一、Inducible resistance to Fas-mediated apoptosis in B cells（论文文献综述）
李文杰[1]（2021）在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中认为鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
韩笑[2]（2021）在《盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究》文中研究表明目的:2020年全球癌症数据显示,胃癌的发病率全球第五,死亡率居于全球第四,且面临严重的预后及耐药困扰。盐霉素（SAL）是一种广谱抗菌药物,亦具有抗肿瘤特性,特别是盐霉素与化疗或放疗联合使用的协同效应是一个值得探讨的问题。目前SAL如何影响耐顺铂胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡,以及如何逆转癌细胞放疗抵抗及多重耐药,其机制尚不清楚,盐霉素能否对耐顺铂胃癌细胞产生较好的增敏作用目前未见报道。基于此,本实验将盐霉素（SAL）和顺铂（DDP）作用于人胃粘膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP,确定盐霉素是否能在体外提高耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP对顺铂化疗的敏感性。同时初步探究盐霉素与顺铂联合作用的分子机制及盐霉素对耐顺铂胃癌细胞的增敏机制,从而为改善顺铂耐药和胃癌的治疗新方案的提出提供理论依据,为临床应用提供新的思路。方法:1.CCK-8法检测SAL对SGC-7901、SGC-7901/DDP细胞活力的影响,筛选SAL与DDP单药及联合应用的最佳浓度。2.CCK-8、Transwell及细胞划痕实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞增殖、侵袭、迁移的影响,CCK-8法同时检测SAL对GES-1细胞增殖的影响。3.流式细胞术检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞周期及凋亡的影响。4.免疫印迹实验及免疫组化实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9、Fas-L、NF-κBp65表达的影响,探究SAL诱导凋亡的可能机制。5.免疫印迹实验检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin与靶基因Axin2和CCND1、EMT标记蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;免疫荧光检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后β-catenin的核定位;探究SAL作用于SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的化疗增敏机制。结果:1.CCK-8法筛选出SAL-8μM与DDP-3μg/m L作用24 h为最佳作用浓度和时间。2.SAL-8μM作用于GES-1细胞24 h抑制率与对照组（0μM）比较差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组比较,SAL与DDP分别处理SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞24 h均能显着降低两种细胞的的增殖、侵袭和迁移能力,并显着增加细胞凋亡率（P<0.01）;其中在SGC-7901细胞中,与SAL组相比,DDP组、双药组均显着降低SGC-7901细胞的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着降低SGC-7901/DDP的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）。3.在SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中,DDP处理组中G0/G1期细胞比例均显着高于对照组和SAL组（P<0.01）;同时,SAL处理组中S期细胞比例均显着高于对照组和DDP组（P<0.01）。4.与对照组比较,SAL和DDP分别处理24 h后,SGC-7901和SGC-7901/DDP两种细胞中Caspase 3、Caspase 9、Bax的表达量均显着上调（P<0.01）且Bcl-2的表达量均显着下调（P<0.01）;且与单药组相比,双药联合组表达量变化量更明显（P<0.01）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着升高Caspase 3、Caspase 9、Bax表达水平（P<0.01）。5.在SGC-7901细胞中,与对照组比较,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,但是DDP组中Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达更明显,双药联合使用未见明显的协同作用;在SGC-7901/DDP细胞中,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,双药联合使用表现出协同作用。6.在SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞中,与对照组比较,SAL处理组N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1蛋白表达量均降低（P<0.01）,而E-cadherin的表达量增高（P<0.01）,β-catenin的核外移增多;与SAL组相比,SAL与Wnt-C59联合处理组两种胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）及β-catenin、Axin2和CCND1的表达量进一步下调（P<0.01）,E-cadherin的含量进一步上调（P<0.01）,β-catenin的细胞核外移进一步增多。7.与SGC-7901比较,SGC-7901/DDP耐药株SAL处理组、SAL与Wnt-C59联合处理组,N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1表达的下调和E-cadherin的上调及β-catenin的核外移程度均增强。结论:1.SAL-8μM作用24 h对人胃粘膜上皮细胞GES-1细胞的无明显抑制作用,但可以抑制胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP的增殖。2.SAL与DDP均能抑制SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡,SAL可调节并增强DDP对胃癌细胞SGC-7901及顺铂耐药细胞SGC-7901/DDP增殖、侵袭、迁移的抑制作用和诱导凋亡作用,两药联合具有协同作用;与SGC-7901不同,SAL、双药联合均比DDP对SGC-7901/DDP迁移抑制、诱导凋亡作用更强。3.DDP可致胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/DDP周期阻滞于G0/G1期,SAL可阻滞于S期,两药可分别作用于不同周期时间点发挥细胞阻滞作用。4.SAL与DDP通过Fas-L通路,上调凋亡相关因子Caspase 3、Caspase 9、Bax、Fas-L并下调Bcl-2的表达,同时抑制核内NF-κBp65的表达来调节胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP凋亡,且仅在SGC-7901/DDP中,两药具有明显协同作用。5.SAL通过下调Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin及靶蛋白Axin2和CCND1等的表达抑制EMT进程,从而抑制肿瘤细胞的侵袭迁移,增加肿瘤细胞对DDP的敏感性,逆转耐药细胞耐药抵抗。
何川[3]（2021）在《FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究》文中认为背景:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,具有较高的侵袭性和复发性[2]。新诊断的恶性胶质瘤的治疗方案主要以手术切除肿瘤为主,结合放疗、化疗等综合治疗方法[3]。替莫唑胺是临床一线化疗药物,然而由于耐药机制的建立,替莫唑胺取得的效果仍然有限[4]。越来越多的证据表明自噬在降低胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性方面起着重要的作用[9]。自噬是一种进化上高度保守的分解代谢过程。细胞通过将非必须的细胞组分或功能障碍的细胞器通过溶酶体降解来提供营养或能量,以维持细胞的稳态[6]。抑制自噬是提高胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的有效手段[9-12]。但是自噬导致胶质瘤细胞对替莫唑胺抗性的具体机制尚不清楚。通过自噬清除受损线粒体的过程被称为线粒体自噬[13]。细胞通过线粒体自噬的方式清除受损的线粒体,可以抑制细胞内ROS的积累,阻断线粒体中促凋亡蛋白如AIF、细胞色素C的释放[14]。尽管自噬赋予了胶质瘤细胞对替莫唑胺的抗性[9,12],但尚不清楚自噬的保护作用是否与清除受损线粒体相关。