论文参考文献）
- [1]谷氨酰胺转氨酶高效表达及热稳定性改造[D]. 杜建辉. 江南大学, 2021(01)
- [2]谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件优化[D]. 于凡. 河北农业大学, 2020(05)
- [3]基于比较转录组学和ChIP-Seq研究转录因子Dal80p在酿酒酵母氮代谢中的调控功能[D]. 胡竞进. 浙江大学, 2020(01)
- [4]谷氨酰胺转氨酶的发酵优化及活化研究[D]. 高慧. 江南大学, 2020(01)
- [5]谷氨酰胺转氨酶在酶改性中的应用[D]. 邵文铉. 北京化工大学, 2020(02)
- [6]大口黑鲈饲料中发酵豆粕替代鱼粉的效果及谷氨酰胺、丁酸梭菌提升其效价的营养策略研究[D]. 何明. 上海海洋大学, 2020(03)
- [7]α-酯酰基转移酶重组大肠杆菌生产丙谷二肽[D]. 裴绪泽. 大连理工大学, 2020(02)
- [8]DsrA-Hfq抗酸模块的进化及其提高大肠杆菌酸耐受性的研究[D]. 李嘉慧. 华南理工大学, 2020
- [9]一种微生物谷氨酰胺转胺酶的性质及应用研究[D]. 陈中山. 华东师范大学, 2019(08)
- [10]利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺[D]. 白婧. 南京师范大学, 2015(02)