Bcl-2/腺病毒E1B 19-k Da相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-ineracting protein 3,BNIP3）是一种自噬受体,负责介导受损线粒体通过自噬途径清除[13]。然而,替莫唑胺是否能引发线粒体自噬尚不明确。叉头盒转录因子3a（forkhead box transcription factor 3a,FOXO3a）是FOX蛋白家族成员。FOXO3a调控多种细胞功能如增殖、分化、侵袭转移和细胞死亡[15]。自噬的激活和BNIP3的上调均由FOXO3a调控[16-18],但是FOXO3a是否参与了BNIP3介导的线粒体自噬仍不清楚。因此,我们研究了FOXO3a在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用,以及它与BNIP3介导的线粒体自噬之间的关系。目的:用人类及大鼠胶质瘤细胞系以及裸鼠移植瘤模型来研究FOXO3a和BNIP3在替莫唑胺诱导胶质瘤细胞死亡中的作用及机制。方法:1.MTT法检测胶质瘤细胞生存率。2.LDH释放法检测胶质瘤细胞死亡率。3.si RNA转染研究相关蛋白在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用。4.免疫荧光技术检测相关蛋白在细胞内定位的变化。5.DCFH-DA荧光探针检测胶质瘤细胞内ROS水平变化。6.Mito SOX荧光探针检测胶质瘤细胞内线粒体超氧化物水平的变化。7.JC-1荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体膜电位的变化。8.Mito Tracker荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体形态和数量的变化。9.蛋白质印迹技术检测胶质瘤细胞和组织内蛋白表达的变化。、10.中性单细胞凝胶电泳检测胶质瘤细胞DNA双链断裂。11.构建Stub RFP-Sens GFP-LC3B慢病毒转染的U87细胞,研究替莫唑胺对胶质瘤细胞自噬的作用。12.C6裸鼠移植瘤模型研究替莫唑胺对体内胶质瘤细胞的作用。结果:1.替莫唑胺以浓度依赖的方式抑制胶质瘤细胞的体外增殖,并能抑制体内胶质瘤的生长。2.替莫唑胺引起胶质瘤细胞的DNA双链断裂,AIF核转位和线粒体膜电位降低。3.替莫唑胺引起胶质瘤细胞内ROS升高,通过GSH抑制ROS的升高能够抑制替莫唑胺引起的DNA双链断裂。替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体超氧化物积累,通过Mn TBAP抑制线粒体超氧化物的积累可以抑制胶质瘤细胞内ROS升高,并抑制DNA双链断裂。4.替莫唑胺激活胶质瘤细胞自噬。通过3MA、bafilomycin A1或ATG5 si RNA抑制自噬能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、细胞内ROS升高,增强替莫唑胺的杀伤作用。5.替莫唑胺激活BNIP3介导的线粒体自噬。通过si RNA敲低BNIP3的表达能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、ROS升高,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。6.通过si RNA敲低FOXO3a的表达,能够抑制BNIP3和LC3B的上调,从而抑制替莫唑胺引起的保护性线粒体自噬,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。结论:1.替莫唑胺通过诱发氧化应激损伤线粒体,引起AIF释放和核转位、ROS升高,进而导致DNA双链断裂和胶质瘤细胞死亡。2.BNIP3介导的线粒体自噬通过清除受损的线粒体,抑制AIF的释放和ROS的升高,保护胶质瘤细胞免受替莫唑胺的杀伤。3.抑制FOXO3a调控的线粒体自噬,能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。
杨娟[4]（2021）在《Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究》文中提出弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）在成人初治非霍金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）中占比最高,具有高度侵袭性和异质性。近几十年来,随着以抗CD20的利妥昔单抗（Rituximab）为代表的新型靶向治疗药物的应用,DLBCL患者的疗效得到了明显改善,然而仍有约30%——40%的DLBCL患者出现初始治疗耐药或完全缓解后早期复发,最终因疾病进展而难以获得长期生存。基于此,亟待临床医生及科研人员探究DLBCL发生发展相关的生物分子异常表达及信号通路异常传导,精准诊疗,进而有效改善患者预后。Sirtuin6（Sirt6）衍生自哺乳动物Sirtuins（Sirts）家族,是高度保守的ADP-核糖基化酶和NAD+依赖性脱酰基酶,涉及广泛的细胞学过程,例如调控衰老,DNA修复,葡萄糖代谢,以及转录调节等。Sirt6作为细胞途径检查点控制器,负责细胞增殖和存活的调节,因而它的异常表达与多种癌症相关。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中,Sirt6敲除导致与癌基因激活无关的肿瘤发生,这表明它可能起抑癌作用。临床样品分析显示,Sirt6在包括直肠癌在内的几种恶性肿瘤中下调,主要通过抑制厌氧糖酵解和共抑制MYC来抑制癌症的发生发展。然而,与之相反的是,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性,敲除Sirt6基因可导致DNA损伤水平增加和对化疗药物的敏感性增强。在血液系统疾病中,Michele Cea.等人报道Sirt6在多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）细胞中高表达,并且与对DNA损伤剂的抗性密切相关,这一作用归因于MAPK/ERK2/p90RSK信号传导抑制。Cagnetta等人报道了急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞中Sirt6 mRNA表达上调相关的生物学相关性,基因组不稳定性和不良预后。在人类AML的体外和鼠异种移植模型中,Sirt6表达的下调会促进基因组不稳定性,增加药物敏感性。如上所述,Sirt6在癌症中发挥双刃剑的作用,是肿瘤治疗的潜在靶点。精准治疗时代,小分子靶向药已取得良好的临床获益,其应用在癌症治疗中愈显重要。OSS＿128167是靶向Sirt6的新型特异性抑制剂,对Sirt6,Sirtl和Sirt2的IC50值分别为89、1578和751μM。它能够渗透细胞膜,在培养的细胞中具有生物学活性,增加H3K9的乙酰化和GLUT-1的表达。鉴于其研发不久,针对它的研究仍处于早期阶段。Michele Cea.等人的研究提示OSS＿128167能够使原代MM细胞以及对阿霉素和美法仑耐药的MM细胞系敏感,增加对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。然而,Sirt6在DLBCL中的作用及其分子机制目前仍不甚清楚,OSS＿128167在DLBCL是否具有调控作用和治疗潜力也有待探究。本研究旨在探讨Sirt6在DLBCL中的表达模式,功能机制和潜在的临床相关性,并进一步研究其靶向小分子抑制剂OSS＿128167在DLBCL中的调控作用,寻找DLBCL诊断治疗的新靶点。第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义目的:弥漫大B细胞淋巴瘤是临床,病理和分子异质性疾病,目前已相应开发出各种临床、病理及分子标志物来表征该疾病。DLBCL患者的治疗是一个活跃的研究领域,使用标准一线治疗的5年总生存率约为60-70%。多达三分之一的DLBCL患者最终对R-CHOP方案产生耐药性,而其余的治疗选择受到限制。针对特定分子发现的精准医疗,靶向药物的发明和免疫疗法为改善DLBCL的治疗打开了新大门。Sirt6的酶促活性多样,可以调节葡萄糖/脂质代谢,DNA修复,转录调控和端粒维护等生物学过程。Sirt6充当细胞途径检查点控制器,并负责细胞增殖和存活的调节。它的异常表达与多种疾病密切相关,如糖尿病、心脏病以及癌症等。在MEF中,Sirt6敲除导致肿瘤发生,而与癌基因的激活无关,这表明该分子可能起抑癌作用。临床样品分析也显示,Sirt6在几种恶性肿瘤（如直肠癌）中下调。相反,据报道,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性。敲除Sirt6导致DNA损伤水平增加,且对化学疗法的敏感性增强。Sirt6在MM细胞中高表达,并且与对DNA破坏剂的抗性密切相关。目前尚无Sirt6在DLBCL中的表达水平和生物学功能的文献报道,因此本部分主要探讨Sirt6在DLBCL中的表达水平,生物学功能和临床意义。材料与方法:1.使用GEO数据分析Sirt6在DLBCL中的表达情况及预后意义;2.DLBCL/反应性淋巴结炎（reactive hyperplasia lymphoid,RHL）病例选择及标本收集;3.免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）;4.DLBCL细胞培养;5.PBMCs（peripheral blood mononuclear cells,外周血单个核细胞）提取;6.实时荧光定量 PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）;7.蛋白质免疫印迹分析（Western Blot,WB）;8.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减及过表达;9.RNA 测序（RNA-sequencing,RNA-seq）检测 shSirt6 与 shControl 组的差异表达基因;10.Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测细胞增殖;11.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;12.PI检测细胞周期;13.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测Sirt6对DLBCL生长的影响;14.统计学分析。结果:1.在GEO数据库中分析Sirt6在DLBCL患者和正常对照中的表达水平,发现Sirt6在DLBCL中的表达水平显着上调（p<0.001）。qPCR和WB结果表明,在DLBCL细胞系（LY1,LY8,LY3,Val）中,Sirt6的mRNA和蛋白水平均高于健康对照细胞。免疫组化染色显示,DLBCL中Sirt6表达显着高于对照组,且Sirt6蛋白表达水平与DLBCL患者的年龄（p=0.009）,Ann Arbor分期（p=0.036）和国际预后指标（IPI,p=0.045）得分呈正相关。2.GEO数据集GSE32918的Kaplan-Meier生存曲线分析表明,DLBCL中Sirt6表达较高患者的总生存时间（Overall survival,OS）相对较短（p=0.0023）。基于免疫组化结果的生存分析亦表明,Sirt6染色阳性的DLBCL患者较染色阴性的DLBCL患者OS缩短（p=0.039）。3.采用 GeneChem 公司构建的 Sirt6 敲减慢病毒（shSirt6#1,shSirt6#2,shSirt6#3）,Sirt6过表达慢病毒（lvSirt6）以及阴性对照慢病毒（shControl）转染DLBCL细胞（LY1,LY8,Val）。3种敲减慢病毒介导的RNA干扰载体在人DLBCL细胞中均显示出敲低作用,其中shSirt6#1敲减效率最高。转染lvSirt6的细胞显示出明显升高的Sirt6表达。与带有空载体的细胞相比,shSirt6组的DLBCL细胞表现出明显的生长抑制作用（p<0.01）,而lvSirt6对细胞的增殖能力没有影响（p>0.05）。在体内实验中,接种稳定转染shSirt6组的小鼠与shControl组相比,皮下肿瘤生长受到明显抑制（p<0.01）,且伴有Sirt6低表达的小鼠DLBCL组织显示出较低的Ki-67阳性率。提示Sirt6对DLBCL细胞增殖发挥了正调控的作用。4.RNA测序分析显示,Sirt6似乎与细胞凋亡、周期,DNA损伤修复（DNA damage response,DDR）密切相关。Annexin V-PE/7AAD 细胞凋亡试验表明,shSirt6促进DLBCL细胞的凋亡。相反,Sirt6过表达抑制细胞凋亡。此外,Sirt6敲减可促进cleaved-PARP的表达增加。PI染色检测细胞周期,结果表明与转染shControl的细胞相比,Sirt6敲减后发生G2/M期细胞阻滞,p27和CDK2的蛋白表达也随之变化。提示Sirt6可以通过加速细胞周期的G2/M期并降低细胞凋亡率来促进DLBCL细胞存活。5.通过细胞毒性试验研究了 Sirt6在对阿霉素和苯达莫司汀的药物反应中的作用。将shSirt6细胞和对照细胞暴露于预定浓度的阿霉素或苯达莫西汀48小时检测细胞增殖,发现联合shSirt6后DLBCL细胞增殖明显减少（p<0.05）。ATM-Chk2和ATR-Chkl信号级联反应调节DDR和细胞周期检查点,我们的蛋白质印迹实验表明,转染shSirt6的细胞中,磷酸化的ATR和磷酸化的Chk1的表达降低,这可能揭示了 Sirt6敲减可以使DLBCL细胞对化疗药物敏感的机制。这些结果与我们RNA测序分析的结果也是一致的。结论:1.Sirt6在DLBCL病理组织中及细胞系中表达水平显着增高,且Sirt6蛋白表达增高与DLBCL患者的疾病进展及较短的OS相关。2.Sirt6促进DLBCL的增殖;3.Sirt6抑制DLBCL的细胞凋亡,促进细胞周期G2/M期进展;4.Sirt6抑制可增强DLBCL对化疗药物的敏感性。第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用目的:近年来,小分子靶向治疗在癌症治疗,包括恶性血液系统疾病的治疗中已取得良好的临床获益。OSS＿128167是一种Sirt6特异性小分子抑制剂,可渗透细胞膜并在培养的细胞中具有生物活性,能够增加H3K9乙酰化和GLUT-1表达。哈佛大学研究团队发现,OSS＿128167能够增加MM细胞对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。但是,目前针对Sirt6及其抑制剂OSS＿128167的研究仍处于早期阶段,因此我们旨在探究Sirt6抑制剂在DLBCL中是否具有调控作用和治疗潜力。材料与方法:1.DLBCL原代细胞及细胞系培养;2.CCK-8实验检测细胞增殖和药物增敏;3.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;4.PI检测细胞周期;5.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测OSS＿128167对DLBCL生长的影响;6.免疫组织化学染色;7.统计学分析。结果:1.不同浓度的OSS＿128167作用于原代DLBLC细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）24-72小时,与对照组相比,OSS＿128167降低了原代DLBCL细胞的细胞活力,在DLBCL细胞系中,细胞增殖亦出现明显抑制,且抑制显示出时间和剂量依赖性。2.与80μM OSS＿128167孵育48小时后,与对照组相比,原代DLBCL细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）中早期凋亡的细胞数显着升高。3.逐渐增加的OSS＿128167浓度也影响DLBCL细胞的细胞周期进程。随着OSS＿128167浓度逐渐增高,G2/M期细胞计数也逐渐升高。这与先前研究中Sirt6抑制后引起G2/M期细胞阻滞一致。4.在SCID小鼠的异种移植模型中,用OSS＿128167处理的小鼠肿瘤与PBS处理组相比,生长受到明显抑制,且小鼠皮下肿瘤组织中Sirt6、Ki-67表达水平降低。结论:OSS＿128167在DLBCL细胞中抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导周期阻滞。说明OSS＿128167在DLBCL中发挥抗淋巴瘤作用,有望成为DLBCL新的靶向治疗药物。第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长目的:我们通过前期实验发现Sirt6在DLBCL中表达水平增高,与预后相关,且可参与调节DLBCL细胞的多种生物学功能,如细胞增殖、凋亡、细胞周期、DNA损伤修复等,而Sirt6调节DLBCL细胞的机制尚不清楚。本研究旨在探讨Sirt6对DLBCL细胞调控的作用机制,为寻找DLBCL的新的治疗靶点提供理论依据。材料与方法:1.细胞培养;2.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减;3.RNA 测序的差异基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）;4.蛋白提取和Western Blot;5.CCK-8法检测细胞增殖;6.DLBCL异种移植小鼠模型建立,小鼠肿瘤组织提蛋白WB;7.统计学分析。结果:1.筛选稳定低表达Sirt6的细胞以及对照细胞行RNA测序,使用GSEA探索了Sirt6调控的潜在机制,发现Sirt6在PI3K/Akt和FOXO信号传导途径中功能丰富。WB提示,与对照细胞相比,在shSirt6细胞中PI3Kpll0α及其下游靶分子Akt（Ser473）和mTOR蛋白的活化水平显着降低,PTEN、p-4EBP1和FoxO1蛋白的表达水平增加。2.在DLBCL细胞的异种移植小鼠肿瘤组织中,shSir6组与shControl组相比,Sirt6表达降低,并且PI3Kp110α、Akt、mTOR磷酸化水平降低,PTEN表达增高,与体外实验相一致。3.使用PI3K信号激活剂胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）来进一步研究Sirt6修饰DLBCL细胞中PI3K信号的能力。与shControl相比,未接受IGF-1处理的shSirt6细胞显示出较低的LY1和LY8细胞增殖,接受IGF-1处理的细胞的增殖能力有部分恢复。IGF-1处理shSirt6细胞后,部分逆转了 PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表达的降低。结论:Sirt6可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来促进DLBCL细胞的生长,从而促进DLBCL的发生发展。这些发现为Sirt6在DLBCL中的致癌活性提供了机制方面的见解,并为DLBCL的预后评估及靶向治疗提供了新的实验基础和理论依据。
陈媛媛[5]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中研究表明一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
王思毓[6]（2021）在《蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及机制研究》文中认为[目 的]1.探讨蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用。2.探讨蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用机制。3.探索结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内的生物学行为差别。[方 法]1.将结直肠癌放化疗抵抗细胞HCT116CRR和HT29CRR分4组处理:a.对照组;b.蒿甲醚组;c.放化疗组;d.蒿甲醚联合放化疗组。2.CCK8和克隆形成实验测各组的细胞活性和克隆形成能力。3.流式检测各组的细胞凋亡和细胞周期阻滞情况。4.Western Bolt检测各组EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail;凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2;Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin和下游靶标c-Myc,cyclinD1的表达情况。5.裸鼠右侧背部皮下注射HCT116CRR/HT29CRR细胞构建皮下移植瘤模型,待移植瘤体积长至100mm3左右,将裸鼠随机分4组处理:a.对照组;b.蒿甲醚组;c.放化疗组;d.蒿甲醚联合放化疗组。6.分组处理后每3天测量裸鼠体重,瘤体积,绘制体重、瘤体积增长曲线。治疗结束后（21天后）,脱颈处死裸鼠,取出肿瘤组织,称瘤重,计算各组抑瘤率。7.流式检测各组肿瘤组织的凋亡情况。8.Western Bolt和免疫组化检测各组肿瘤组织EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail;凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2;Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin和下游靶标c-Myc,cyclinD1的表达情况。9.经裸鼠脾脏注射荧光素酶luciferase标记的结直肠癌亲本HCT116-Luc和放化疗抵抗HCT116CRR-Luc细胞构建结直肠癌肝转移模型,观测记录裸鼠饮食、体重变化,小动物活体成像观察发光强度,比较结直肠癌放化疗抵抗细胞和亲本细胞的肝转移情况。10.经裸鼠尾静脉注射荧光素酶luciferase标记的结直肠癌亲本HCT116-Luc和放化疗抵抗HCT1 16CRR-Luc细胞构建结直肠癌肺转移模型。观测记录裸鼠饮食、体重变化,小动物活体成像观察发光强度,比较结直肠癌放化疗抵抗细胞和亲本细胞的肺转移情况,处死裸鼠后计数肺转移结节数。[结 果]1.蒿甲醚体外逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及作用机制。（1）CCK8和克隆形成结果显示,蒿甲醚能抑制结直肠癌放化疗抵抗细胞增殖,蒿甲醚与放化疗联合,能明显增强放化疗对抗性细胞的增殖抑制（/P<0.05）。（2）流式检测细胞凋亡,HCT116CRR细胞各组凋亡率分别为:对照组（1.97±0.06）%,蒿甲醚组（6.39±0.26）%,放化疗组（8.56±0.38）%,蒿甲醚+放化疗组（22.93±1.20）%;HT29CRR细胞各组的凋亡率分别为:对照组（1.92±0.09）%,蒿甲醚组（5.75±0.10）%,放化疗组（8.21±0.22）%,蒿甲醚+放化疗组（16.39±0.71）%。相较对照组,蒿甲醚组,放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组均增加了HCT116CRR和HT29CRR细胞的凋亡率,其中蒿甲醚联合放化疗组的凋亡率最高（P<0.05）。（3）流式检测细胞周期,HCT116CRR细胞各组G2/M期的比例分别为:对照组（17.41±2.53）%;蒿甲醚组（6.53±2.61）%;放化疗组（31.09±3.50）%;蒿甲醚+放化疗组（9.71±2.34）%。HT29CRR细胞各组G2/M期的比例分别为:对照组（17.68±1.47）%;蒿甲醚组（9.35±0.78）%;放化疗组（27.88±1.93）%;蒿甲醚+放化疗组（27.88±1.93）%。对照组和放化疗组的细胞表现出较高的G2/M期阻滞,蒿甲醚组较对照组,蒿甲醚联合放化疗组较放化疗组使细胞G2/M期比例下降,逆转了 G2/M期阻滞（p<0.05）。（4）Western Bolt检测各组EMT相关蛋白结果显示,相比对照组,放化疗组间质相关蛋白N-cadherin,Vimentin和Snail表达升高;蒿甲醚组和蒿甲醚联合放化疗组上皮标志物E-cadherin表达升高,间质相关蛋白N-cadherin,Vimentin和Snail表达降低（P＜0.05）。（5）Western Bolt检测凋亡相关蛋白结果显示,相比对照组,蒿甲醚组,单纯放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组的促凋亡蛋白Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,其中蒿甲醚联合放化疗组的作用最明显（P＜0.05）。（6）Western Bolt检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白结果显示,相比对照组,蒿甲醚组显着降低β-catenin,c-Myc和cycliD1的表达（P<0.05）;相比放化疗组,蒿甲醚联合放化疗组同样显着抑制β-catenin,c-Myc和cyclinD1的表达（P<0.05）。2.蒿甲醚体内逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及作用机制。（1）治疗期间各组裸鼠体重无明显差异。HCT116CRR细胞移植瘤中,各组抑瘤率分别为:蒿甲醚组:29.82%,放化疗组:52.73%,蒿甲醚联合放化疗组:76.73%;HT29CRR细胞移植瘤中,各组抑瘤率分别为:蒿甲醚组:29.92%,放化疗组:47.94%,蒿甲醚联合放化疗组:66.72%。（2）流式检测各组肿瘤组织凋亡结果与体外一致,相比于对照组,蒿甲醚组,放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组均增加了肿瘤组织的凋亡率,其中蒿甲醚联合放化疗组的凋亡率最高（P<0.05）。（3）Western Bolt和免疫组化检测各组肿瘤组织EMT、凋亡、Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达结果与体外一致。蒿甲醚能促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin,Vimentin和Snail表达,抑制EMT;促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,促进凋亡;抑制β-catenin,c-Myc和cycliD1的表达,失活Wnt/β-catenin通路（P<0.05）。3.两组细胞肝转移灶的发光强度分别为:HCT116-Luc（1.97±0.68）×108p/s/sr,HCT116CRR-Luc（4.17±1.11）×108 p/s/sr,（P<0.05）,肺转移灶发光强度分别为:HCT116-Luc（1.85±0.29）×108 p/s/sr,HCT116CRR-Luc（2.63±0.33）×108 p/s/sr,（P<0.05）。表明结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内表现出更强的肝、肺转移能力,恶性程度更高。[结 论]1.蒿甲醚能抑制增殖,促进凋亡,逆转G2/M期阻滞,抑制EMT,逆转结直肠癌放化疗抗性。2.蒿甲醚逆转放化疗抗性的作用可能是通过失活Wnt/β-catenin信号通路实现。3.结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内具有更强肝转移、肺转移能力。
陶攀峰[7]（2021）在《RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究》文中指出自身炎症性疾病是指在没有高滴度自身抗体或抗原特异性T细胞参与的情况下,机体发生非诱发炎症的一类遗传疾病,例如家族性地中海热,主要临床表现包括周期性发热、皮疹、CRP升高、淋巴结肿大、肝脾肿大、关节炎、炎症性肠病、血管炎、结节性多动脉炎、基底节钙化或肺间质病等多种形式的系统性炎症。发现新致病基因并深入研究致病机制对患者的精准治疗和研究基因的生理功能都有重要意义。RIPK1在死亡受体或模式识别受体介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路的激活与转换中发挥着关键作用。肿瘤坏死因子TNF与受体TNFR1结合后,招募接头蛋白TRADD和RIPK1等形成复合体I,介导NF-κB通路的级联激活,起始促炎基因和促细胞存活基因的转录。在此过程中,RIPK1起着重要的支架作用,激酶活性受到泛素化和磷酸化修饰的限制。去泛素化或去磷酸化可以激活RIPK1,促进与FADD和caspase-8等蛋白组成复合物IIa,启动RIPK1依赖的细胞凋亡。若caspase-8酶活被抑制,激活的RIPK1会招募RIPK3和MLKL形成复合体IIb导致程序性坏死、细胞内容物泄露和炎症的发生。在小鼠模型中,Fadd敲除导致过度的细胞坏死和小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk1可以挽救。Casp8敲除同样导致小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk3或者Mlkl可以挽救。这提示FADD-caspase-8的激活可以抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的程序性坏死来保证小鼠胚胎发育,但具体的分子机制及在人类疾病中的生理意义尚不清楚。RIPK1第324位天冬氨酸是潜在的被caspase-8切割的位点,我们从未诊断的自身炎症性疾病病例中发现两个患病家系,分别携带新发的RIPK1杂合变异p.Asp324Val和p.Asp324His,患者主要表现出周期性发热和淋巴结肿大等症状。患者血清中炎症细胞因子和趋化因子水平升高,外周血单个核细胞（PBMCs）中炎症信号通路相关基因的转录水平升高。在机制的研究中,RIPK1切割位点变异促进了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中TNF诱导的RIPK1激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和促炎细胞因子IL-6的产生。同样的,切割位点变异也促进了患者PBMCs中TNF诱导的细胞凋亡、程序性坏死和IL-6转录水平的升高,且都依赖于RIPK1的激酶活性。与PBMCs相反,患者的成纤维细胞（Fibroblasts）中RIPK1、TNFR1等蛋白的表达水平和胞内活性氧水平降低,表现出对TNF诱导的细胞坏死和对erastin和RSL3诱导的铁死亡的抵抗。基于RIPK1切割位点变异能引起细胞因子IL-6的显着变化,我们建议患者用IL-6受体抑制剂进行治疗,取得了很好的疗效。综上所述,我们发现caspase-8在RIPK1 D324位点的切割负调控了RIPK1的激活及其介导的细胞程序性死亡,而切割位点的变异导致患者PBMCs中RIPK1的过度激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路激活水平的升高,最终导致了患者表现出反复发热和淋巴结肿大等症状。而患者fibroblasts发展出了多种补偿机制,使其可以抵抗不同的死亡刺激,这也可能使患者没有皮肤受累或病变。
张慧[8]（2020）在《下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展》文中研究说明背景能量代谢重编是肿瘤重要特点,脂肪酸代谢异常是其中之一。近年多项研究表明,肿瘤普遍存在脂肪酶过度表达的状况,众多研究拟探索脂肪酶抑制剂作为癌症潜在治疗方法。本研究旨探索乙酰辅酶A羧化酶A（Acetyl-CoA Carboxylase-A,ACACA）基因对前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）细胞及线粒体功能,代谢产物和动物体内肿瘤形成影响。方法免疫组织化学检测ACACA在人前列腺癌组织芯片中的表达,评估不同临床分期病理分级中的情况。公共数据库GEPIA分析ACACA在人前列腺癌及非癌中的表达。细胞功能实验检测前列腺癌低表达ACACA细胞系功能及代谢组学变化。WB检测脂肪酸及酯类代谢途径相关蛋白表达。海马实验检测细胞系线粒体潜能及能量产生变化。流式细胞术和荧光显微镜检测线粒体染色情况。qRT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）。流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）水平。动物体内探讨ACACA对裸鼠肿瘤形成影响。结果1、ACACA在前列腺癌组织中高表达,临床TNM分期显示晚期PCa患者ACACA表达水平强于低级别患者。T3强于T2、T1,N1强于N0,M1强于M0,均有统计学差异。GEPIA统计显示前列腺癌患者中ACACA表达明显高于健康者。2、细胞功能实验显示,与对照组相比敲低ACACA基因后,DU145细胞和PC3细胞迁移能力,侵袭能力,增殖能力明显减弱,细胞周期G1期延长。均有统计学意义。3、代谢组学检测显示,敲低ACACA基因后,DU145细胞中有94种代谢物质发生改变,PC3细胞中105种物质发生改变,两种细胞中39种物质同时发生改变。ATP水平在两种细胞中均降低。PC3细胞中敲低ACACA基因后,脂肪酸代谢产物L-棕榈酰肉碱和硬脂肉碱水平减少,相关途径蛋白（FAS,Lipin1,ATP-CL,P-ATP-CL,AceCS1,ACSL1）水平下调。均有统计学意义。4、海马实验显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中ATP产量,基础呼吸,最大呼吸,储存呼吸能力均下降。实时ATP检测中发现,DU145细胞总ATP产生率下降,线粒体ATP产生率显着下降。5、线粒体荧光染色显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞线粒体染色及平均荧光强度均减弱。DU145和PC3细胞mtDNA均明显降低。且均有统计学差异。6、NAD+/NADH检测发现,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中该比值均上升,且细胞内ROS水平均高于对照组,均有统计学差异。7、裸鼠成瘤模型中,实验组肿瘤在各个时间点体积明显小于对照组,肿瘤重量也明显小于对照组,均有统计学差异。结论:ACACA基因的高表达与前列腺癌的TNM分期呈正相关。结果证实,前列腺癌细胞中ACACA的下调通过干扰NAD+/NADH,线粒体ATP产量,mtDNA和ROS水平的平衡而影响线粒体潜力,从而降低了肿瘤细胞的增殖能力。测试线粒体潜力和ACACA的表达可能会在将来成为预测目标和治疗方法。
黄莉[9]（2020）在《PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估》文中研究表明结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率占所有恶性肿瘤第三位,死亡率位于第五位,给人类的健康带来了巨大的威胁。结肠癌的病因不明确,发病机制十分复杂,早期基本无症状。手术是治疗结肠癌的主要方法,早期患者可以通过手术达到根治的效果,而中晚期患者通过手术很难根治,手术后容易转移或者复发。而针对不能进行手术的患者,以化疗为基础的综合治疗模式可以有效改善患者生存。异硫氰酸苯乙酯（PEITC）是十字花科植物的硫代葡萄糖苷降解产物,被报道可以降低肿瘤的发生率,抑制肿瘤细胞的增殖和生长,且对正常组织细胞无任何毒副作用。目前研究认为诱导细胞凋亡是PEITC可以抑制癌细胞增殖的重要机制,而理解PEITC诱导的细胞凋亡机制对于了解其作为临床上有用的化学预防或治疗剂是必不可少的。我们前期发现PEITC抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,并且对正常肠的上皮细胞无影响,但其机制尚不清楚。因此,本论文将深入研究PEITC诱导细胞凋亡的途径及其分子机制,并通过裸鼠成瘤模型验证PEITC对结肠癌肿瘤的抑制效果和作用机制,最后对PEITC的安全性进行评价。我们选用了 2种不同的结肠癌细胞系（HCT116和SW620）及正常肠上皮细胞（NCM460）,用不同浓度的PEITC进行处理,通过MTT法、流式细胞仪、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验,发现20 μM PEITC的PEITC可以显着性抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进结肠癌细胞凋亡,而对正常肠上皮细胞无影响。我们进一步通过western blot实验发现PEITC促进Caspase-3和Caspase-9的表达,通过JC-1和DCFH-DA方法发现PEITC抑制线粒体内膜膜电势并促进ROS产生,提示通过线粒体途径诱导细胞凋亡。我们分离细胞质组分后通过western blot检测Cyto-c和SMAC的表达,发现PEITC促进结肠癌细胞SMAC的表达,流式细胞仪结果进一步表明PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡。通过anti-SMAC进行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）实验发现PEITC作用后可促进SMAC与Survivin的相互作用,发挥诱导细胞凋亡作用。PEITC通过ERK和JNK蛋白的磷酸化促进凋亡相关蛋白表达及增加细胞凋亡比例,表明PEITC通过ERK/JNK通路介导结肠癌细胞凋亡。利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性,通过皮下接种法建立裸鼠成瘤模型,发现PEITC抑制结肠癌皮下移植肿瘤的生长,并促进裸鼠结肠癌皮下肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC蛋白表达,抑制Survivin蛋白表达,对裸鼠血常规三系细胞和肝肾功能均无影响。我们研究表明PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控线粒体途径诱导的结肠癌细胞凋亡。体内实验证明PEITC抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长,并通过SMAC/Survivin信号介导线粒体途径的凋亡,而不影响裸鼠肝肾功能、血常规三系细胞。本论文将为结肠癌的临床治疗提供新的理论基础和新的方向。
李美蓉[10]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究表明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
二、Inducible resistance to Fas-mediated apoptosis in B cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Inducible resistance to Fas-mediated apoptosis in B cells（论文提纲范文）
（1）鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凋亡素 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3 癌症干细胞研究进展 |
| 1.3.1 癌症干细胞的概念 |
| 1.3.2 CSCs的鉴定 |
| 1.3.3 CSCs的特征 |
| 1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
| 1.3.5 CSCs与癌症转移 |
| 1.3.6 CSC与临床治疗 |
| 1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
| 第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂和材料 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
| 2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
| 2.2.3 细胞克隆形成能力 |
| 2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
| 2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
| 2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
| 2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
| 2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
| 2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
| 3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
| 3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株和动物 |
| 4.1.2 试剂和材料 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
| 4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
| 4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株和动物 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文对照缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要溶液的配制 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 细胞来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 SGC-7901、GES-1 细胞培养 |
| 2.2 人胃癌顺铂耐药株SGC-7901/DDP细胞培养 |
| 2.3 细胞的冻存 |
| 2.4 CCK-8 实验 |
| 2.5 细胞周期实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 细胞侵袭实验 |
| 2.8 细胞划痕实验 |
| 2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.10 免疫组化实验 |
| 2.11 免疫荧光实验 |
| 2.12 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 1.SGC-7901/DDP耐药株的耐药鉴定 |
| 2.CCK-8 法进行SAL作用浓度及时间点筛选 |
| 3.SAL及 DDP对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响 |
| 4.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 5.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞周期的影响 |
| 6.SAL及 DDP诱导胃癌细胞凋亡的机制研究 |
| 7. SAL 对胃癌细胞 Wnt/ β-catenin 通路效应物及 EMT 标记物表达的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3 后续研究工作及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 盐霉素的生物作用综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（3）FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 胶质瘤的治疗概述 |
| 2.2 程序性细胞死亡 |
| 2.2.1 凋亡 |
| 2.2.2 自噬依赖性细胞死亡 |
| 2.2.3 程序性坏死 |
| 2.2.4 铁死亡 |
| 2.3 自噬 |
| 2.3.1 自噬的分类 |
| 2.3.2 自噬的机制 |
| 2.3.3 自噬的调控 |
| 2.3.4 自噬在胶质瘤及其治疗中的作用 |
| 2.3.5 替莫唑胺与自噬 |
| 2.4 线粒体的质量控制 |
| 2.4.1 线粒体的结构和功能 |
| 2.4.2 线粒体动力学 |
| 2.4.3 线粒体自噬 |
| 2.4.4 BNIP3与线粒体自噬 |
| 2.5 ROS与细胞抗氧化机制 |
| 2.5.1 ROS的产生和作用 |
| 2.5.2 ROS的调控 |
| 2.5.3 ROS与肿瘤 |
| 2.6 内质网应激和未折叠蛋白质反应 |
| 2.7 替莫唑胺的作用及耐药机制 |
| 2.7.1 替莫唑胺的作用机制 |
| 2.7.2 染色质溶解 |
| 2.7.3 MGMT |
| 2.8 替莫唑胺的其他相关耐药机制 |
| 2.8.1 ABC转运蛋白 |
| 2.8.2 NF-κB信号通路 |
| 2.8.3 JAK-STAT信号通路 |
| 2.9 总结 |
| 第3章 资料与方法 |
| 3.1 主要器材与试剂 |
| 3.1.1 主要实验器材 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 细胞系及细胞培养、裸鼠饲养 |
| 3.3 实验液体及配制方法 |
| 3.4 细胞复苏、传代及冻存 |
| 3.5 实验技术 |
| 3.5.1 MTT法检测细胞生存率 |
| 3.5.2 RNA干扰技术 |
| 3.5.3 乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测细胞的死亡率 |
| 3.5.4 中性单细胞凝胶电泳电泳检测DNA双链断裂 |
| 3.5.5 JC-1 探针检测细胞内线粒体膜电位的变化 |
| 3.5.6 Mito SOX检测线粒体内超氧化物的变化 |
| 3.5.7 DCFH-DA探针检测细胞内ROS的变化 |
| 3.5.8 构建荧光蛋白标记的LC3B的U87细胞系 |
| 3.5.9 线粒体荧光探针检测细胞内线粒体的形态和数量变化 |
| 3.5.10 裸鼠皮下移植胶质瘤模型 |
| 3.5.11 蛋白质印迹技术检测细胞胞浆、胞核、线粒体蛋白的变化 |
| 3.5.11.1 蛋白样品准备 |
| 3.5.11.2 蛋白质印迹 |
| 3.5.11.3 实验分组 |
| 3.5.12 免疫共沉淀法检测胶质瘤细胞及肿瘤组织中LC3BⅡ、BNIP与相关蛋白的相互作用 |
| 3.5.13 激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内目标蛋白的表达和定位变化 |
| 3.5.14 裸鼠肿瘤组织内过氧化氢含量的测定 |
| 3.5.15 透射电镜观察线粒体自噬 |
| 3.5.16 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 替莫唑胺在体外抑制胶质瘤细胞增殖 |
| 4.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂和线粒体损伤 |
| 4.2.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂 |
| 4.2.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞AIF核转位 |
| 4.2.3 替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体损伤 |
| 4.3 损伤的线粒体通过上调ROS增强替莫唑胺引起的DNA双链断裂 |
| 4.3.1 替莫唑胺通过升高胶质瘤细胞内ROS引发DNA双链断裂 |
| 4.3.2 替莫唑胺通过损伤线粒体引起细胞内ROS升高 |
| 4.4 自噬抑制替莫唑胺引起的氧化应激 |
| 4.4.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞自噬 |
| 4.4.2 自噬抑制替莫唑胺引起的胶质瘤细胞死亡 |
| 4.4.3 自噬抑制替莫唑胺引起的AIF核转位和ROS升高 |
| 4.5 替莫唑胺激活胶质瘤细胞线粒体自噬 |
| 4.6 BNIP3 介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.1 替莫唑胺上调BNIP3的表达,并促进BNIP3向线粒体转位 |
| 4.6.2 BNIP3介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.3 BNIP3介导保护性线粒体自噬 |
| 4.7 FOXO3a调控替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.7.1 替莫唑胺引起FOXO3a表达升高和核转位 |
| 4.7.2 FOXO3a调控BNIP3介导的线粒体自噬 |
| 4.8 动物实验 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用前 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 中文综述 Sirt6在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
（5）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 蒿甲醚体外逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 蒿甲醚体内逆转结直肠癌放化疗抗性和增敏放化疗的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt/β-catenin信号通路调节肿瘤放化疗抵抗作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 自身炎症性疾病 |
| 1.1.1 自身炎症性疾病概述 |
| 1.1.2 炎性小体激活和白介素依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.4 I型干扰素信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.5 补体途径依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.6 其他自身炎症性疾病 |
| 1.2 程序性细胞死亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡 |
| 1.2.2 程序性坏死 |
| 1.2.3 细胞焦亡 |
| 1.2.4 其他形式的程序性细胞死亡 |
| 1.2.5 程序性细胞死亡与自身炎症性疾病 |
| 1.3 RIPK1及其参与的信号通路 |
| 1.3.1 RIP激酶家族概述 |
| 1.3.2 TNFR1 诱导的炎症和细胞死亡信号通路 |
| 1.3.3 TLR3和TLR4 信号通路 |
| 1.3.4 RLRs信号通路 |
| 1.3.5 RIPK1的促细胞存活功能 |
| 1.3.6 RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 1.3.7 靶向RIPK1的人类疾病研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床样本和资料 |
| 2.1.2 细胞系、质粒和菌株 |
| 2.1.3 实验试剂、耗材及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集和处理 |
| 2.2.2 质粒构建与制备 |
| 2.2.3 细胞的培养、冻存和复苏 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 基因敲除细胞系构建 |
| 2.2.6 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.7 多重液相蛋白定量 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2.9 细胞总RNA提取和反转录 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.12 细胞存活和死亡检测 |
| 2.2.13 流式细胞术 |
| 2.2.14 细胞内活性氧测定 |
| 2.2.15 RIPK1体外切割实验 |
| 2.2.16 转录组测序及数据分析 |
| 2.2.17 基因变异位点分析与预测 |
| 2.2.18 数据采集和统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 自身炎症性疾病患者携带新发的RIPK1切割位点变异 |
| 3.1.1 患者临床特征和遗传分析 |
| 3.1.2 RIPK1第324 位天冬氨酸的保守性和变异致病性分析 |
| 3.1.3 RIPK1第324 位天冬氨酸变异不影响其蛋白稳定性和蛋白互作 |
| 3.1.4 RIPK1第324 位天冬氨酸变异导致其不能被caspase-8 蛋白酶切割 |
| 3.2 携带RIPK1切割位点变异的患者细胞中炎症信号过度激活 |
| 3.2.1 患者体内炎性细胞因子水平升高 |
| 3.2.2 患者PBMCs中细胞因子水平升高 |
| 3.2.3 患者PBMCs中 MAPK和 IL-6/JAK/STAT3 信号通路激活水平升高 |
| 3.2.4 患者PBMCs中炎症信号通路激活水平升高 |
| 3.3 RIPK1切割位点变异促进小鼠MEFs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.3.1 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.3.2 RIPK1切割位点变异促进复合体II的形成 |
| 3.3.3 RIPK1切割位点变异促进细胞死亡依赖其激酶活性 |
| 3.3.4 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞凋亡 |
| 3.3.5 RIPK1切割位点变异促进其他死亡受体诱导的细胞死亡 |
| 3.4 RIPK1切割位点变异促进患者PBMCs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.4.1 患者PBMCs中细胞死亡相关基因的转录水平升高 |
| 3.4.2 RIPK1切割位点变异促进PBMCs中TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.4.3 患者体内细胞坏死激活水平升高 |
| 3.4.4 患者PBMCs中细胞坏死依赖的IL6转录水平升高 |
| 3.5 携带RIPK1切割位点变异的患者fibroblasts抵抗细胞死亡诱导 |
| 3.5.1 患者fibroblasts抵抗TNF诱导的细胞坏死 |
| 3.5.2 患者fibroblasts抵抗细胞坏死的补偿机制 |
| 3.5.3 患者fibroblasts抵抗氧化应激诱导的铁死亡 |
| 3.6 RIPK1切割位点变异促进RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.1 TNF诱导患者PBMCs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.2 TNF诱导小鼠MEFs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.3 携带RIPK1切割位点变异的患者响应IL-6 受体抑制剂治疗 |
| 3.7 RIPK1切割位点变异不促进NF-κB信号通路激活 |
| 3.7.1 切割位点变异减弱了HEK293T细胞中RIPK1促进的NF-κB激活 |
| 3.7.2 RIPK1切割位点变异不影响MEFs中TRAIL诱导的NF-κB激活 |
| 3.7.3 RIPK1切割位点变异不影响fibroblasts中TNF诱导的NF-κB激活 |
| 4 结论 |
| 5 讨论和展望 |
| 5.1 RIPK1变异导致免疫缺陷或者自身炎症性疾病 |
| 5.2 RIPK1变异导致细胞程序性死亡的调节异常 |
| 5.3 RIPK1变异导致炎症信号通路的调节异常 |
| 5.4 针对RIPK1变异患者的临床治疗 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 实验抗体和试剂列表 |
| 7.2 实验耗材和设备列表 |
| 7.3 主要溶液及配制方法 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 答辩决议书 |
（8）下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.2 肿瘤细胞能量代谢改变 |
| 1.3 脂代谢与肿瘤 |
| 1.4 ACACA的一般特点 |
| 1.5 ACACA的功能区划分 |
| 1.6 ACACA的生理功能 |
| 1.6.1 ACACA的生理功能 |
| 1.6.2 ACACB的生理功能 |
| 1.7 ACACA调控肿瘤的分子机制及相关信号通路 |
| 1.7.1 ACACA调控肿瘤的分子机制 |
| 1.7.2 肿瘤中ACACA相关信号通路 |
| 1.8 靶向ACACA基因在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.8.1 TOFA |
| 1.8.2 ND-630 |
| 1.8.3 ND-646 |
| 1.8.4 BAY ACC002 |
| 1.8.5 ACACA活性的新型调节剂 |
| 1.9 ACACA与脂代谢在肿瘤细胞中的调节 |
| 1.9.1 阻止脂肪酸合成 |
| 1.9.2 阻断脂肪酸合成基因的表达 |
| 1.9.3 增加脂肪酸降解 |
| 1.9.4 将脂肪酸转移到储存中或阻止脂肪酸从储存中释放 |
| 1.10 目前ACACA在肿瘤中的研究现状 |
| 1.10.1 ACACA在头颈细胞癌中的研究 |
| 1.10.2 ACACA在非小细胞肺癌中的研究 |
| 1.10.3 ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.4 ACACA与p-ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.5 ACACA在胃癌中的研究 |
| 1.10.6 ACACA在肝癌中的研究 |
| 1.10.7 ACACA在前列腺癌中的研究 |
| 1.11 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 前列腺癌患者组织芯片 |
| 2.1.2 实验细胞株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学实验及评分方法 |
| 2.2.2 细胞培养冻存和复苏 |
| 2.2.3 载体设计和细胞系构建 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.5 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 细胞功能实验 |
| 2.2.7 液相色谱-质谱检测(LC-MS)细胞代谢组学检测 |
| 2.2.8 海马线粒体压力检测 |
| 2.2.9 海马XF-ATP效率实时检测 |
| 2.2.10 海马XF糖酵解速率检测 |
| 2.2.11 荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体示踪 |
| 2.2.12 比色法检测NAD+/NADH水平 |
| 2.2.13 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 |
| 2.2.14 动物实验构建裸鼠肿瘤模型 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 ACACA在前列腺癌组织中上调其表达与TNM分期有关 |
| 3.2 ACACA基因低表达的前列腺癌细胞系(DU145和PC3)构建 |
| 3.3 敲低ACACA基因抑制前列腺癌细胞(DU145和PC3)功能 |
| 3.4 ACACA基因对前列腺癌细胞(DU145和PC3)凋亡的影响 |
| 3.5 抑制ACACA基因影响DU145和PC3细胞ATP水平 |
| 3.6 PC3细胞中敲低ACACA基因后降低L-棕桐酰肉碱和硬脂肉碱水平及代谢途径相关蛋白表达 |
| 3.7 敲低前列腺癌细胞系ACACA基因抑制线粒体-ATP水平和线粒体潜能 |
| 3.8 ACACA能影响线粒体MTDNA及染色情况 |
| 3.9 ACACA基因影响前列腺癌细胞系NAD+/NADH比值和ROS水平 |
| 3.10 敲低ACACA基因后将抑制裸鼠皮下移植瘤形成 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 31种肿瘤简称 |
| 博士研究生期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结直肠癌 |
| 1.2 结直肠癌的发生发展 |
| 1.3 细胞凋亡通路及其调控机制 |
| 1.4 异硫氰酸苯乙酯(PEITC)在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 立项依据与研究内容 |
| 第二章 PEITC对结肠癌发展的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及传代 |
| 2.3.2 MTT检测细胞增殖 |
| 2.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 细胞划痕实验 |
| 2.3.6 Transwell侵袭实验 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PEITC抑制结肠癌细胞增殖 |
| 2.4.2 PEITC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 2.4.3 PEITC抑制结肠癌细胞集落形成 |
| 2.4.4 PEITC抑制结肠癌细胞的迁移 |
| 2.4.5 PEITC抑制结肠癌细胞的侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 PEITC通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 q-PCR |
| 3.3.3 Western blot |
| 3.3.4 OPA1多聚物和可溶性OPA1检测 |
| 3.3.5 用JC-1染色检测线粒体内膜膜电位 |
| 3.3.6 荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PEITC促进结肠癌细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白的活化 |
| 3.4.2 PEITC抑制结肠癌细胞的OPA1多聚物的形成,增加可溶性OPA1表达 |
| 3.4.3 PEITC下调结肠癌细胞的线粒体内膜膜电势 |
| 3.4.4 PEITC上调结肠癌细胞内活性氧(ROS)水平 |
| 3.4.5 PEITC促进结肠癌细胞的BAX/BCL-2比值 |
| 3.4.6 PEITC促进结肠癌细胞H2A.X磷酸化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控结肠癌细胞凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 SiRNA处理细胞 |
| 4.3.3 细胞质组分分离 |
| 4.3.4 Western blot |
| 4.3.5 流式检测细胞凋亡 |
| 4.3.6 免疫共沉淀 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PEITC促进结肠癌细胞SMAC和Cyto-c的表达 |
| 4.4.2 PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 4.4.3 PEITC诱导结肠癌细胞SMAC与Survivin结合 |
| 4.4.4 PEITC促进结肠癌细胞ERK和JNK蛋白的磷酸化 |
| 4.4.5 PEITC通过ERK和JNK通路促进凋亡相关蛋白表达 |
| 4.4.6 PEITC通过ERK和JNK通路促进细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 主要实验仪器 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 SPF级动物饲养 |
| 5.3.3 裸鼠皮下成瘤模型的建立 |
| 5.3.4 实时定量PCR检测mRNA表达 |
| 5.3.5 Western blot检测蛋白表达 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 PEITC抑制结肠癌肿瘤的生长 |
| 5.4.2 PEITC促进结裸鼠结肠癌肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC,抑制Survivin蛋白表达 |
| 5.4.3 PEITC对裸鼠血常规三系细胞数量无影响 |
| 5.4.4 PEITC对裸鼠肝肾功能无影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 讨论和结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 异硫氰酸苯乙酯抗肿瘤凋亡机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
| 致谢 |
（10）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、Inducible resistance to Fas-mediated apoptosis in B cells（论文参考文献）
- [1]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)
- [2]盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究[D]. 韩笑. 延安大学, 2021(09)
- [3]FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究[D]. 何川. 吉林大学, 2021(01)
- [4]Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究[D]. 杨娟. 山东大学, 2021(11)
- [5]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及机制研究[D]. 王思毓. 昆明医科大学, 2021(01)
- [7]RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究[D]. 陶攀峰. 浙江大学, 2021(01)
- [8]下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展[D]. 张慧. 华南理工大学, 2020(05)
- [9]PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估[D]. 黄莉. 南方医科大学, 2020(06)
- [10]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020